袁俊杰，李邁，唐菊艷，袁孟強(qiáng)，李千千，王曉娜，張美溦，陳偉，王曉通

（1.魯東大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264025；2.煙臺(tái)市海洋經(jīng)濟(jì)研究院，山東 煙臺(tái) 264003）

幾丁質(zhì)是自然界中廣泛分布的一類生物大分子，由D-N-乙酰氨基葡萄糖通過β-(1，4)糖苷鍵聚合而成[1]，根據(jù)結(jié)構(gòu)不同，分為α-、β-和γ-幾丁質(zhì)三種類型[2]。幾丁質(zhì)通常不以單體形式存在，其常與蛋白質(zhì)、色素、碳酸鈣等結(jié)合形成復(fù)合物[2]，廣泛存在于軟體動(dòng)物貝殼和內(nèi)骨骼中，在貝殼形成和生物礦化中發(fā)揮重要作用。目前，已從烏賊、珠母貝、芋螺、江珧等軟體動(dòng)物中成功提取并鑒定到幾丁質(zhì)成分[3-7]，研究發(fā)現(xiàn)軟體動(dòng)物幾丁質(zhì)具有良好的生物相容性、抗菌活性[7-8]，在生物醫(yī)學(xué)等方面有重要的應(yīng)用前景。

幾丁質(zhì)作為軟體動(dòng)物貝殼有機(jī)組分之一，與其他蛋白質(zhì)、糖蛋白、多糖等物質(zhì)組成有機(jī)框架，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行生物礦化[9]。其中，幾丁質(zhì)合成酶（chitin synthetase，CHS）、幾丁質(zhì)酶（chitinase，CHIA）、幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白（chitin-binding protein，CBP）等與幾丁質(zhì)框架構(gòu)建相關(guān)的蛋白，均是調(diào)控貝殼形成的重要蛋白，參與調(diào)控生物礦化[10-14]。在長(zhǎng)牡蠣、紫貽貝和大扇貝的貝殼損傷研究中，三種雙殼貝類的貝殼修復(fù)后，外套膜差異表達(dá)蛋白質(zhì)中均鑒定到幾丁質(zhì)結(jié)合相關(guān)的結(jié)構(gòu)域[15]。在紫貽貝貝殼修復(fù)和生物礦化的轉(zhuǎn)錄組分析中，也篩查到大量上調(diào)表達(dá)的幾丁質(zhì)代謝相關(guān)基因，包括幾丁質(zhì)合成酶（CHS）和幾丁質(zhì)酶（CHIA）等[16]。

厚殼貽貝（Mytilus coruscus）是我國(guó)重要的海水養(yǎng)殖貝類，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[17]。根據(jù)已有的研究結(jié)果：厚殼貽貝的貝殼包括珍珠質(zhì)層、肌棱柱層和斜棱柱層[18]，并通過蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定到60 余種殼基質(zhì)蛋白[19]，但幾丁質(zhì)以及幾丁質(zhì)相關(guān)基因在厚殼貽貝貝殼形成中的作用卻鮮有報(bào)道。本研究從形態(tài)和組織學(xué)兩方面詳細(xì)觀察了厚殼貽貝貝殼與外套膜結(jié)構(gòu)，從厚殼貽貝的角質(zhì)層和貝殼中提取并鑒定到幾丁質(zhì)，并構(gòu)建外套膜三褶皺轉(zhuǎn)錄組，根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩查到幾丁質(zhì)合成、代謝、結(jié)合相關(guān)基因，并對(duì)三褶皺差異表達(dá)基因進(jìn)行GO 富集分析，篩查出與幾丁質(zhì)功能相關(guān)的GO term。本研究有助于了解厚殼貽貝貝殼中有機(jī)骨架的成分，為幾丁質(zhì)在貝殼形成和生物礦化中的作用奠定研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)樣品

實(shí)驗(yàn)所用厚殼貽貝材料購(gòu)于江蘇省連云港市，實(shí)驗(yàn)前在海水養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)室內(nèi)充氧暫養(yǎng)，暫養(yǎng)海水水溫20 ℃，鹽度25‰，養(yǎng)殖期間飼喂螺旋藻粉，每天換水一次。

1.2 貝殼及外套膜的形態(tài)及組織學(xué)觀察

將腹緣端貝殼切下部分后，露出白色貝殼，并保留貝殼邊緣的角質(zhì)層，觀察貝殼、角質(zhì)層、外套膜三者生理學(xué)結(jié)構(gòu)。將貝殼沿閉殼肌斷開，取腹緣端外套膜邊緣組織，經(jīng)固定、脫水、透明、包埋后，在切片機(jī)（Leica，RM2255）上切成6 μm厚的切片。切片經(jīng)脫蠟、復(fù)水后，用蘇木精-伊紅染液（南京建成，D006）染色，后經(jīng)脫水、透明，用中性樹脂封片。最后，在顯微鏡（Nikon，CI-L）下觀察切片。

1.3 貝殼中幾丁質(zhì)的提取

將厚殼貽貝貝殼刷洗干凈后，將表面的角質(zhì)層剝離，烘干后研磨成粉末，放入2%鹽酸浸泡30 min，用蒸餾水充分漂洗，高速離心分離得到不溶物并吸干水分。向不溶物加入2 mol/L的NaOH溶液，室溫震蕩24 h，之后高速離心30 min，蒸餾水清洗至中性，過濾得到棕褐色不溶物。H2O2漂白后，蒸餾水漂洗。60 ℃烘干，得到固體粉末。

將角質(zhì)層剝離后的貝殼清洗并烘干，也研磨成粉末，并放入2%鹽酸浸泡脫鈣，漂洗至pH 為中性后，高速離心，向沉淀物加入2 mol/L 的NaOH 溶液，室溫震蕩24 h。高速離心、洗滌、濾紙過濾，得到脫蛋白不溶物。脫色、漂洗、烘干，得到粉末狀固體。

1.4 幾丁質(zhì)提取物的傅里葉紅外光譜鑒定

各取0.01 g 幾丁質(zhì)提取物，在NICOLET IS50型傅里葉紅外儀器下，經(jīng)32次全反射掃描在400～4 000 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)測(cè)得吸收峰，使用OMNIC軟件繪制吸收峰圖。

1.5 基于外套膜轉(zhuǎn)錄組的幾丁質(zhì)相關(guān)基因鑒定

隨機(jī)選取3 只厚殼貽貝，分別采集外套膜邊緣的外褶皺、中褶皺、內(nèi)褶皺組織，液氮速凍，放入超低溫冰箱保存。提取總RNA 后，抽提mRNA 構(gòu)建RNA-seq 文庫并測(cè)序。原始數(shù)據(jù)經(jīng)質(zhì)量過濾后，通過Trinity 軟件進(jìn)行De novo拼接，對(duì)組裝好的Unigene進(jìn)行常見功能數(shù)據(jù)庫注釋，根據(jù)功能注釋和BLAST 比對(duì)，篩選出幾丁質(zhì)合成、代謝、結(jié)合相關(guān)的基因，進(jìn)行表達(dá)量（FPKM）分析，并對(duì)其蛋白序列進(jìn)行功能域預(yù)測(cè)（http://smart.embl-heidelberg.de/）。對(duì)內(nèi)、中、外褶皺間差異表達(dá)基因進(jìn)行GO富集分析，篩查出與幾丁質(zhì)合成、代謝、結(jié)合等功能相關(guān)的GO term。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 厚殼貽貝貝殼及外套膜的組織特征

通過形態(tài)觀察，厚殼貽貝貝殼主要由角質(zhì)層（貝殼硬質(zhì)蛋白）和貝殼層（碳酸鈣晶體）兩部分組成（圖1（a）），而外套膜邊緣部分主要分為三個(gè)褶皺（圖1（b）、（c）），外褶皺（of）、中褶皺（mf）以及內(nèi)褶皺（if），其中外褶皺形態(tài)在三個(gè)褶皺中最小，其邊緣緊緊貼附在貽貝的貝殼邊緣，內(nèi)褶皺靠近其他軟組織部，且是三褶皺中形態(tài)最大的，其上分布大量外套膜觸手，而中褶皺則位于內(nèi)、外褶皺中間，組織大小也介于二者之間。通過石蠟切片進(jìn)一步觀察，中褶皺又分為一大一小2 層褶皺，靠近外褶皺一側(cè)有1 個(gè)非常小的褶皺，與外褶皺共同形成一個(gè)溝狀結(jié)構(gòu)，此處可分泌貝殼的角質(zhì)層膜（圖1（c）、（d1））。此外，根據(jù)組織切片觀察，發(fā)現(xiàn)三個(gè)褶皺的上皮細(xì)胞類型也有較大差別：殼膜溝處的外褶皺具有單層柱狀上皮細(xì)胞，其形態(tài)細(xì)長(zhǎng)，細(xì)胞核細(xì)長(zhǎng)位于基部，細(xì)胞質(zhì)中存在少量褐色的色素（圖1（d1））；而靠近殼膜一側(cè)的中褶皺（mf1 和mf2）其細(xì)胞形態(tài)為矮柱狀，細(xì)胞核橢圓形位于基部，這些上皮細(xì)胞中并未觀察到棕色的色素（圖1（d1）），而在遠(yuǎn)離殼膜一側(cè)的中褶皺上皮細(xì)胞中則可觀察到大量棕色色素（圖1（d2））；內(nèi)褶皺也具有單層柱狀上皮，這些上皮細(xì)胞的核細(xì)長(zhǎng)位于細(xì)胞基部，在胞質(zhì)中可觀察到大量深棕色的色素（圖1（d3）、（d4））。

圖1 厚殼貽貝貝殼及外套膜的形態(tài)及組織學(xué)觀察

2.2 貝殼幾丁質(zhì)提取及FTIR特征

從厚殼貽貝角質(zhì)層粉末（圖2（a））中，提取并鑒定到幾丁質(zhì)（圖2（b））：在 3 272 cm-1處有1個(gè)明顯的N-H 伸縮振動(dòng)吸收峰，在2 800～3 000 cm-1處，有兩個(gè)C-H 伸縮振動(dòng)吸收峰，在1 626 cm-1處有1 個(gè)較大的酰胺I 帶吸收峰，在1 516 cm-1處出現(xiàn)1個(gè)較大的酰胺Ⅱ帶吸收峰[6]，在1 234 cm-1處出現(xiàn)1 個(gè)較小的酰胺Ⅲ帶吸收峰。此外，在1 430～1 445 cm-1具有CH2彎曲和CH3變形的特征吸收峰，在1 370～1 390 cm-1具有CH 彎曲與對(duì)稱CH3變形而出現(xiàn)特征吸收峰[20]。從貝殼粉末（圖2（c））中，也得到幾丁質(zhì)提取物，并鑒定到幾丁質(zhì)特征吸收峰（圖2（d））：在3 269 cm-1處具有N-H 伸縮振動(dòng)吸收峰，在2 800～3 000 cm-1處，也出現(xiàn)兩個(gè)C-H伸縮振動(dòng)吸收峰，在1 623 cm-1處出現(xiàn)一個(gè)酰胺I 帶吸收峰，在1 513 cm-1處有1 個(gè)酰胺Ⅱ帶吸收峰，并在1 560 cm-1處還出現(xiàn)一個(gè)較小的酰胺Ⅱ帶吸收峰，在1 232 cm-1處出現(xiàn)1 個(gè)較小的酰胺Ⅲ帶吸收峰。此外，在1 430～1 445 cm-1也具有CH2彎曲和CH3變形的特征吸收峰，在1 370～1 390 cm-1處也具有CH 彎曲與對(duì)稱CH3變形而出現(xiàn)特征吸收峰。

圖2 厚殼貽貝角質(zhì)層和貝殼中幾丁質(zhì)的提取及鑒定

2.3 幾丁質(zhì)相關(guān)基因的篩查及表達(dá)分析

根據(jù)厚殼貽貝外套膜三褶皺的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩查出34 個(gè)幾丁質(zhì)相關(guān)基因，其中幾丁質(zhì)合成相關(guān)的基因有7 個(gè)（圖3（a）），幾丁質(zhì)降解相關(guān)的基因有16 個(gè)（圖3（b）），幾丁質(zhì)結(jié)合相關(guān)基因有11個(gè)（圖3（c））。根據(jù)功能域預(yù)測(cè)，7 個(gè)幾丁質(zhì)合成酶基因（CHS）均具有chitn_synth_2 結(jié)構(gòu)域。而篩查到的幾丁質(zhì)酶主要包括18家族和20家族糖苷水解酶兩類，在16 個(gè)幾丁質(zhì)酶中，有10 個(gè)具有Glyco_18 結(jié)構(gòu)域（18 家族糖苷水解酶），其余6 個(gè)具有Glyco_hydro_20 結(jié)構(gòu)域（20 家族糖苷水解酶）。其中McCHIA1、McCHIA4、chitotriosidase-1-like 還具有2 或3 個(gè)幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域（ChtBD2）；還 有4 個(gè)β 氨 基 己 糖 苷 酶（Bhexosaminidase）除了具有Glyco_hydro_20 結(jié)構(gòu)域外，還具有一個(gè)特殊的碳水化合物結(jié)合域CHB_HEX結(jié)構(gòu)域。厚殼貽貝11個(gè)幾丁質(zhì)結(jié)合相關(guān)的基因，均具有1到5個(gè)ChtBD2結(jié)構(gòu)域（圖3（c）），其中，Coadhesin 除了ChtBD2 結(jié)構(gòu)域，還具備3 個(gè)血小板反應(yīng)蛋白TSP1 結(jié)構(gòu)域；Chitin binding/VWA1、Chitin binding/VWA2 還各自具備1 個(gè)與幾丁質(zhì)結(jié)合相關(guān)的VWA 結(jié)構(gòu)域；mucin-2-like 還具有1 個(gè)層粘連蛋白LamG 結(jié)構(gòu)域；McCBP1 還具備1個(gè)凝血因子5/8 C-末端FA58C結(jié)構(gòu)域。

圖3 厚殼貽貝幾丁質(zhì)相關(guān)基因的結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)

為進(jìn)一步研究外套膜三褶皺與幾丁質(zhì)相關(guān)功能的關(guān)系，對(duì)篩查到的幾丁質(zhì)相關(guān)基因進(jìn)行表達(dá)量分析（圖4），并在三褶皺差異表達(dá)基因的GO富集結(jié)果中篩查幾丁質(zhì)相關(guān)的GO term（圖5）。根據(jù)三褶皺中幾丁質(zhì)相關(guān)基因的表達(dá)量分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)幾丁質(zhì)合成相關(guān)基因主要在內(nèi)、中褶皺高表達(dá)；而幾丁質(zhì)結(jié)合相關(guān)基因的表達(dá)模式則與之相反，主要在外褶皺高表達(dá)；篩查到的16 個(gè)幾丁質(zhì)酶基因，則主要呈現(xiàn)兩種表達(dá)模式：一類是在外褶皺中高表達(dá)，一類在內(nèi)、中褶皺中高表達(dá)。其中，在外褶皺中高表達(dá)的幾丁質(zhì)酶為殼三糖苷酶（McCHIA），屬于18 家族糖苷水解酶；而在內(nèi)、中高表達(dá)的幾丁質(zhì)酶多為二-N-乙酰殼二糖酶（McCTBS）、β 氨基己糖苷酶（B-hexosaminidase）等。此外，從外套膜三褶皺差異基因的GO富集分析結(jié)果中，篩查出多個(gè)幾丁質(zhì)相關(guān)的GO term（圖5），發(fā)現(xiàn)內(nèi)、中褶皺的差異高表達(dá)基因主要富集到幾丁質(zhì)生物合成相關(guān)的GO term，而外褶皺則主要富集到幾丁質(zhì)結(jié)合、代謝、角質(zhì)層色素沉著相關(guān)的GO term。

圖4 厚殼貽貝幾丁質(zhì)相關(guān)基因在外套膜三褶皺中的表達(dá)分析

圖5 厚殼貽貝外套膜三褶皺中高表達(dá)基因的GO富集分析

3 討論

在自然界中，碳酸鈣晶體會(huì)嵌入以幾丁質(zhì)為主成分的有機(jī)基框架中進(jìn)行生物礦化，因此，本研究在提取幾丁質(zhì)時(shí)，進(jìn)行了脫鈣、脫蛋白等過程。根據(jù)FTIR 結(jié)果，本研究成功在厚殼貽貝的角質(zhì)層和貝殼層提取到幾丁質(zhì)，二者分別在3 272 cm-1和3 269 cm-1處均存在單一吸收峰，這表明貽貝角質(zhì)層和貝殼層中提取的幾丁質(zhì)均為β-幾丁質(zhì)而非α-幾丁質(zhì)[3-4,21]。但由于貝殼層與角質(zhì)層中有機(jī)質(zhì)和礦物質(zhì)的構(gòu)成存在差異，兩種幾丁質(zhì)提取物的FTIR 吸收峰發(fā)生了一定程度的左右平移。此外，貝殼層中幾丁質(zhì)提取物在1 560 cm-1處還多了一個(gè)較小吸收峰（圖2（d），藍(lán)色箭頭所示），二者在吸收峰的大小上，角質(zhì)層提取物在1 513～ 1 626 cm-1處的吸收峰也大于貝殼層提取物，這表明，角質(zhì)層中幾丁質(zhì)含量要更高于貝殼層中幾丁質(zhì)含量，且所含其他雜質(zhì)也較少。幾丁質(zhì)作為貝殼有機(jī)基質(zhì)的重要組成，在生物礦化中具有關(guān)鍵調(diào)控作用，在牡蠣、珠母貝、芋螺等貝類貝殼中均鑒定到幾丁質(zhì)的成分[5-7,21]，且這些貝類貝殼中的幾丁質(zhì)提取物均是具有β-幾丁質(zhì)的特征吸收峰。

除幾丁質(zhì)外，貝殼基質(zhì)蛋白也是貝類貝殼有機(jī)基質(zhì)的重要組成，此前，在長(zhǎng)牡蠣[22]、貽貝[19]、海螂[23]、櫛江珧[24]、珠母貝[25]、櫛孔扇貝[26]等雙殼貝類的貝殼基質(zhì)蛋白研究中，均鑒定到含有幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)以及幾丁質(zhì)代謝相關(guān)蛋白。在紫貽貝的研究中，也發(fā)現(xiàn)幾丁質(zhì)在幼蟲外殼的形成和功能中發(fā)揮著重要作用[25]，在翡翠貽貝貝殼蛋白質(zhì)組分析中，還發(fā)現(xiàn)大量具有幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)[27]。因此，探究幾丁質(zhì)相關(guān)的殼基質(zhì)蛋白有助于更好地了解厚殼貽貝貝殼有機(jī)骨架的形成。本研究利用外套膜邊緣三褶皺的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩查出厚殼貽貝中幾丁質(zhì)合成、代謝、結(jié)合相關(guān)基因。在篩查到的三類幾丁質(zhì)相關(guān)基因中，幾丁質(zhì)酶數(shù)量最多。自然界中，幾丁質(zhì)酶主要包括幾類糖苷水解酶（18、19、20、23、48 家族），而在厚殼貽貝中鑒定到了18 家族和20 家族兩類糖苷水解酶。結(jié)合這三類幾丁質(zhì)相關(guān)基因在三褶皺中的表達(dá)量分析，發(fā)現(xiàn)這些幾丁質(zhì)酶在三個(gè)褶皺中的表達(dá)模式有所區(qū)別：β 氨基己糖苷酶、二-N-乙酰殼二糖酶等幾丁質(zhì)酶基因主要在內(nèi)、中褶皺表達(dá)；而殼三糖苷酶類的幾丁質(zhì)酶主要在外褶皺表達(dá)。此外，根據(jù)表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)幾丁質(zhì)合成酶基因主要在內(nèi)、中褶皺高表達(dá)，而幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白相關(guān)基因的表達(dá)模式卻與之相反，主要在外褶皺高表達(dá)。這表明外套膜三層褶皺在幾丁質(zhì)相關(guān)的功能上可能存在差異。

此前，在珠母貝[12]、三角帆蚌[14]、長(zhǎng)牡蠣[21]等雙殼貝類的研究發(fā)現(xiàn)幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白能與幾丁質(zhì)和碳酸鈣結(jié)合，并指導(dǎo)碳酸鈣晶體的結(jié)晶并參與調(diào)控貝殼的形成。在長(zhǎng)牡蠣、紫貽貝和大扇貝的貝殼損傷研究中，貝殼修復(fù)后外套膜差異表達(dá)的蛋白質(zhì)中，均發(fā)現(xiàn)具有幾丁質(zhì)結(jié)合相關(guān)的VWA 結(jié)構(gòu)域、LamG 結(jié)構(gòu)域[15-16]，這些研究表明具有幾丁質(zhì)結(jié)合相關(guān)的VWA 結(jié)構(gòu)域、LamG 結(jié)構(gòu)域蛋白能夠參與貝殼損傷后的修復(fù)。結(jié)合在厚殼貽貝中的研究結(jié)果，幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白主要在厚殼貽貝在外褶皺高表達(dá)，在這些外褶皺高表達(dá)蛋白中也發(fā)現(xiàn)幾丁質(zhì)結(jié)合相關(guān)的VWA 結(jié)構(gòu)域、LamG 結(jié)構(gòu)域的存在，由此推測(cè)，厚殼貽貝可能通過外褶皺調(diào)控幾丁質(zhì)框架的形成，參與貝殼的形成與修復(fù)。此外，長(zhǎng)牡蠣殼基質(zhì)蛋白的研究中也鑒定到幾丁質(zhì)酶和幾丁質(zhì)合成酶[28]，在酸化海水處理的長(zhǎng)牡蠣中，幾丁質(zhì)合成酶表達(dá)水平被顯著抑制，從而抑制幾丁質(zhì)的生物合成來抑制牡蠣鈣化殼的形成[29]。在厚殼貽貝中，幾丁質(zhì)合成酶主要在內(nèi)、中褶皺中高表達(dá)，貽貝可能通過內(nèi)、中褶皺來調(diào)控幾丁質(zhì)合成，從而影響貝殼的形成。在貝類幾丁質(zhì)酶的研究中，珠母貝的幾丁質(zhì)酶能參與貝殼的形成[30]；在靜水椎實(shí)螺中，也發(fā)現(xiàn)幾丁質(zhì)酶會(huì)影響殼的形成[31]。在厚殼貽貝中，不同類型的幾丁質(zhì)酶基因在不同褶皺高表達(dá)，三個(gè)褶皺可能都能通過幾丁質(zhì)的代謝來影響殼的形成，但具體的作用方式可能不同，還有待深入研究。最后，外套膜三褶皺GO功能富集分析的結(jié)果也表明內(nèi)、中褶皺主要參與調(diào)控幾丁質(zhì)的生物合成過程，而外褶皺可能主要參與調(diào)控角質(zhì)層殼膜的形成。此外，在外褶皺中還富集到“含幾丁質(zhì)角質(zhì)層色素沉著”的GO term，結(jié)合組織切片觀察結(jié)果，殼膜溝處的外褶皺上皮細(xì)胞中能觀察到棕色色素，而此處的中褶皺上皮細(xì)胞卻未觀察到色素，推測(cè)殼膜的色素沉著可能主要由外褶皺來調(diào)控。

4 結(jié)論

根據(jù)貝殼和外套膜邊緣的形態(tài)觀察，本研究發(fā)現(xiàn)厚殼貽貝外套膜邊緣具有1 個(gè)較大的內(nèi)褶皺及較小的中、外褶皺。在三褶皺中，外褶皺最小，其牢固貼附于殼上，外褶皺和中褶皺之間產(chǎn)生角質(zhì)層殼膜并延伸包裹在貝殼表面，根據(jù)組織切片觀察，三個(gè)褶皺的上皮細(xì)胞形態(tài)也存在明顯不同。此外，本研究還從厚殼貽貝的角質(zhì)層和貝殼中提取并鑒定到幾丁質(zhì)成分，并根據(jù)三褶皺轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)鑒定到幾丁質(zhì)合成酶（CHS）、幾丁質(zhì)酶（CHIA）和幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白（CBP）三類幾丁質(zhì)相關(guān)基因。根據(jù)功能域和表達(dá)量分析，發(fā)現(xiàn)幾丁質(zhì)合成酶基因、β氨基己糖苷酶、二-N-乙酰殼二糖酶等幾丁質(zhì)酶基因主要在內(nèi)、中褶皺高表達(dá)，而與之相反的，幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白基因和殼三糖苷酶類的幾丁質(zhì)酶基因主要在外褶皺中高表達(dá)。三褶皺間的GO富集分析也表明厚殼貽貝的內(nèi)、中褶皺可能主要參與調(diào)控幾丁質(zhì)的生物合成，而外褶皺則主要參與調(diào)控幾丁質(zhì)結(jié)合、代謝和角質(zhì)層色素沉著等過程。綜上所述，厚殼貽貝外套膜三褶皺不僅在形態(tài)結(jié)構(gòu)上存在顯著差異，其在與幾丁質(zhì)合成、代謝、結(jié)合等功能方面也存在差異，其中，外褶皺可能在厚殼貽貝的幾丁質(zhì)骨架形成和色素沉著中發(fā)揮更重要的作用。本研究有助于了解厚殼貽貝貝殼有機(jī)骨架的幾丁質(zhì)成分和幾丁質(zhì)合成及代謝等相關(guān)基因，為厚殼貽貝貝殼形成和生物礦化的研究奠定了基礎(chǔ)。