陳艷，龍?jiān)气P，姜焱，周斌*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210095；2.南京海關(guān)動(dòng)植物與食品檢測(cè)中心，江蘇 南京 210019)

非洲豬瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)能導(dǎo)致家豬和野豬的出血熱，強(qiáng)毒株致死率可達(dá)到100%。該病毒具有相當(dāng)高的跨境傳播能力，在非洲、歐洲、美洲和亞洲廣泛流行。疫情對(duì)豬肉產(chǎn)業(yè)的影響嚴(yán)重，導(dǎo)致全球豬肉供需失衡及價(jià)格大幅波動(dòng)，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(WOAH)將非洲豬瘟(ASF)列為法定報(bào)告動(dòng)物疫病，我國也將之歸入必須重點(diǎn)防范的一類動(dòng)物疫病名錄。近期，ASFV疫苗的研發(fā)和臨床應(yīng)用推廣取得了一定進(jìn)展，但要想徹底控制病毒傳播仍需全球合作和共同努力[1-3]。

ASFV是一種雙鏈的核質(zhì)大DNA病毒(nucleocytoplasmic large DNA viruses，NCLDV)，基因組長度為170～190 kb，編碼68種結(jié)構(gòu)蛋白和超過100種非結(jié)構(gòu)蛋白[4]。內(nèi)膜蛋白p54與p30、p72被證實(shí)為最具抗原性和免疫原性的ASFV結(jié)構(gòu)蛋白，能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體[5]。針對(duì)p54的抗體最早出現(xiàn)在感染后第8 天，并持續(xù)存在數(shù)周，因此，p54及其抗體常被作為血清學(xué)診斷靶點(diǎn)，用于監(jiān)測(cè)動(dòng)物ASFV感染情況和免疫效力評(píng)估[6]。本研究將ASFV Pig/HLJ/2018毒株(GenBank號(hào)：MK333180)E183L(p54)基因的膜內(nèi)區(qū)序列插入到pET-28a(+)載體，通過原核表達(dá)系統(tǒng)獲得ASFV重組p54蛋白，借助雜交瘤技術(shù)制備出3株針對(duì)p54蛋白的單克隆抗體，并利用噬菌體展示肽庫鑒定了3株抗體所識(shí)別的抗原表位，為ASFV診斷方法開發(fā)和病原學(xué)基礎(chǔ)研究提供了生物學(xué)工具。

M.DNA Ladder；1.陰性對(duì)照；2.p54基因；3～5.p54-pET-28a-DH5α重組菌單克隆；6.pET-28a空載體；7.重組質(zhì)粒 pET-28a-p54。

M.蛋白 Marker；1.pET-28a-BL21全菌；2.未誘導(dǎo)p54-pET-28a-BL21全菌；3～5.經(jīng)誘導(dǎo)的p54-pET-28a-BL21全菌及裂解后的上清液、沉淀；6.流穿液；7～10.含50、100、200、300 mmol/L咪唑的洗脫液。

M.蛋白 Marker；1.pET-28a-BL21；2.p54-pET-28a-BL21。

M.蛋白 Marker；1.未感染的PAM細(xì)胞；2.ASFV感染的PAM細(xì)胞；3～6.依次為PRRSV、CSFV、JEV和ASFV感染細(xì)胞裂解物。

1 材料與方法

1.1 主要材料

攜帶ASFV Pig/HLJ/2018毒株E183L(p54)基因的質(zhì)粒pGEX-4T-1-p54購自南京金斯瑞生物科技有限公司；ASFV感染的豬肺泡巨噬細(xì)胞(PAM)爬片和SDS-PAGE樣品由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所惠贈(zèng)；ASFV陽性血清標(biāo)準(zhǔn)品購自中國獸醫(yī)微生物菌種保藏中心；豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬瘟病毒(CSFV)、日本腦炎病毒(JEV)、抗p30蛋白單克隆抗體、小鼠骨髓瘤細(xì)胞(SP2/0)由本實(shí)驗(yàn)室保存；BALB/c小鼠購自江蘇華創(chuàng)信諾醫(yī)藥科技有限公司。

高保真PCR聚合酶Prime STAR、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ、DNA Ladder、T4 DNA連接酶和DNA膠回收試劑盒購自TaKaRa公司；pET-28a(+)載體由本實(shí)驗(yàn)室保存；質(zhì)粒提取試劑盒購自O(shè)mega公司；感受態(tài)細(xì)胞DH5α和BL21(DE3)購自北京擎科生物技術(shù)有限公司；6×His-tag Ni親和層析柱購于General Electric公司；250 kDa預(yù)染蛋白 Marker、12.5% PAGE凝膠快速制備試劑盒購自上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司；180 kDa預(yù)染蛋白 Marker、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、高敏型ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒購自南京諾唯贊醫(yī)療科技有限公司；聚偏二氟乙烯膜(PVDF)購自PALL公司；HRP標(biāo)記兔抗鼠IgG、FITC標(biāo)記羊抗鼠IgG、His單克隆抗體、小鼠單克隆抗體亞型鑒定試劑盒購自Proteintech公司；TMB底物和終止液購自碧云天生物技術(shù)有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自Gibco公司；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、HAT和HT培養(yǎng)基購自Sigma公司；Ph.D-12肽庫試劑盒、抗M-13抗體購自NEB公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

實(shí)驗(yàn)室前期試驗(yàn)表明，全長的p54蛋白難以在原核系統(tǒng)中表達(dá)，因此選擇對(duì)其進(jìn)行截短表達(dá)。根據(jù)TMHMM-2.0的蛋白質(zhì)跨膜區(qū)預(yù)測(cè)結(jié)果，針對(duì)p54蛋白的膜內(nèi)區(qū)(157～555 bp，53～183 aa)設(shè)計(jì)常規(guī)PCR引物，F(xiàn)：5′-TGACGGATCCATGTCTTCAAG-AAAGAAAAAAGC-3′(下劃線處為BamHⅠ酶切位點(diǎn))，R：5′-TGACCTCGAGCAAGGAGTTTTCTAG-GTCT-3′(下劃線處為XhoⅠ酶切位點(diǎn))，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為399 bp。以質(zhì)粒pGEX-4T-1-p54為PCR模板。反應(yīng)體系為：Prime STAR 25 μL，上游引物2 μL，下游引物2 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 20 μL。PCR反應(yīng)條件為：98 ℃ 5 min；98 ℃ 10 s，55 ℃ 5 s，72 ℃ 30 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。通過膠回收方法純化PCR產(chǎn)物。

將經(jīng)過限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ處理后的目的片段和pET-28a(+)載體用T4連接酶連接8 h。之后轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物到感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，從菌液PCR鑒定為陽性的單克隆過夜培養(yǎng)物中提取質(zhì)粒，對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行限制性雙酶切，陽性質(zhì)粒由北京擎科生物技術(shù)有限公司測(cè)序。測(cè)序正確的重組質(zhì)粒被命名為pET-28a-p54并于-20 ℃保存。

1.3 重組p54蛋白的原核表達(dá)、純化及反應(yīng)原性鑒定

將重組質(zhì)粒pET-28a-p54轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)中，得到p54重組蛋白原核表達(dá)菌株p54-pET-28a-BL21。將p54-pET-28a-BL21的過夜培養(yǎng)物按體積比1∶100接種到含50 μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在37 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期，即菌液的OD600值為0.6～0.8時(shí)，加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG，繼續(xù)培養(yǎng)5～7 h后離心收集菌體。用PBS重懸菌體后在冰浴條件下進(jìn)行超聲破碎，在4 ℃、10 000 r/min條件下離心10 min。轉(zhuǎn)移上清液到新的離心管，并用PBS重懸沉淀，分別制備SDS-PAGE樣品，用以鑒定重組蛋白的表達(dá)形式。

使用His-tag鎳離子親和層析法純化重組蛋白。在預(yù)試驗(yàn)中用梯度咪唑濃度的洗脫緩沖液洗脫，經(jīng)SDS-PAGE測(cè)定重組蛋白的最佳洗脫濃度。后續(xù)試驗(yàn)洗脫時(shí)先用低咪唑濃度的除去雜蛋白，再用最佳濃度的緩沖液洗脫下重組蛋白。用SDS-PAGE鑒定重組蛋白的純度。用透析法對(duì)純化后的重組蛋白做脫鹽和濃縮處理。用BCA法測(cè)定重組蛋白的濃度。通過Western blot鑒定重組蛋白與His單克隆抗體、ASFV陽性血清標(biāo)準(zhǔn)品的反應(yīng)性。

1.4 p54蛋白單克隆抗體制備

1.4.1 動(dòng)物免疫

將10只6周齡BALB/c雌性小鼠平均分為免疫組和陰性對(duì)照組。首次免疫時(shí)，以背部皮下多點(diǎn)注射方式給免疫組每只小鼠接種50 μg重組蛋白與等體積弗氏完全佐劑的乳化物。首次免疫后的第3周進(jìn)行第2次免疫，第4周進(jìn)行第3次免疫。第2、3次免疫時(shí)將弗氏完全佐劑換成弗氏不完全佐劑。整個(gè)免疫程序中，陰性對(duì)照組用等體積滅菌PBS處理。第3次免疫后7 d，采集小鼠眼眶血，通過間接ELISA測(cè)定小鼠血清效價(jià)。細(xì)胞融合前3 d，在效價(jià)達(dá)到1∶10 000的小鼠中選擇數(shù)值最高的那只，腹腔注射100 μg重組蛋白。

1.4.2 單克隆抗體的制備

細(xì)胞融合前1 d，分離小鼠腹腔巨噬細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞，密度調(diào)整到1×105/mL，按100 μL每孔加入到96孔板中培養(yǎng)。處死經(jīng)過4次免疫的小鼠，分離脾細(xì)胞，在PEG4000作用下與對(duì)數(shù)生長期的SP2/0細(xì)胞按照5∶1的比例進(jìn)行細(xì)胞融合。將融合細(xì)胞用含1× HAT和20% FBS的選擇培養(yǎng)基重懸，加入到含有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔細(xì)胞板中培養(yǎng)。細(xì)胞融合3 d后，每日觀察細(xì)胞狀態(tài)并統(tǒng)計(jì)融合率。細(xì)胞融合第5天后，每隔3 d用HAT選擇培養(yǎng)基半換液。細(xì)胞融合第14天后，用HT補(bǔ)充培養(yǎng)基半換液，取出的一半細(xì)胞培養(yǎng)上清液用間接ELISA方法測(cè)抗體水平，對(duì)陽性雜交瘤細(xì)胞至少進(jìn)行2～3次亞克隆至抗體陽性率達(dá)100%，確立雜交瘤細(xì)胞系并建庫凍存，之后培養(yǎng)不再添加HT補(bǔ)充培養(yǎng)基。將陽性雜交瘤細(xì)胞連續(xù)傳代培養(yǎng)和凍存，逐代減少FBS含量至10%、5%甚至無血清，以利于抗體產(chǎn)生和后續(xù)抗體純化。測(cè)定不同代次的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中抗體效價(jià)，擴(kuò)大培養(yǎng)能穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞株，凍存于液氮中長期保存。

1.4.3 間接ELISA方法

用碳酸鹽緩沖液(0.05 mol/L，pH=9.6)作為包被液將重組蛋白p54稀釋到2 μg/mL，按100 μL/孔加入到酶標(biāo)板，37 ℃孵育1 h。之后用PBST洗滌4次，最后一次洗滌完將酶標(biāo)板在吸水紙上拍干。用5%脫脂乳作為封閉液，按100 μL/孔加入到酶標(biāo)板，37 ℃孵育1 h。按前述方法洗滌。將陰性對(duì)照、陽性對(duì)照和樣品，按100 μL/孔加入到酶標(biāo)板，37 ℃孵育45 min。按前述方法洗滌。將HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG單抗以1∶5 000比例稀釋后，按100 μL/孔加入到酶標(biāo)板，37 ℃孵育45 min。按前述方法洗滌。按100 μL/孔加入TMB顯色液，37 ℃避光顯色15 min。按100 μL/孔加入終止液。使用酶標(biāo)儀讀取OD450 nm值，待檢樣品OD450 nm/陰性樣品OD450 nm(S/N)≥2.1時(shí)判定為陽性。以PBS處理組的小鼠血清作為陰性對(duì)照，免疫組小鼠血清作為陽性對(duì)照。

1.4.4 腹水制備

準(zhǔn)備9只12周齡BALB/c雌性小鼠，按3只/株單克隆抗體分組。給每只小鼠腹腔注射0.5 mL經(jīng)高壓滅菌的液體石蠟。7 d后，給每只小鼠腹腔接種5×105個(gè)雜交瘤細(xì)胞。5～7 d后，每日觀察小鼠狀態(tài)，對(duì)腹部明顯膨大、觸摸有波動(dòng)感的小鼠用0.55 mm靜脈采血針收集腹水。采集到的腹水在4 ℃靜置過夜，次日12 000 r/min離心5 min，收集中間層，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 p54蛋白單克隆抗體的生物學(xué)特性鑒定

1.5.1 Western blot鑒定單克隆抗體的反應(yīng)性

取感染ASFV的PAM細(xì)胞裂解物，進(jìn)行SDS-PAGE并轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，以雜交瘤細(xì)胞上清液作為一抗，進(jìn)行Western blot反應(yīng)性鑒定。設(shè)立未感染ASFV的PAM細(xì)胞作為陰性對(duì)照。

1.5.2 免疫熒光試驗(yàn)(IFA)鑒定單克隆抗體的反應(yīng)性

鑒定抗p54單克隆抗體與感染ASFV的PAM細(xì)胞的反應(yīng)性，設(shè)立未感染ASFV的PAM細(xì)胞作為陰性對(duì)照。用4%多聚甲醛固定細(xì)胞，加入2% BSA在37 ℃封閉2 h，以雜交瘤上清液作為一抗、HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG為二抗，在37 ℃各孵育1 h，每個(gè)步驟之后用PBS洗滌3次。在熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.5.3 單克隆抗體的反應(yīng)特異性鑒定

取PRRSV、CSFV、JEV和ASFV感染的PAM細(xì)胞裂解物，進(jìn)行SDS-PAGE并轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，以3株雜交瘤細(xì)胞上清液混合液作為一抗，進(jìn)行Western blot反應(yīng)特異性鑒定。

1.5.4 單克隆抗體的亞型鑒定

取建庫的雜交瘤細(xì)胞上清液，使用小鼠抗體亞型鑒定試劑盒對(duì)單克隆抗體的亞型進(jìn)行鑒定，具體操作按照說明書執(zhí)行。

1.5.5 單克隆抗體的B細(xì)胞表位鑒定

用Protein A/G PLUS-Agarose分別捕獲腹水中未純化的3株單克隆抗體，與10 μL噬菌體展示肽原始文庫共同孵育，洗滌3次后洗脫下特異性結(jié)合的噬菌體，測(cè)定噬菌體滴度，完成第一次淘選。擴(kuò)增上一次淘選收集的噬菌體并濃縮至滴度≥1.5×1012pfu/mL，用于下一次淘選。第3次淘選后，從噬菌斑<100的滴度測(cè)定平板上各挑取30個(gè)單克隆進(jìn)行間接ELISA鑒定。提取陽性噬菌體克隆的基因組，測(cè)序后翻譯出展示肽序列，比對(duì)分析得到同一株單克隆抗體結(jié)合肽的共有序列，與p54蛋白氨基酸序列進(jìn)行同源性分析，確定單克隆抗體識(shí)別的抗原表位。詳細(xì)步驟參考Ph.D-12肽庫試劑盒說明書。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

p54蛋白膜內(nèi)區(qū)基因(157～555 bp，53～183 aa)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長度與預(yù)期的399 bp相符(圖1A)。p54-pET-28a-DH5α重組菌的菌液PCR鑒定均為陽性(圖1B)。重組質(zhì)粒pET-28a-p54經(jīng)過雙酶切鑒定后獲得的片段與目的基因大小一致(圖1C)?；驕y(cè)序結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒的插入序列與目的基因完全一致。

2.2 重組p54蛋白表達(dá)、純化及鑒定

SDS-PAGE結(jié)果顯示，重組菌株p54-pET-28a-BL21經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后大量表達(dá)分子量約為23 kDa的融合蛋白，與預(yù)期大小相符，重組蛋白部分為可溶性表達(dá)，部分為包涵體形式(圖2A)。通過His-tag鎳離子親和層析法純化的可溶性p54重組蛋白在電泳后染色呈單一條帶，純化效果良好(圖2B)。Western blot顯示His單克隆抗體和ASFV陽性血清標(biāo)準(zhǔn)品均能特異性識(shí)別p54重組蛋白，表明p54重組蛋白成功表達(dá)且具有良好的反應(yīng)原性(圖3)。

2.3 單克隆抗體的制備

在小鼠第2次和第3次免疫后分別采集眼眶血，按本研究建立的ELISA方法測(cè)定小鼠血清抗體效價(jià)，結(jié)果顯示，免疫組小鼠的抗p54蛋白抗體效價(jià)均達(dá)到1∶51 200，可用于細(xì)胞融合。

按本研究建立的ELISA方法對(duì)成功融合的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行篩選和亞克隆，最終獲得3株能穩(wěn)定分泌抗p54蛋白單克隆抗體的細(xì)胞，分別命名為2A4、5F6和RH15。3株陽性雜交瘤細(xì)胞經(jīng)過連續(xù)傳代培養(yǎng)20代次以上，培養(yǎng)基上清液中抗體效價(jià)仍維持在1∶12 800的較高水平，表明其分泌抗體能力穩(wěn)定。

每株抗p54蛋白單克隆抗體的細(xì)胞約收集到10 mL腹水，按照本研究建立的ELISA方法測(cè)定腹水體水平，效價(jià)均達(dá)到1∶5 120 000。

2.4 單克隆抗體的反應(yīng)性鑒定

Western blot結(jié)果表明，3株單克隆抗體能夠特異性地識(shí)別感染ASFV的PAM細(xì)胞(圖4A)，而不與PRRSV、CSFV、JEV感染細(xì)胞裂解物發(fā)生反應(yīng)(圖4B)。

IFA表明，3株單克隆抗體能夠識(shí)別感染ASFV的PAM細(xì)胞，產(chǎn)生特異性的紅色熒光，熒光集中于ASFV感染細(xì)胞的病毒工廠區(qū)域。單克隆抗體不與陰性對(duì)照細(xì)胞發(fā)生反應(yīng)(圖5)。

圖5 IFA鑒定p54蛋白單克隆抗體與ASFV的反應(yīng)性

圖6 間接ELISA鑒定抗p54蛋白單克隆抗體與噬菌體克隆的結(jié)合

2.5 單克隆抗體的亞型鑒定

結(jié)果見表1，3株單克隆抗體的重鏈均屬于IgG1亞類，輕鏈均為Kappa型。

表1 p54蛋白單克隆抗體亞型鑒定

2.6 p54蛋白的抗原表位鑒定

2.6.1 液相淘洗的富集效果

經(jīng)過4次淘洗，擴(kuò)增后與擴(kuò)增前的噬菌體滴度比值逐漸升高，回收率逐漸增大(表2)，說明與單克隆抗體特異性結(jié)合的噬菌體得到了選擇性富集。

表2 4輪篩選的噬菌體滴度和回收率

2.6.2 間接ELISA鑒定淘選

用間接ELISA鑒定第4次淘選得到的噬菌體。從第4次淘選產(chǎn)物滴度測(cè)定的LB/IPTG/X-gal平板中選擇噬菌斑<100個(gè)的平板，每種單克隆抗體隨機(jī)挑取出30個(gè)藍(lán)色噬菌斑進(jìn)行擴(kuò)增，用于間接ELISA鑒定。結(jié)果顯示，單克隆抗體2A4、5F6、RH15各有25、20、28個(gè)陽性噬菌體克隆(S/N≥2.1)，這表明，經(jīng)過4次淘選，能與3株單克隆抗體特異性結(jié)合的噬菌體得到有效富集。

2.6.3 氨基酸多序列比對(duì)分析

提取間接ELISA為陽性的噬菌體核酸進(jìn)行測(cè)序，使用Expasy-Translate在線工具分析得到噬菌體展示的12肽序列，之后用NCBI Protein BLAST工具進(jìn)行同源性分析，發(fā)現(xiàn)單克隆抗體2A4、5F6的噬菌體12肽共有序列為NTASQ，單抗RH15的噬菌體12肽共有序列為RQRNTYTHKDL。將這2段多肽序列與ASFV內(nèi)膜蛋白p54蛋白的氨基酸序列作進(jìn)一步比對(duì)，結(jié)果顯示，單克隆抗體2A4、5F6篩選出的共有序列NTASQ與p54蛋白的157～161位氨基酸一致，單抗RH15篩選出的共有序列RQRNTYTHKDL則與p54蛋白的170～180位氨基酸一致，2段多肽序列與p54蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)有3個(gè)以上的連續(xù)氨基酸殘基重合，說明3株單抗識(shí)別的抗原表位均為線性表位。

3 討論

自2018年8月ASF在中國首次被報(bào)道以來，疫情迅速蔓延至全國，僅4個(gè)月已有21個(gè)省份受到波及，63.1萬頭生豬被撲殺。同時(shí)期，ASF在全球的流行也很活躍，包括俄羅斯、羅馬尼亞、波蘭在內(nèi)的22個(gè)國家累計(jì)報(bào)告發(fā)生疫情5 800余起[7-8]。急性型ASF不僅致死率可高達(dá)100%，還具有極強(qiáng)的傳播能力，嚴(yán)重打擊了全球養(yǎng)豬業(yè)，引起豬肉市場(chǎng)價(jià)格的大幅波動(dòng)。ASFV疫苗研制始于1960年，由于病毒具有遺傳多變性、結(jié)構(gòu)復(fù)雜等特點(diǎn)，對(duì)單核-巨噬細(xì)胞之外的非靶細(xì)胞適應(yīng)性差，易發(fā)生生物學(xué)特性的改變，另外宿主免疫保護(hù)和病毒免疫逃避機(jī)制也尚不明晰，因此疫苗的研發(fā)進(jìn)程較為緩慢[9-11]。2022年6月，首個(gè)商品化ASFV疫苗NAVET-ASFVAC在越南上市，該疫苗是由高毒力的ASFV Georgia 2007/1株缺失I177L基因后制備的減毒活疫苗，經(jīng)評(píng)估能在強(qiáng)毒株感染后給生長育肥豬提供有效的免疫保護(hù)，阻斷動(dòng)物死亡并阻止經(jīng)濟(jì)損失[12]。不過，接種NAVET-ASFVAC的豬群存在嚴(yán)重的排毒現(xiàn)象，不能排除毒力返強(qiáng)、變異和基因整合等風(fēng)險(xiǎn)，疫苗對(duì)母豬群的安全性評(píng)價(jià)并不明確，現(xiàn)今該疫苗的應(yīng)用范圍僅局限于越南國內(nèi)[12-13]。綜上，由于缺乏有效的治療藥物和安全的且能夠阻斷病毒感染的疫苗，ASF的防治和凈化策略仍側(cè)重于生物安全措施、提升豬群自身免疫力、全面監(jiān)測(cè)與精準(zhǔn)清除[14-15]。

單克隆抗體是由單一B細(xì)胞克隆所產(chǎn)生，能特異性識(shí)別單一抗原表位，被廣泛地應(yīng)用于生物學(xué)基礎(chǔ)研究和臨床治療與診斷，如鑒定蛋白的表達(dá)與定位、靶向傳遞藥物、阻斷病原感染、富集和純化生物制品、檢測(cè)靶抗原等[16]?？笰SFV單克隆抗體的研制有助于加速解析病毒蛋白的結(jié)構(gòu)與功能，探究病毒與宿主的相互作用和病毒的免疫逃避機(jī)制，從而更高效地篩選出抗病毒藥物，有針對(duì)性地開發(fā)疫苗，同時(shí)為建立高特異、高靈敏性的血清學(xué)診斷方法提供材料[17]。在以往研究中，結(jié)構(gòu)蛋白p30、p54、p72被證明在ASFV感染過程中表現(xiàn)出強(qiáng)抗原性，且針對(duì)這3種蛋白的抗體具有一定的中和活性，能夠抑制病毒的黏附和內(nèi)化[5]。遺憾的是，這3種蛋白并不足以引起完全的由抗體介導(dǎo)的體內(nèi)中和作用，無法對(duì)不同毒株的感染產(chǎn)生有效的免疫保護(hù)，因此候選ASFV亞單位疫苗的應(yīng)用局限性較大，僅僅能夠延緩臨床癥狀的出現(xiàn)時(shí)間和降低病毒血癥水平[18]。不過在ASFV血清學(xué)診斷方面，這些蛋白仍然是相當(dāng)重要的靶標(biāo)[19-20]。

本研究通過原核表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)了ASFV p54重組蛋白，免疫小鼠后使用雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體，經(jīng)過間接ELISA篩選和多次亞克隆獲得了3株能夠穩(wěn)定分泌抗p54蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系。Western blot試驗(yàn)顯示，3株單克隆抗體均能與ASFV感染的豬肺泡巨噬細(xì)胞發(fā)生特異性反應(yīng)；IFA試驗(yàn)也顯示，3株單克隆抗體能夠識(shí)別ASFV感染的豬肺泡巨噬細(xì)胞，證明這3株單抗具有良好的反應(yīng)性，可用于靶抗原的特異性檢測(cè)。在IFA試驗(yàn)中可以看到，與作為陽性對(duì)照的抗p30蛋白單克隆抗體分布在胞漿中的彌散性點(diǎn)狀熒光不同，本研究制備的3株單克隆抗體所識(shí)別的靶蛋白p54集中定位于靠近細(xì)胞核的病毒工廠中，呈致密的斑點(diǎn)狀熒光，這一表現(xiàn)與以往關(guān)于ASFV結(jié)構(gòu)蛋白定位的研究相符[21-23]。亞型鑒定試驗(yàn)顯示，3株單克隆抗體的重鏈均屬于IgG1亞類，輕鏈均為Kappa型，提示后續(xù)抗體純化如以腹水為來源材料時(shí)可能去除其中的自身免疫球蛋白(一般為IgG1和IgM)。通過噬菌體展示肽庫篩選，確定了抗p54蛋白單克隆抗體2A4、5F6識(shí)別的抗原表位為157NTASQ161，該表位與p54蛋白的動(dòng)力蛋白輕鏈(DYNLL1/DLC8)結(jié)合域151TTVTTQNTASQT162存在部分重合[24-25]，后續(xù)將探究這2株單克隆抗體阻斷此結(jié)合位點(diǎn)的潛力，以期為研究ASFV與宿主蛋白的相互作用提供精準(zhǔn)的生物學(xué)工具。單克隆抗體RH15識(shí)別的抗原表位經(jīng)鑒定為170RQRNTYTHKDL180，該表位目前未被免疫表位數(shù)據(jù)庫(IEDB)收錄，也未見有相關(guān)文章報(bào)道，這一結(jié)果豐富了p54蛋白的B細(xì)胞線性抗原表位信息，可為進(jìn)一步解析ASFV結(jié)構(gòu)蛋白的功能結(jié)構(gòu)域和更有針對(duì)性地設(shè)計(jì)亞單位疫苗提供參考。