黃瑾 韓文卿 李鑫 陳驍俊

miRNA 是一類由約22 個(gè)核苷酸組成的內(nèi)源性非編碼小RNA，可通過調(diào)控mRNA 轉(zhuǎn)錄后修飾，參與多種生理和病理過程。有研究認(rèn)為miR-148a-3p可參與調(diào)節(jié)血管生成，但尚未形成定論。有文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iR-148a-3p 可 通 過 調(diào) 節(jié)DNMT1[1-2]、ERBB3[3]、IGF-IR、IRS1[2]、NRP1[4]、WNT1[5]、PKM2[6]、FGF2[7]等靶基因抑制血管生成；也有文獻(xiàn)報(bào)道其可通過調(diào)控FIH1[8]、KLF6[9]等靶基因促進(jìn)血管生成。

前述miR-148a-3p 調(diào)控血管生成的相關(guān)研究大多基于體外實(shí)驗(yàn)，缺乏體內(nèi)真實(shí)微環(huán)境下的研究結(jié)果。本研究擬利用miR-148 基因敲除小鼠，結(jié)合miRNA mimic 轉(zhuǎn)染，從敲除和過表達(dá)兩方面明晰miR-148a-3p 對血管生成的作用。

1 材料與方法

1.1 miR-148a 基因敲除小鼠的構(gòu)建及基因型鑒定

本研究所使用的miR-148a 基因敲除小鼠由江蘇集萃藥康生物科技股份有限公司構(gòu)建，在上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院動(dòng)物房飼養(yǎng)。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作均經(jīng)上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理審批編號：SH9H-2023-A776-1）。繁育過程均采用雜合子小鼠，雌雄比例為1 : 2，取耳朵或尾巴部分組織行基因型鑒定，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)選取相應(yīng)周齡的敲除型（Knock-out，KO）、雜合型（Heterozygous，HE）和野生型（Wild type，WT）同窩小鼠開展動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。

1.2 冷凍切片及免疫熒光染色

取4 周齡雄性小鼠，安樂死后取材，實(shí)驗(yàn)方案參考文獻(xiàn)[10]。取新鮮脛骨樣本，4%多聚甲醛溶液固定4 h、10% EDTA 溶液脫鈣24 h，冰凍切片保護(hù)液（20%蔗糖和2%聚乙烯吡咯烷酮溶液）浸潤24 h 后，加入明膠完成包埋。切片完成后，依次完成透膜、封閉、一抗孵育（CD31，R&D Systems，Abcam， UK）、二抗孵育、DAPI 染色等步驟完成免疫熒光染色，并在熒光顯微鏡下完成圖像拍攝。

1.3 跖骨離體培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

在解剖顯微鏡下，解剖分離E17.5 d 胎鼠的跖骨行離體培養(yǎng)，剩余組織取樣行基因型鑒定，以明確相應(yīng)跖骨的基因型。將單個(gè)跖骨放置在24 孔板的1個(gè)孔內(nèi)，并加入200 μL完全培養(yǎng)基，在5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。每隔72 h 更換300 μL 完全培養(yǎng)基。第16 天時(shí)，固定、透膜、封閉、CD31 一抗孵育和二抗孵育，在熒光顯微鏡下直觀地觀察和評估出芽式血管生成的情況。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)

miR-148a-3p 在人類和小鼠中高度保守，故本研究后續(xù)借助人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系（Human umbilical vein endothelial cells，hUVECs）在體外實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步探究miR-148a-3p 在血管生成中的作用。hUVECs 用含5%胎牛血清（FBS）、1%內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（ECGS）、1%雙抗（P/S）的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基（ECM），在5%CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

采用miR-148a-3p Mimic 試劑（廣州銳博生物科技有限公司）轉(zhuǎn)染hUVECs，過表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞miR-148a-3p。轉(zhuǎn)染方法參照試劑使用說明書。首先將轉(zhuǎn)染試劑與miR-148a-3p Mimic 試劑混合，室溫靜置20 min 后，轉(zhuǎn)染細(xì)胞6 h，之后將轉(zhuǎn)染混合物更換為完全培養(yǎng)基。在轉(zhuǎn)染后48 h，提取RNA做相關(guān)檢測。

1.6 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

采用CCK8 細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（同仁化學(xué)，日本）檢測miR-148a 過表達(dá)在細(xì)胞增殖中的作用。將hUVECs 細(xì)胞以每孔3×103個(gè)的密度接種于96孔板，在不同的時(shí)間點(diǎn)（分別為種板后24 h、48 h、72 h 和96 h）將培養(yǎng)基更換為含10 μL CCK8 試劑的100 μL 完全培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育2 h，之后使用Tecan 多功能分光光度計(jì)測量其在450 nm處的吸光度，并采用GraphPad Prism 8 計(jì)算細(xì)胞增殖曲線。

1.7 Matrigel 管腔形成實(shí)驗(yàn)

以 每 孔50 μL 的 劑 量，將Matrigel 基 質(zhì) 膠（Corning?，BD，美國）添加到預(yù)冷卻的96 孔板中，室溫水平放置約10 min 后，37 ℃培養(yǎng)箱中再放置30 min，使其完全凝固。在等待基質(zhì)膠凝固時(shí)，進(jìn)行內(nèi)皮細(xì)胞消化、重懸和計(jì)數(shù)，消化后采用無血清無雙抗的雙無ECM 培養(yǎng)基重懸，并以1.5×104個(gè)/孔的密度接種到Matrigel 基質(zhì)膠上，孵育4 h后拍攝圖像。采用Image J 軟件Angiogenesis Analyzer 插件的“Analyze hUVEC Phase Contrast”功能作定量分析。

1.8 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)

在每個(gè)小室（8 μm，Millipore）中加入100 μL細(xì)胞懸液（細(xì)胞密度為5×105個(gè)細(xì)胞/mL，重懸溶液為無血清無雙抗的ECM 培養(yǎng)基），在24 孔板中加入600 μL 完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)18 h 后，4%多聚甲醛固定，結(jié)晶紫溶液染色。用棉簽輕輕拭去殘留在上室的細(xì)胞后，顯微鏡下拍攝圖像。每個(gè)小室拍攝上下左右中5 個(gè)視野的圖像，用Image J完成細(xì)胞計(jì)數(shù)，取5 個(gè)視野的計(jì)數(shù)平均值作為該小室的遷移細(xì)胞數(shù)。

1.9 F-actin 肌動(dòng)蛋白顯像實(shí)驗(yàn)

將hUVECs 細(xì)胞懸液以無血清無雙抗的ECM培養(yǎng)基重懸，以1×104個(gè)細(xì)胞/皿的密度接種于共聚焦培養(yǎng)皿，37 ℃培養(yǎng)箱孵育4 h 后，在室溫下用攜帶有熒光標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽（phalloidin-AF594）和DAPI 染色1 h，后在共聚焦顯微鏡下拍攝熒光圖像。

1.10 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）

采用Multisource total RNA Extract Reagent（Catalog#11818KD1，Axygen，美國）提取細(xì)胞總RNA，使用Nanodrop ND-1000（Thermo Fisher，美國）檢測RNA 純度和濃度后，使用逆轉(zhuǎn)錄酶和oligo（dT）引物（Catalog#RR036，TaKaRa，日本）從500 ng 總RNA 中逆轉(zhuǎn)錄出單鏈cDNA。使用PrimeScript ?RT-PCR 試劑盒（Catalog#RR420，TaKaRa，日本）進(jìn)行實(shí)時(shí)qPCR 擴(kuò)增。所有PCR 操作均在Quant-Studio 6 Flex（Applied Biosystems，美國）中進(jìn)行，使用2-ΔΔCt方法進(jìn)行分析。

1.11 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 miR-148a 敲除可促進(jìn)血管生成

胎鼠跖骨離體培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)是一種具有代表性的研究血管生成的方法，即通過離體培養(yǎng)胎鼠跖骨，觀察其萌出的血管結(jié)構(gòu)以評估出芽式血管生成的情況[11]。經(jīng)過16 d 的離體培養(yǎng)，相較野生型跖骨，miR-148a 敲除胎鼠的跖骨可形成明顯更多的CD31陽性的血管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，但血管管徑偏細(xì)，且網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)略顯雜亂（圖1）。

圖1 離體培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)顯示敲除型胎鼠（KO）組跖骨離體培養(yǎng)后CD31 陽性的血管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)明顯多于野生型胎鼠（WT）組（比例尺=10 μm）Fig.1 The metatarsal experiment showed more CD31-positive structures in the knock-out (KO) group than the wild-type (WT)ones (Scale bar=10 μm)

2.2 miR-148a 基因敲除小鼠H 型血管形成異常

文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iR-148a 基因敲除小鼠存在骨骼發(fā)育異常，骨量上升[12]。H 型血管（CD31highEMCNhigh）是一種偶聯(lián)成骨和成血管的特殊內(nèi)皮細(xì)胞亞型，主要分布于干骺端和骨內(nèi)膜區(qū)域。因此，本研究通過冰凍切片，對miR-148a 基因敲除小鼠的H 型血管分布情況進(jìn)行了探究，發(fā)現(xiàn)與同窩雜合小鼠相比（圖2），miR-148a 基因敲除小鼠H 型血管存在分布異常。在雜合小鼠中，H 型血管面積占比平均約為10.82%，而miR-148a 敲除小鼠中，H型血管的面積占比平均值僅為7.478%，兩者具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.0273）。此外，全敲小鼠中H 型血管的平均直徑從雜合型小鼠的17.36 μm 下降到14.89 μm（P=0.0242）。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

圖2 miR-148a 基因敲除小鼠H 型血管分布異常Fig.2 miR-148a knock-out mice demonstrated abnormal type H vessels

2.3 miR-148a 過表達(dá)可抑制血管生成

由于miR-148a-3p 在人類和小鼠間高度保守，我們借助人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系（hUVECs），在體外實(shí)驗(yàn)中探索miR-148a-3p 對血管生成各個(gè)環(huán)節(jié)的作用。我們先通過miR-148a-3p Mimic 轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)過表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的miR-148a-3p。經(jīng)qPCR 驗(yàn)證 發(fā) 現(xiàn)，在hUVECs 中 轉(zhuǎn) 染miR-148a-3p Mimic后，miR-148a-3p 的表達(dá)水平可升高至原表達(dá)水平的1 000 多倍（圖3A）。雖然細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)的結(jié)果提示miR-148a-3p 過表達(dá)并不影響內(nèi)皮細(xì)胞的增殖能力（圖3B），但對其出芽和遷移能力都存在不同程度的抑制效果。與陰性對照組（NC）相比，miR-148a-3p 過表達(dá)組（Mimic）內(nèi)皮細(xì)胞的管腔形成能力受損。其中，總分支長度下降了約15%，兩組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.0110，圖3C）。與陰性對照組（NC）相比，miR-148a-3p 過表達(dá)組（Mimic）內(nèi)皮細(xì)胞的遷移能力下降了約66.92%，兩者具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.0083，圖3D）。通過鬼筆環(huán)肽顯像絲狀肌動(dòng)蛋白（F-actin），可以較為直觀地看到miR-148a-3p 過表達(dá)后，內(nèi)皮細(xì)胞整體形態(tài)更為圓滑，板狀偽足數(shù)目明顯減少（圖3E）。之后，我們又通過qPCR 檢測了血管生成相關(guān)的幾個(gè)特異性基因mRNA 表達(dá)水平改變情況。在miR-148a-3p 過表達(dá)的條件下，各相關(guān)標(biāo)志基因（VEGF、bFGF、HIFα、VWF、VEGFR1、VEGFR2、MMP2和MMP9）的表達(dá)水平均呈現(xiàn)不同程度的顯著下調(diào)（圖3F）。

圖3 miR-148a-3p 過表達(dá)可抑制血管生成Fig.3 miR-148a-3p suppressed angiogenesis in-vitro

3 討論

本研究通過miR-148a 敲除小鼠的組織切片和免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)、跖骨離體培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，以及miR-148a-3p 過表達(dá)的一系列體外實(shí)驗(yàn)（細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、管腔形成實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞出芽實(shí)驗(yàn)和血管生成特異性標(biāo)志基因mRNA 表達(dá)水平檢測），證實(shí)了miR-148a-3p 可抑制血管生成。

在骨塑建/骨重塑過程中需要充足的血液供應(yīng)。文獻(xiàn)報(bào)道，miR-148a 基因敲除小鼠具有骨量上升的長骨表型[12]，miR-148a-3p 可通過調(diào)節(jié)NRP1[13]或Kdm6b[14]等下游靶基因抑制成骨分化。H 型血管（CD31highEmcnhigh）是骨骼組織中一種特殊的內(nèi)皮細(xì)胞亞型，能夠偶聯(lián)骨內(nèi)血管生成和成骨生成的生物學(xué)過程。H 型血管在骨塑建和骨重塑過程中有著至關(guān)重要的作用，生長發(fā)育階段破壞H 型血管形成可導(dǎo)致骨骼發(fā)育不良，而促進(jìn)H 型血管形成則有利于骨創(chuàng)傷愈合和牽張成骨等。因此，miR-148a 基因敲除小鼠中H 型血管的分布異常也從另一個(gè)角度佐證了其成骨生成能力的增強(qiáng)。

關(guān)于miR-148a-3p 影響血管生成的機(jī)制研究不少，但已報(bào)道的下游靶基因眾多，趨勢也不一致。已知miR-148a-3p 可通過調(diào)節(jié)DNMT1[1-2]、ERBB3[3]、IGF-IR、IRS1[2]、NRP1[4]、WNT1[5]、PKM2[6]、FGF2[7]等靶基因抑制血管生成；也可通過調(diào)控FIH1[8]、KLF6[9]等靶基因促進(jìn)血管生成。由于miRNA 的表達(dá)模式具有位相性和時(shí)序性[15]，在不同實(shí)驗(yàn)條件下，同一種miRNA 的研究可能會(huì)得到截然不同的結(jié)果。

上述miR-148a-3p 調(diào)控血管生成的機(jī)制研究多基于體外實(shí)驗(yàn)，缺乏體內(nèi)真實(shí)微環(huán)境下的研究結(jié)果。骨內(nèi)皮細(xì)胞有著不同于其他器官內(nèi)皮細(xì)胞的獨(dú)特生物學(xué)特征[16]，又因其占比較?。ü莾?nèi)皮細(xì)胞僅占整個(gè)骨組織細(xì)胞總量的約2%），下一階段，我們擬基于體內(nèi)真實(shí)環(huán)境，提取原代骨血管內(nèi)皮細(xì)胞，借助多組學(xué)研究，進(jìn)一步探索miR-148a-3p 調(diào)控骨內(nèi)血管生成的分子機(jī)制。

4 結(jié)論

miR-148a 敲除可促進(jìn)血管生成。miR-148a 基因敲除小鼠存在H 型血管分布異常。miR-148a-3p 過表達(dá)可抑制血管生成，包括細(xì)胞出芽、遷移、管腔形成等生物學(xué)過程。