林崴儀 戈成旺 唐梟偉 蔡薇 宋輝 李磊 沈干

【提要】 慢性創(chuàng)面發(fā)病率高，創(chuàng)面愈合困難，通常需要綜合治療?，F(xiàn)有的研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用部分益生菌及其代謝產(chǎn)物可以抗感染、促進(jìn)創(chuàng)面細(xì)胞增殖、調(diào)控炎癥，從而促進(jìn)慢性創(chuàng)面的愈合，證明了益生菌應(yīng)用于慢性創(chuàng)面愈合擁有巨大潛力。本文主要就目前益生菌在促進(jìn)慢性創(chuàng)面愈合中的使用方法，及其與各種組織細(xì)胞的相互作用進(jìn)行綜述，以期為慢性創(chuàng)面的綜合治療提供一個(gè)新的方向。

慢性創(chuàng)面又稱慢性潰瘍或慢性難愈合創(chuàng)面，國際上尚無統(tǒng)一定義。國際傷口協(xié)會將慢性創(chuàng)面定義為：無法通過正確有序而及時(shí)的修復(fù)過程達(dá)到解剖和功能完全修復(fù)的創(chuàng)面，或在沒有建立持續(xù)性的解剖及功能條件下進(jìn)行修復(fù)的創(chuàng)面，常因?yàn)閴毫?、缺血、糖尿病、感染等原因難以愈合[1]。臨床上多指由各種原因引起的接受1 個(gè)月及以上正規(guī)治療不愈合或無愈合傾向者，通?？蓪⒙詣?chuàng)面病因分為靜脈性潰瘍、動脈性潰瘍、糖尿病性潰瘍、壓力性潰瘍、創(chuàng)傷性潰瘍[2]。慢性創(chuàng)面病因復(fù)雜，愈合難度大，通常需要綜合性治療，但效果仍然不理想。如糖尿病足，高達(dá)28% 的患者需下肢截肢，接受截肢患者若無預(yù)防意識，其中的50%～80% 患者在第二年可再次出現(xiàn)潰瘍[3-5]。

大量研究表明，在各種疾病中，腸道及皮膚益生菌微生物群發(fā)生了變化，提示益生菌及其代謝產(chǎn)物對人類健康促進(jìn)及某些疾病變化有著積極作用[6]。益生菌具有調(diào)節(jié)免疫、減輕炎癥、抑制感染等功效，應(yīng)用部分益生菌可以促進(jìn)慢性創(chuàng)面愈合，但是目前的研究有限，作用機(jī)制不明確，仍需進(jìn)一步深入研究。本文就目前益生菌在促進(jìn)慢性創(chuàng)面愈合中的使用方法，及其與各種組織細(xì)胞的相互作用進(jìn)行綜述，以期為慢性創(chuàng)面的綜合治療提供一個(gè)新的方向。

1 促進(jìn)慢性創(chuàng)面愈合的益生菌使用方法

1.1 口服益生菌

早期研究發(fā)現(xiàn)，腸道疾病及某些代謝性疾病引起腸道內(nèi)菌群失調(diào)，而補(bǔ)充足量特定的益生菌對于某些疾病有著顯著的治療作用，因腸道微生物群調(diào)節(jié)宿主生理穩(wěn)態(tài)介質(zhì)，包括免疫系統(tǒng)、腸道屏障功能和疾病易感性途徑[7]。燒傷導(dǎo)致腸道內(nèi)微生物菌群失調(diào)，產(chǎn)丁酸鹽菌屬及乳酸菌豐度明顯下降，而機(jī)會致病菌豐度明顯上升[8]。將益生菌作為膳食補(bǔ)劑可促進(jìn)慢性創(chuàng)面的愈合，臨床上通常應(yīng)用于燒傷創(chuàng)面的治療中?？诜嫔{(diào)節(jié)腸道屏障功能，增強(qiáng)免疫，減輕炎癥，降低感染率，緩解膿毒血癥，有助于創(chuàng)面愈合和縮短康復(fù)時(shí)間[9-10]。在一項(xiàng)口服益生菌促進(jìn)小鼠皮膚創(chuàng)面愈合的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，口服益生菌可減少巨噬細(xì)胞和肥大細(xì)胞浸潤，減輕炎癥反應(yīng)，并加速局部血管生成，促進(jìn)創(chuàng)面上皮化[11]。

對于口服益生菌促進(jìn)創(chuàng)面愈合的機(jī)制，有研究認(rèn)為可能是通過腸道-皮膚軸實(shí)現(xiàn)的。腸道微生物失調(diào)可以引起皮膚病變，這可能是由于腸道微生物失調(diào)引起全身免疫發(fā)生變化，調(diào)節(jié)全身炎癥反應(yīng)，最終影響到皮膚免疫。例如，口服發(fā)酵乳桿菌可增強(qiáng)T 淋巴細(xì)胞增殖能力，加強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬作用，刺激髓系樹突狀細(xì)胞成熟的能力等，從而提高全身免疫[12]。腸道菌群失調(diào)與某些皮膚炎性病變，如銀屑病、特應(yīng)性皮炎等，有著密不可分的聯(lián)系[13]，炎癥性腸病表現(xiàn)出的皮膚病變也佐證了腸道菌群可以影響皮膚這一點(diǎn)[14]。有研究進(jìn)一步提出，腸道益生菌的皮膚效應(yīng)是通過腸道-腦-皮膚軸得以實(shí)現(xiàn)的，即口服益生菌促進(jìn)了腦內(nèi)某種神經(jīng)活性物質(zhì)的分泌，并最終反饋到皮膚組織。例如，口服羅伊氏乳桿菌后，通過激活迷走神經(jīng)通路上調(diào)了催產(chǎn)素的表達(dá)，激活宿主CD4+Foxp3+CD25+免疫T 調(diào)節(jié)細(xì)胞，使得小鼠背部創(chuàng)面愈合時(shí)間僅為對照組的一半[15]。

1.2 局部應(yīng)用益生菌及其代謝產(chǎn)物

口服益生菌雖對慢性創(chuàng)面恢復(fù)具有一定療效，但慢性創(chuàng)面的治療仍然以局部護(hù)理為主。有研究嘗試將益生菌及益生菌產(chǎn)物局部應(yīng)用于創(chuàng)面，發(fā)現(xiàn)對慢性創(chuàng)面的愈合具有促進(jìn)效果，但相關(guān)的臨床研究尚處于初始階段。

在早期的一項(xiàng)臨床試驗(yàn)中，Peral 等[16]將植物乳桿菌用于感染性Ⅱ度、Ⅲ度燒傷創(chuàng)面，與傳統(tǒng)的殺菌劑、磺胺嘧啶銀比較，其在抑制細(xì)菌載量、提供肉芽組織創(chuàng)面床方面有著更加優(yōu)秀的效果。近期，一項(xiàng)小型的糖尿病足潰瘍臨床實(shí)驗(yàn)中，將植物乳桿菌局部給藥作為手術(shù)清創(chuàng)的輔助手段，益生菌表現(xiàn)出顯著的抗感染能力，可促進(jìn)纖維增加、血管生成，并促進(jìn)巨噬細(xì)胞從促炎型M1（CD68）到抗炎型M2（CD163）表型極化，加強(qiáng)了中性粒細(xì)胞的吞噬作用，從而加速創(chuàng)面愈合[17]。在另一項(xiàng)下肢靜脈潰瘍的臨床研究中，植物乳桿菌通過抑制中性粒細(xì)胞產(chǎn)生的炎癥因子白細(xì)胞介素8（IL-8），改善局部炎癥，促進(jìn)靜脈潰瘍愈合[18]。一項(xiàng)治療口腔復(fù)發(fā)性阿弗他潰瘍的臨床研究發(fā)現(xiàn)，將含植物乳桿菌的蘆薈發(fā)酵凝膠涂抹于患者潰瘍部位，可以加速潰瘍的愈合；同時(shí)，使用DNA 提取及高通量測序發(fā)現(xiàn)，含植物乳桿菌的蘆薈發(fā)酵凝膠可以使口腔微生物更快恢復(fù)多樣化[19]。

開菲爾顆粒是一種多種益生菌混合而成的益生菌復(fù)合物，通常由乳桿菌、乳鏈球菌、醋酸菌、酵母菌等微生物組成，局部應(yīng)用可加速大鼠燒傷創(chuàng)面血管、膠原的生成，加速創(chuàng)面整體收縮[20]。唾液鏈球菌K12 局部應(yīng)用于小鼠的由放射引起的口腔黏膜潰瘍創(chuàng)面，可促進(jìn)潰瘍愈合，基底層上皮細(xì)胞密度及黏膜厚度增加，促使上皮細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡[21]。將干酪乳桿菌上清液局部應(yīng)用于銅綠假單胞菌定植的大鼠Ⅱ度燒傷創(chuàng)面中，顯著抑制了銅綠假單胞菌感染，效果甚至強(qiáng)于應(yīng)用亞胺培南的陽性對照組[22]，同時(shí)增加了表皮和真皮的最大厚度[23]。在燒傷動物模型局部應(yīng)用益生菌，不僅可以抑制感染，同時(shí)還可以減輕感染后的瘢痕形成。在兔的感染性燒傷模型中，植物乳桿菌不僅減輕了銅綠假單胞菌感染的嚴(yán)重程度，縮短了感染持續(xù)時(shí)間，同時(shí)在創(chuàng)面愈合后的瘢痕組織中，益生菌治療顯著減少了感染傷口中Ⅰ型膠原纖維及總膠原蛋白的積累，與未感染傷口顯示出幾乎同樣的效果[24]。

上述研究結(jié)果表明，局部應(yīng)用益生菌及其產(chǎn)物，對慢性創(chuàng)面的愈合具有極大的臨床治療潛力。

1.3 局部應(yīng)用基因工程菌

除了口服益生菌補(bǔ)劑和局部應(yīng)用益生菌發(fā)酵上清液或滅活菌株，另一種治療策略是利用基因工程技術(shù)，將編碼某種促進(jìn)愈合的基因轉(zhuǎn)入到益生菌中，形成基因工程菌。將基因工程活菌應(yīng)用于傷口治療，因活性益生菌活躍的新陳代謝，可持續(xù)表達(dá)某些有益物質(zhì)，可以更加有效地抑制病原菌的黏附、增殖，促進(jìn)慢性創(chuàng)面的愈合。將含有編碼趨化因子CXCL12 基因的羅伊氏乳桿菌應(yīng)用于小鼠創(chuàng)面治療，持續(xù)產(chǎn)生的乳酸降低了局部pH 值，抑制了肽酶CD26，提高了CXCL12 生物活性；另外，基因工程菌產(chǎn)生的CXCL12 通過上調(diào)巨噬細(xì)胞TGF-β 的表達(dá)，促進(jìn)真皮細(xì)胞增殖，有效促進(jìn)傷口閉合[25]。另一項(xiàng)研究顯示，同樣編碼CXCL12 基因的基因工程菌在豬的創(chuàng)面上也呈現(xiàn)出類似效果[26]?；蚬こ叹衅洫?dú)有的優(yōu)勢，克服了單獨(dú)使用益生菌產(chǎn)物藥效不能持久、需要多次給藥的缺點(diǎn)，證明了基因工程菌應(yīng)用于慢性創(chuàng)面治療的可行性。

2 益生菌抑制病原菌感染

創(chuàng)面不愈合的原因錯(cuò)綜復(fù)雜，病原菌感染在其中具有重要的作用。大多數(shù)定植在慢性創(chuàng)面的病原菌屬于21 個(gè)科，葡萄球菌科及假單胞菌科是慢性創(chuàng)面中最常見的菌屬[27-28]。慢性創(chuàng)面上的病原菌可分泌多種毒力因子及蛋白酶，從而抑制傷口愈合[29]，同時(shí)還可形成生物膜，阻止抗生素殺滅細(xì)菌[30]。

2.1 益生菌直接抑制病原菌活力與毒力

多項(xiàng)研究表明，益生菌對于慢性創(chuàng)面常見致病菌存在顯著抑制作用。益生菌能產(chǎn)生過氧化氫、有機(jī)酸、抗菌肽、細(xì)菌素等物質(zhì)抑制病原菌。干酪乳桿菌分泌乳酸、醋酸、丁二酸、檸檬酸等有機(jī)酸抑制銅綠假單胞菌的黏附過程[23]。發(fā)酵乳桿菌產(chǎn)生的細(xì)菌素和胞外多糖同樣抑制了銅綠假單胞菌的增殖及其生物膜的形成[31]。一種酵母提取液可以顯著抑制多種金黃色葡萄球菌α-溶血素和腸毒素A 基因的表達(dá)以及生物膜的形成[32]。部分益生菌對真菌具有顯著的抗菌作用，如嗜熱鏈球菌對白假絲念珠菌具有顯著抗菌活性[33]，鼠李糖乳桿菌顯著抑制熱帶念珠菌、克魯氏假絲酵母菌和近平假絲酵母菌等非白念珠菌[34]。

2.2 益生菌抑制群體感應(yīng)

益生菌抗菌的另一種機(jī)制可能給是對于群體感應(yīng)（Quorum-sensing，QS）產(chǎn)生抑制作用。隨著細(xì)菌種群數(shù)量不斷增長，細(xì)菌會產(chǎn)生一種自體誘導(dǎo)物的信號分子，當(dāng)達(dá)到一定閾值時(shí)，會開啟細(xì)胞密度依賴的特定基因表達(dá)，這種通信系統(tǒng)則為群體感應(yīng)。群體感應(yīng)廣泛參與細(xì)菌生物膜的形成及毒力因子的產(chǎn)生[35]。一種由水產(chǎn)飼料分離出來的短乳桿菌通過下調(diào)銅綠假單胞菌LasA 和LasB 基因，調(diào)節(jié)了群體感應(yīng)系統(tǒng)，抑制了生物膜及綠膿素的形成[36]。乳桿菌產(chǎn)生的另一類二酮基哌嗪類化合物，抑制了?；呓z氨酸內(nèi)脂類分子（AHLs），從而可抑制銅綠假單胞菌毒力[37]。

3 益生菌促進(jìn)慢性創(chuàng)面組織細(xì)胞生長

創(chuàng)面愈合的增殖期以大量細(xì)胞生長及細(xì)胞外基質(zhì)堆積為顯著特點(diǎn)。在細(xì)胞方面，成纖維細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞在慢性創(chuàng)面組織增殖期中起到了關(guān)鍵的作用。細(xì)胞外基質(zhì)主要包括蛋白多糖、透明質(zhì)酸、膠原和彈力蛋白，在肉芽組織的形成中發(fā)揮重要作用。在此期間，多種細(xì)胞因子、生長因子、趨化因子廣泛參與其中[38]。益生菌不僅可以保護(hù)創(chuàng)面細(xì)胞免受病原菌的毒害，還可以直接促進(jìn)成纖維細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，抑制細(xì)胞外基質(zhì)的降解，減輕局部炎癥反應(yīng)，促進(jìn)慢性創(chuàng)面組織生長，加速創(chuàng)面愈合。

3.1 益生菌與成纖維細(xì)胞

益生菌通過促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖、遷移，加強(qiáng)膠原分泌，從而縮小創(chuàng)面，加速創(chuàng)面愈合。開菲爾顆粒與成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)后，MTT 增殖實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)證明，開菲爾顆粒促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖和遷移，且呈劑量依賴性增加。在大鼠燒傷創(chuàng)面中，開菲爾顆粒增加堿性成纖維生長因子（bFGF）、降低炎癥因子白細(xì)胞介素-1（IL-1）表達(dá)，促進(jìn)燒傷創(chuàng)面中的膠原形成，加速愈合[20]。在另一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中，從乳桿菌分離出來的胞外多糖與成纖維細(xì)胞體外共培養(yǎng)，能促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖與遷移，同時(shí)抑制彈性蛋白酶、膠原酶和基質(zhì)金屬蛋白酶活性，抑制細(xì)胞外基質(zhì)降解[39]。羅伊氏乳桿菌上清液通過抑制炎癥，促進(jìn)牙齦成纖維細(xì)胞生長，其分泌的前列腺素E2（PGF-E2），可能在炎癥消退中發(fā)揮重要作用[40]。

3.2 益生菌與角質(zhì)形成細(xì)胞

益生菌還可以通過促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖，來加速慢性創(chuàng)面的上皮化，提供上皮屏障保護(hù)。多項(xiàng)對角質(zhì)形成細(xì)胞的體外實(shí)驗(yàn)證明了其優(yōu)秀的保護(hù)作用。長雙歧桿菌、植物乳桿菌、路氏乳桿菌和鼠李糖乳桿菌等，能有效促進(jìn)人原代表皮角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖遷移，增強(qiáng)了緊密連接，降低細(xì)胞通透性，從而抵抗病原菌的入侵[41]。長雙歧桿菌通過調(diào)節(jié)Toll 樣受體-2（TLR-2）加強(qiáng)緊密連接[41]，鼠李糖乳桿菌上調(diào)了趨化因子CXCL2 及其受體CXCR2 在內(nèi)的多個(gè)基因的表達(dá)，對角質(zhì)形成細(xì)胞的生長遷移至關(guān)重要[42]。植物乳桿菌和唾液乳桿菌還參與角質(zhì)形成細(xì)胞的特定蛋白組學(xué)的調(diào)節(jié)，其中涉及白細(xì)胞介素型增強(qiáng)因子結(jié)合因子2 和ATP 依賴的RNA 解旋酶等調(diào)節(jié)蛋白，和細(xì)胞因子、核因子-κB、Hedgehog、RUNX 信號失調(diào)，這些蛋白質(zhì)和途徑與創(chuàng)面愈合和抗炎密切關(guān)聯(lián)[43]。但不是所有乳桿菌對角質(zhì)形成細(xì)胞都表現(xiàn)為有益作用，如發(fā)酵乳桿菌對角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖可產(chǎn)生抑制作用[41]。

3.3 益生菌與血管內(nèi)皮細(xì)胞

創(chuàng)面的愈合與內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成行為關(guān)系密切，多項(xiàng)研究表明，益生菌分泌的后生元在大鼠創(chuàng)面模型中可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長。如熱滅活乳桿菌制劑[18]、羅伊氏乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌和納豆枯草芽孢桿菌[44]用于大鼠創(chuàng)面模型，可使局部血管生成增加。益生菌促進(jìn)創(chuàng)面血管內(nèi)皮生長的機(jī)制尚未完全闡明，其中的分子機(jī)制可能是促進(jìn)了低氧誘導(dǎo)因子2α（HIF-2α）的表達(dá)，有研究表明鼠李糖乳桿菌在小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中誘導(dǎo)了HIF-2α 的表達(dá)上調(diào)[45]，這是一種在創(chuàng)面修復(fù)中具有招募各種祖細(xì)胞、干細(xì)胞作用的重要調(diào)節(jié)因子，參與血管網(wǎng)的形成，加速創(chuàng)面愈合。

4 益生菌調(diào)節(jié)免疫

4.1 益生菌與巨噬細(xì)胞

巨噬細(xì)胞表型的變化與慢性創(chuàng)面愈合的過程緊密相關(guān)，M1 型巨噬細(xì)胞表現(xiàn)為促炎性，產(chǎn)生多種促炎因子，加強(qiáng)炎癥，細(xì)胞外基質(zhì)降解，促進(jìn)病原菌的吞噬；M2 型巨噬細(xì)胞表現(xiàn)為抗炎性，抑制炎癥因子的產(chǎn)生，促進(jìn)血管生成，分泌多種生長因子，抑制細(xì)胞外基質(zhì)的降解，加速創(chuàng)面的愈合[46]。在慢性創(chuàng)面中，如糖尿病慢性潰瘍，巨噬細(xì)胞表型失衡抑制了創(chuàng)面的正常愈合，在糖尿病患者及動物模型中促炎性M1 型巨噬細(xì)胞占主導(dǎo)地位，表現(xiàn)為持續(xù)的炎癥狀態(tài)并延遲傷口愈合[47]。而益生菌具備調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞表型變化的能力，在糖尿病足創(chuàng)面愈合研究中，植物乳桿菌作為手術(shù)清創(chuàng)的輔助手段，在治療第7 天、14 天、21 天創(chuàng)面取材，免疫組化結(jié)果顯示促炎性M1 巨噬細(xì)胞（CD68+）明顯減少，抗炎性M2 巨噬細(xì)胞（CD163+）表達(dá)高于對照組[17]。植物乳桿菌的胞外囊泡與人單核細(xì)胞THP1 細(xì)胞共培養(yǎng)后，CD209、C 型凝集素結(jié)構(gòu)域家族5 成員A（CLEC5A）、CD200 R、鞘氨醇激酶1（SPHK1）、A 類清道夫受體1（SRA1)、IL-1 受體和CD163 偏向性高表達(dá)，這些細(xì)胞表面標(biāo)志和細(xì)胞因子與M2 巨噬細(xì)胞相關(guān)，促進(jìn)人單核細(xì)胞THP1 細(xì)胞向抗炎性M2 巨噬細(xì)胞表型分化。即使是在干擾素-γ 和脂多糖誘導(dǎo)的促炎條件下，植物乳桿菌胞外囊泡依然抑制了M1 巨噬細(xì)胞的誘導(dǎo)作用，減輕M1 巨噬細(xì)胞的炎癥影響[48]。然而，益生菌對巨噬細(xì)胞的極化作用似乎表現(xiàn)出菌株特異性。目前的研究顯示，糞腸球菌、德式乳桿菌、嗜熱鏈球菌等誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M1 型極化，而植物乳桿菌、長雙歧桿菌、短乳桿菌、枯草芽孢桿菌等促使M2 型極化，降低炎癥反應(yīng)，促進(jìn)愈合[49]。

4.2 益生菌與中性粒細(xì)胞

益生菌還可以調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞活性，增加其吞噬作用，促進(jìn)對病原菌的吞噬。植物乳桿菌上清液與糖尿病患者中性粒細(xì)胞共培養(yǎng)，可增強(qiáng)糖尿病患者中性粒細(xì)胞對金黃色葡萄球菌的吞噬作用，甚至與健康人群相當(dāng)[17]。中性粒細(xì)胞分泌的炎癥介質(zhì)白細(xì)胞介素-8（IL-8），對中性粒細(xì)胞具有極強(qiáng)的趨化作用。將植物乳桿菌應(yīng)用于糖尿病患者小腿潰瘍治療中，通過提高IL-8 水平，可促使中性粒細(xì)胞從外周血?jiǎng)?chuàng)面聚集來抑制病原菌的定植[18]。

5 總結(jié)與展望

慢性創(chuàng)面的遷延不愈是患者及社會沉重的負(fù)擔(dān)，隨著細(xì)菌耐藥性的不斷上升，慢性基礎(chǔ)疾病引起的局部炎癥反應(yīng)加重，創(chuàng)面愈合越發(fā)困難。慢性創(chuàng)面的綜合治療是當(dāng)今的研究熱點(diǎn)，各種抗菌藥物、生物支架層出不窮，益生菌治療提供了一個(gè)全新的方向，有望進(jìn)一步推動慢性創(chuàng)面的綜合治療。但目前的研究多數(shù)僅停留在益生菌的抗菌作用及對慢性創(chuàng)面愈合的促進(jìn)作用，其具體機(jī)制的研究尚淺；另外，對于益生菌的給藥方式、給藥劑量、藥物劑型、給藥時(shí)間等還缺乏統(tǒng)一的認(rèn)知，目前還無法形成規(guī)范化、系統(tǒng)化治療。但已有的體內(nèi)、外研究已經(jīng)表明了慢性創(chuàng)面的益生菌療法擁有極為廣闊的應(yīng)用前景，有望成為促進(jìn)慢性創(chuàng)面愈合的有效手段。