馬家麟 ，王 碩 ，陳 濤 ，宋 霞 ，喬亞玲 ，杲秀珍 ，申 誠 ，海 平 ，李玉林

（1.中國科學院西北高原生物研究所，青海 西寧 810001；2.青海省藥品檢驗檢測院 中藥（藏藥）質(zhì)量控制重點實驗室，青海省中藥（藏藥）現(xiàn)代化研究重點實驗室，青海 西寧 810016）

星狀風毛菊為菊科鳳毛菊屬植物星狀風毛菊（Saussurea stellaMaxim.）的干燥全草，又名星狀雪兔子，藏文名為“蘇爾公瑪?！盵1-2]，主要分布于青海、西藏、甘肅、四川、云南省及自治區(qū)，生長于海拔2 500～5 400 m 的高山草甸、河邊或沼澤草地.星狀風毛菊是藏區(qū)較常用的藏藥材，性味苦，微寒，具有清熱利濕、解毒、接骨、消炎止血的功效，主要用于治療中毒性熱癥、跌打損傷、骨折、創(chuàng)傷化膿等癥狀[3-5].

在《青海植物志》中對星狀風毛菊僅載有形態(tài)和資源分布，文獻調(diào)研僅有少量關于其理化鑒別項、化學成分研究，究其原因是相關基礎研究較少，缺乏質(zhì)控指標，難以制訂完善的質(zhì)量標準，嚴重影響星狀風毛菊藥材的開發(fā)利用.因此，本研究以星狀風毛菊為對象，通過對藥材性狀、粉末顯微特征、薄層色譜鑒別、檢查（水分、灰分、醇溶性浸出物）和含量測定5 項內(nèi)容進行深入研究，找到檢驗該藥材的專屬性方法，制定合理的限度，對星狀風毛菊藥材質(zhì)量進行有效的控制提供方法和依據(jù).

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

梅特勒-托利多AG135 精密電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；CAMAG 薄層點樣和成像系統(tǒng)（瑞士卡瑪公司）；Shimadzu LC-2030C 高效液相色譜儀（日本島津公司）；PDA 檢測器（日本島津公司）；Axio IMAGE Z2 光學顯微鏡（德國ZISSI公司）；DZKW-4 電子恒溫水浴鍋（北京中興偉業(yè)）；SX2-4-10 馬弗爐（上海實驗儀器廠）.

星狀風毛菊來自青海、四川省，樣品信息如表1所列.經(jīng)中國科學院西北高原生物研究所孫菁研究員鑒定11 批樣品均為菊科鳳毛菊屬植物星狀風毛菊Saussurea stellaMaxim.干燥全草.綠原酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110753-202018）；硅膠G 薄層板（上海麥克林）；甲醇為色譜純（市售）；其余試劑為分析純（市售）；水為超純水.

表1 星狀風毛菊藥材采集信息Table 1 Sample collection informations of Saussurea stella Maxim.

1.2 薄層鑒別

對照品溶液配制：精密稱取綠原酸對照品10.0 mg，置于10 mL 容量瓶中，加甲醇超聲溶解后定容，即得對照品溶液（1.0 mg/mL）.

供試品溶液配制：取本品粉末約1.0 g，加50%乙醇50 mL 置于熱水浴中熱回流1 h，過濾，濾液減壓濃縮蒸干，精密加入5 mL 甲醇溶解即得.

在室溫、相對濕度70%條件下，依照《中華人民共和國藥典》四部2020 年版通則0502[6]薄層色譜法，分別量取對照品溶液及供試品溶液5 μL，點于同一硅膠G 薄層板上，以乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水（體積比10∶6∶1∶2）為展開劑展開，取出晾干后，噴以含1%亞硝酸鈉的甲醇溶液，105 ℃加熱至斑點顯色清晰，日光下檢視.

1.3 水分、總灰分、浸出物檢查

精密稱定各批次星狀風毛菊藥材粉末2.0 g，平行試驗2 份，依照《中華人民共和國藥典》四部2020 年版通則0832[6]烘干法測定11 批藥材水分；依照2302 總灰分測定法測定11 批藥材總灰分；依照2201 熱浸法，以45%乙醇為溶劑測定11 批藥材浸出物含量.

1.4 綠原酸含量測定

1.4.1 色譜條件

色譜柱：Shim-pack GIST C18（4.5 mm×260 mm，5 μm）；流動相：甲醇為A 相，0.1%乙酸-水為B 相；分離條件：A∶B（體積比為25∶75）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：326 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL.

1.4.2 對照品溶液配制

精密稱取綠原酸對照品10.0 mg，置于10 mL容量瓶中，加甲醇超聲溶解后定容，即得對照品儲備液（1.0 mg/mL）.

1.4.3 供試品溶液配制

精密稱定本品粉末（過5 號篩）1.0 g，置于具塞錐形瓶，精密加入50%乙醇50 mL，稱定重量，置于水浴中加熱回流1 h，放冷，再稱定重量，用50%乙醇補足減失的重量，搖勻，過0.45 μm 濾膜后待測.

2 結果與討論

2.1 定性鑒別

2.1.1 性狀鑒別

星狀風毛菊原植物及藥材性狀如圖1 所示.藥材根圓柱形，表皮黃褐色，斷面灰白色，有少量須根.幾乎無莖，葉皺縮，呈褐色，完整葉呈披針形，葉基部紫紅色，無毛.頭狀花序呈紫紅色，在蓮座狀葉叢中密集成半球形.瘦果，表面黑色.冠毛淡褐色，外層較短，糙毛狀，長約0.3～0.6 cm，內(nèi)層羽毛狀，長約0.8～1.3 cm.花果期為每年7～9 月.氣微，味微苦.

圖1 星狀風毛菊性狀鑒別圖（a）原植物形態(tài)，（b）藥材性狀Fig.1 Photos of Saussurea stella Maxim.(a) original plant morphology, (b) medicinal materials properties

2.1.2 顯微鑒別

通過光學顯微鏡，觀察星狀風毛菊藥材粉末樣品的結構特征，其顯微特征如圖2 所示.由圖2 可見，本品粉末呈棕褐色.花粉粒呈橢圓形或圓球形，外壁有短刺及疣狀雕紋，萌發(fā)孔3 個.導管短，多為環(huán)紋.非腺毛，單細胞.纖維成束，壁平直，含有草酸鈣方晶.木栓細胞較多，呈類長方形.淀粉團充滿細小淀粉粒.長管道狀分泌細胞，細胞內(nèi)充滿棕色物.表皮細胞呈長方形或多角形，均有氣孔.

圖2 星狀風毛菊顯微特征圖（a）花粉粒，（b）環(huán)紋導管，（c）非腺毛，（d）纖維束，（e）木栓細胞，（f）淀粉團，（g）長管道狀分泌細胞，（h）表皮細胞Fig.2 Microscopic characteristics images of Saussurea stella Maxim.(a) pollen grain, (b) annular vessel, (c) non-glandular hair, (d) fiber bundle, (e) cork cell, (f) starch granule,(g) secretory cell, (h) epidermal cell

2.1.3 薄層鑒別

按1.2 項下薄層鑒別方法進行分析，其結果如圖3 所示.可見供試品、綠原酸對照品色譜相應的位置上，顯相同的黃色斑點，且分離度高.

圖3 星狀風毛菊TLC 鑒別圖譜（S1～S11）供試品，（A）綠原酸對照品Fig.3 TLC identification of Saussurea stella Maxim.(S1～S11) test samples, (A) reference substance of chlorogenic acid

2.2 水分、灰分、浸出物測定

本試驗分別按照《中華人民共和國藥典》2020年版[6]水溶性浸出物、醇溶性（45%、稀乙醇、70%）浸出物測定法項下的冷浸法、熱浸法（附錄XA）測定浸出物.相比于冷浸法，熱浸法測定星狀風毛菊浸出物效果更佳，因此采用熱浸法提取.最終試驗結果表明，浸出物含量：45%乙醇浸出物＞水溶性浸出物＞稀乙醇浸出物＞70%乙醇浸出物.因此采用醇溶性浸出物測定法項下的熱浸法測定藥材浸出物.

11 批藥材水分、灰分、浸出物測定結果如表2所列.根據(jù)測定結果并結合《中華人民共和國藥典》2020 年版中藥材的標準，水分、總灰分均以平均值的120%設限，浸出物以平均值的80%設限，擬定星狀風毛菊藥材水分含量不得大于10.0%，灰分含有量均不得大于11.0%，醇溶性浸出物含有量不得小于16.0%.

表2 星狀風毛菊水分、灰分、浸出物和綠原酸含量測定結果Table 2 Determination results of water content, total ash,ethanol soluble extractives and chlorogenic acid/（%，n=2）

2.3 綠原酸含量測定

2.3.1 條件優(yōu)化

經(jīng)文獻調(diào)研，國內(nèi)外針對星狀風毛菊展開的研究較少，現(xiàn)有資料表明，星狀風毛菊主要含有黃酮、黃酮醇、木質(zhì)素、酚醛等多類成分[7-11]，但對其主要有效成分的研究未見報道.前期研究表明，星狀風毛菊全草乙醇浸提物用石油醚-乙酸乙酯-正丁醇萃取后由高效液相色譜儀（HPLC）檢測顯示化合物A、B 含量較高（如圖4 所示），經(jīng)核磁共振法鑒定以及文獻對比，確定化合物A、B 分別為洋薊素和綠原酸.現(xiàn)代藥理學研究綠原酸具有抗菌、抗病毒、利肝膽、抗腫瘤等作用[12-13]，而且對于創(chuàng)傷的治愈、潤滑關節(jié)、防止炎癥等有治療效果[14-15]，這與星狀風毛菊清熱利濕、解毒、接骨、消炎止血的功效相吻合.因此，本標準以綠原酸為指標成分考察星狀風毛菊藥材質(zhì)量具有合理性.

圖4 星狀風毛菊正丁醇相HPLC 色譜圖（A）洋薊素，（B）綠原酸Fig.4 HPLC chromatogram of n-butanol fraction of Saussurea stella Maxim.(A) cynarin, (B) chlorogenic acid

本試驗對星狀風毛菊藥材提取條件進行了優(yōu)化，分別測試了提取溶媒（40%～80%乙醇溶液）、提取方式（冷浸法、超聲提取法、加熱回流法）和提取時間（30、45、60、90 min）對綠原酸提取效率的影響，試驗結果如圖5 所示.最終選擇提取溶劑為50%乙醇，熱回流提取方法，加熱回流60 min 進行提取.

圖5 綠原酸提取方法考察（a）提取溶劑，（b）提取方式，（c）提取時間Fig.5 Study on extraction methods of chlorogenic acid(a) extraction solutions, (b) extraction methods, (c) extraction times

2.3.2 系統(tǒng)適用性

精密吸取對照品溶液、供試品溶液進行測定.結果如圖6 所示.結果表明，試樣中綠原酸與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，對稱因子在0.95～1.05區(qū)間內(nèi)，峰形對稱，理論塔板數(shù)≥8 000，符合藥典相關規(guī)定.

圖6 HPLC 色譜圖（a）對照品溶液，（b）供試品溶液，（1）綠原酸Fig.6 HPLC chromatograms(a) reference solution, (b) sample solution, (1) chlorogenic acid

2.3.3 線性關系考察

精密量取不同體積對照品溶液用甲醇稀釋并配制成系列濃度對照品工作液，質(zhì)量濃度分別為1.00、50.0、100、200、500 μg/mL.精密吸取對照品工作液各10 μL，注入HPLC 測定.以綠原酸質(zhì)量濃度X（μg/mL）為橫坐標，峰面積Y為縱坐標繪制標準曲線，得到線性回歸方程為Y=307 03X?116 887（R2=0.999 6，n=6）.結果表明，在1.00～500 μg/mL 范圍內(nèi)綠原酸質(zhì)量濃度與峰面積線性關系良好.

2.3.4 精密度試驗

精密吸取1.4.2 項下對照品溶液10 μL，注入HPLC 中測定，連續(xù)進樣6 次.測得綠原酸峰面積的相對標準偏差（RSD）為0.12%（n=6），表明儀器精密度良好.

2.3.5 重復性試驗

取樣品粉末（S11）6 份，按1.4.3 項下方法配制供試品溶液，測得供試品溶液中綠原酸含量均值為1.34%，RSD 為0.15%（n=6），表明該方法重復性良好.

2.3.6 穩(wěn)定性試驗

取同一份供試品溶液（S11）置于室溫，分別在0、2、4、8、12、24 h 進行測定，綠原酸峰面積RSD 為0.19%（n=6），表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定.

2.3.7 加樣回收試驗

采用加樣回收法，精密稱定已知含量的星狀風毛菊藥材粉末（S11）0.5 g，平行9 份，置具塞錐形瓶中，分別精密加入含有0.3、0.6、0.9 倍綠原酸的對照品溶液，按1.4.3 項下方法配制供試品溶液，進樣測定并計算回收率.結果如表3 所列，3 個添加水平的平均回收率在97.6%～98.7%范圍內(nèi)，表明試驗回收率良好，準確度高，符合藥典要求.

表3 綠原酸的回收率Table 3 Recoveries of chlorogenic acid

2.3.8 含量測定

取11 批樣品（S1～S11），按1.4.3 項下方法制備供試品溶液.精密吸取供試品溶液和對照品溶液各10 μL，按1.4.1 項下色譜條件進行測定.測定結果如表2 所列，11 批星狀風毛菊中綠原酸含量的測定結果均值為0.65%，按《中華人民共和國藥典》2020 年版規(guī)定將均值的80%擬為含量限度，即本品按干燥品計算，含綠原酸不低于0.50%.

3 結論

本試驗通過對青海、四川省多個采樣點星狀風毛菊藥材進行性狀描述、顯微鑒別及薄層色譜鑒別，可知該藥材性狀及顯微鑒別特征較為明顯，薄層色譜圖斑點清晰，分離度高，可作為星狀風毛菊藥材定性鑒別的依據(jù).通過對星狀風毛菊藥材水分、灰分及浸出物測定，初步確定各項限量.通過所建立的綠原酸含量測定方法，初步確定星狀風毛菊藥材指標性化學成分及限量要求，為民族藥星狀風毛菊藥材質(zhì)量標準的制定及進一步開發(fā)利用奠定基礎.