劉晶晶，李宗陽，劉麗梅，潘曉燕

1北華大學醫(yī)學技術(shù)學院，吉林吉林 132013 2吉林醫(yī)藥學院生殖醫(yī)學研究中心，吉林吉林 132013

卵泡是女性或雌性動物生育的基礎(chǔ)，卵泡發(fā)育異常是導(dǎo)致女性或雌性動物不育的直接原因。目前已發(fā)現(xiàn)越來越多的因素會影響卵泡發(fā)育，如肥胖、衰老、環(huán)境、飲食和藥物等均會不同程度地影響卵泡的生長發(fā)育，損傷卵泡細胞和卵母細胞中線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等重要細胞器，使細胞中過量活性氧積累，引起卵泡的凋亡和退化[1-2]。

褪黑素是由松果體分泌的吲哚胺，在正常生理狀態(tài)下，褪黑素受明暗環(huán)境的交替調(diào)節(jié)，具有晝低夜高的分泌規(guī)律。松果體可將合成的褪黑素直接分泌進入血液循環(huán)，褪黑素可分布于人體的許多組織中，包括女性的生殖系統(tǒng)[3-4]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素不僅調(diào)控著人的睡眠周期，而且作為抗氧化劑，可直接清除卵巢組織中過量的活性氧，提高卵泡抗氧化酶活性；通過與卵巢組織中褪黑素受體(melatonin receptor，MT)1和MT2結(jié)合，調(diào)控環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)、環(huán)鳥苷酸合成和磷脂酶C活性，增強卵巢組織代謝功能，促進卵泡發(fā)育和卵母細胞成熟，增強胚胎發(fā)育能力和延緩卵巢衰老[5-6]。褪黑素改善卵母細胞發(fā)育質(zhì)量，提高女性生育能力的作用越來越受到人們青睞和重視。

為使人們更深入地理解褪黑素在女性或雌性生殖過程中的重要作用，我們將從褪黑素對卵泡發(fā)育的作用機制和對卵泡功能的影響等方面展開論述，最后從緩解卵泡損傷的角度闡釋褪黑素臨床應(yīng)用前景。

褪黑素對卵泡發(fā)育的作用機制

褪黑素的抗氧化作用在卵泡生長發(fā)育過程中，活性氧可促進細胞存活、增殖和分化，有益于維持卵巢和卵泡的正常生理功能；但過量活性氧積累則會引起細胞氧化應(yīng)激，造成顆粒細胞凋亡、卵泡閉鎖和卵母細胞發(fā)育障礙[5]。卵泡液中存在著一定濃度的褪黑素，在臨排卵前和排卵過程中褪黑素的濃度最高[6]，這與其緩解排卵過程中過量活性氧對卵母細胞和顆粒細胞的氧化應(yīng)激損傷密切相關(guān)。褪黑素發(fā)揮抗氧化作用主要通過下面兩條途徑：(1)依靠自身的親水性和親脂性，自由通過細胞膜，直接清除卵泡中過量活性氧[6]；(2)通過與細胞膜上的受體結(jié)合，調(diào)節(jié)下游抗氧化信號通路，誘導(dǎo)多種抗氧化酶表達，減輕卵泡的氧化損傷[7]。

核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factorerythroid 2-related factor 2，Nrf2)/kelch樣ECH相關(guān)蛋白-1/血紅素加氧酶-1通路是細胞應(yīng)對氧化應(yīng)激的主要防御系統(tǒng)之一。褪黑素可通過與卵母細胞膜上特異性受體結(jié)合，激活Nrf2，進入細胞核，與細胞核中的抗氧化反應(yīng)元件結(jié)合，促進卵母細胞超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)1和血紅素加氧酶-1產(chǎn)生，減少玻璃化冷凍引起的卵母細胞氧化應(yīng)激損傷[8]。在豬卵丘-卵母細胞體外成熟期間，褪黑素和MT2結(jié)合，激活了Nrf2信號通路和過氧化物酶系，提高了過氧化氫酶(catalase，CAT)表達，清除了過量活性氧，顯著提高了卵母細胞的成熟質(zhì)量[9]。褪黑激素還能促進核結(jié)合位點視黃酸受體相關(guān)孤兒受體α表達，誘導(dǎo)CAT、SOD和谷胱甘肽過氧化物酶啟動子去甲基化，提高抗氧化酶表達，增強卵丘細胞的抗氧化能力[10]。

Nrf2：核因子E2相關(guān)因子2；MT1：褪黑素受體1型；MT2：褪黑素受體2型；Sirtuins：NAD +依賴性脫乙?；?；CAT：過氧化氫酶；SOD1：超氧化物歧化酶 1；HO-1：血紅素加氧酶-1；ROS：活性氧；E2：雌二醇；Bcl-2：B淋巴細胞瘤-2蛋白；Caspase-3：半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3；Bax：Bcl-2相關(guān)X蛋白；Bim：Bcl-2樣蛋白；P4：孕酮；AMH：抗繆勒管激素；BMP-15：骨形態(tài)發(fā)生蛋白-15；MPF：成熟促進因子；GDF-9：生長分化因子-9；mTOR：哺乳動物雷帕霉素靶蛋白

褪黑素可通過調(diào)控Sirtuins家族成員表達，緩解細胞氧化應(yīng)激，哺乳動物Sirtuins家族包括沉默信息調(diào)節(jié)因子(silent information regulator，SIRT)1～SIRT7 7個亞型，其中SIRT1是細胞代謝和氧化應(yīng)激的關(guān)鍵調(diào)控蛋白，在閉鎖卵泡顆粒細胞和肥胖動物卵泡中的表達顯著降低，與卵泡發(fā)育阻滯和卵泡儲備減少密切相關(guān)[11-13]。褪黑激素可激活SIRT1信號通路，提高Nrf2、血紅素加氧酶-1、SOD和谷胱甘肽過氧化物酶4蛋白表達，減少卵泡氧化應(yīng)激和卵泡閉鎖[14-16]，對卵巢早衰有明顯的保護作用。SIRT3也是調(diào)控細胞內(nèi)活性氧水平的重要蛋白，褪黑素可增強SIRT3活性，促進叉頭框蛋白O3與CAT和SOD2啟動子結(jié)合，提高CAT和SOD2表達，對衰老小鼠卵泡顆粒細胞具有明顯的抗氧化作用[17]。褪黑素還可通過調(diào)控Sirtuins家族成員，在氧化損傷的卵母細胞中發(fā)揮著重要的抗氧化作用，褪黑素能促進肥胖小鼠卵母細胞SIRT3蛋白的表達，抗氧化酶SOD基因發(fā)生去乙酰化，增加了SOD表達，減少卵母細胞線粒體氧化損傷[18]。褪黑素也可促進衰老小鼠卵母細胞中SIRT2表達，降低組蛋白H4K16的乙酰化水平，顯著緩解母體衰老引起的卵母細胞減數(shù)分裂缺陷[19]。

褪黑素具有親水、親脂特性，可在細胞膜、細胞核和線粒體等部位以高濃度形式聚集，緩解過量活性氧引起的顆粒細胞DNA 損傷、線粒體功能障礙和膜脂質(zhì)過氧化，改善苯諾沙普和殺蟲劑樂果誘導(dǎo)的卵母細胞減數(shù)分裂缺陷，維持老化卵母細胞與卵丘細胞之間的細胞交流[20-24]。總之，褪黑激素可通過多種途徑發(fā)揮其抗氧化特性，對哺乳動物卵泡發(fā)育具有重要保護作用。

褪黑素的抗凋亡作用卵巢中的卵泡除了正常的凋亡外，在氧化損傷、毒素或激素的異常刺激下，會誘發(fā)并促進卵泡凋亡，導(dǎo)致卵巢早衰、不排卵等，引起女性不孕。褪黑素可調(diào)控抗凋亡因子和促凋亡因子表達，減少卵泡閉鎖。B淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)蛋白家族在抑制卵母細胞、顆粒細胞凋亡以及卵泡閉鎖中起著重要的調(diào)控作用[25]。褪黑素可提高卵泡顆粒細胞中Bcl-2和促黃體素受體(luteinizing hormone receptor，LHR)基因表達，抑制熱應(yīng)激條件下卵泡顆粒細胞凋亡[20]。褪黑素也可顯著降低抗腫瘤藥物環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的顆粒細胞中半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3和Bcl-2相關(guān)X蛋白表達，提高Bcl-2水平，顯著抑制顆粒細胞凋亡[26]。褪黑素還能提高卵泡中自身受體蛋白表達，促進卵泡中Bcl-2產(chǎn)生，有效改善由順鉑誘導(dǎo)的卵巢氧化損傷和卵巢組織凋亡[27]。褪黑素在促進抗凋亡因子表達的同時，也會抑制促凋亡因子表達，并可促進促凋亡因子Bcl-2樣蛋白 11泛素化，降低促凋亡蛋白表達，抑制豬卵泡顆粒細胞凋亡[28]。

褪黑素可通過與受體結(jié)合來調(diào)節(jié)凋亡信號通路，對卵泡發(fā)揮抗凋亡作用。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白信號通路在調(diào)節(jié)卵泡顆粒細胞凋亡中起主要作用，褪黑激素可促進哺乳動物雷帕霉素靶蛋白信號通路相關(guān)基因表達，顯著上調(diào)細胞周期蛋白D1和Bcl-2水平，降低凋亡相關(guān)因子細胞周期依賴性蛋白激酶抑制因子1A、半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3、肌球蛋白樣Bcl-2 結(jié)合蛋白和微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-Ⅱ表達，從而增強卵泡顆粒細胞增殖[29-30]。褪黑素也可通過磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B途徑促進叉頭框蛋白O1的核輸出與磷酸化，從而阻斷自噬相關(guān)蛋白表達，抑制半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶8/9激活，防止氧化應(yīng)激時顆粒細胞自噬性死亡[31-32]。

褪黑素對卵泡功能的影響

褪黑素促進卵巢激素合成卵巢類固醇激素參與調(diào)控卵泡募集、發(fā)育和選擇等生理過程，褪黑素可通過下丘腦-垂體-性腺軸調(diào)節(jié)促性腺激素卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH)和黃體生成素分泌，調(diào)控雌激素合成，影響卵泡生長發(fā)育。褪黑素可激活青春期小鼠垂體絲裂原活化蛋白激酶1/2 信號通路，增加卵泡中促卵泡素β和細胞色素P450 19家族A亞家族肽1基因表達，促進FSH和雌二醇合成[33]。褪黑素也可激活蛋白激酶A-cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白信號通路，提高黃素化顆粒細胞中磷酸化cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白、芳香化酶的表達和雌二醇分泌[34]。對卵巢過度刺激綜合征的患者，褪黑素的抑制劑可顯著降低卵泡中雌二醇水平，緩解卵巢過度刺激綜合征發(fā)生[34]。排卵后，褪黑素可激活磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信號通路，上調(diào)類固醇激素合成急性調(diào)節(jié)蛋白表達，促進黃素化顆粒細胞合成和分泌孕酮，提高女性受孕能力[35]。

褪黑素參與調(diào)控顆粒細胞產(chǎn)生抗繆勒管激素(anti-Müllerian hormone，AMH)。顆粒細胞產(chǎn)生的AMH可抑制原始卵泡活化，降低卵泡對FSH的敏感性，從而維持卵巢中一定數(shù)量的原始卵泡和生長卵泡，防止原始卵泡過度耗盡[26]?？鼓[瘤藥物環(huán)磷酰胺會降低卵巢中AMH水平，促使原始卵泡過度激活，造成原始卵泡丟失和顆粒細胞凋亡，經(jīng)褪黑素處理后，顯著提高了卵巢AMH水平，對環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的原始卵泡丟失具有明顯的保護作用[26]；褪黑素也可通過SIRT1信號通路提高卵巢中AMH水平，改善卵巢早衰，保護女性生育能力[16]。

褪黑素可提高卵巢中自身受體和促性腺激素受體的表達。在顆粒細胞的體外培養(yǎng)液中添加褪黑素，可顯著增加顆粒細胞上MT1 和 MT2的表達，促進孕酮的合成和分泌，抑制顆粒細胞凋亡[36]。褪黑素可顯著增加顆粒細胞中LHR表達水平，顯著降低顆粒細胞上卵泡刺激素受體表達[37-38]。褪黑素還可以通過對自身受體和促性腺激素受體表達的調(diào)控，調(diào)節(jié)卵泡顆粒細胞的生長和發(fā)育。

褪黑素促進卵泡細胞因子和成熟促進因子分泌卵泡通過自分泌/旁分泌產(chǎn)生細胞因子骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)-15和生長分化因子-9，參與調(diào)節(jié)顆粒細胞、卵母細胞和膜細胞的生長發(fā)育、分化和排卵等生理過程。BMP-15是卵泡生長黃素化的抑制因子，可降低腺苷酸環(huán)化酶的活性，下調(diào)FSH對卵泡的刺激，抑制孕酮合成[39]。褪黑素可通過Smad途徑減弱BMP-6對孕酮合成的抑制作用，參與維持卵巢功能[39]。褪黑素可顯著提高卵母細胞MT1表達，增加環(huán)鳥苷酸、BMP-15和生長分化因子-9的表達水平，促進卵母細胞體外成熟[40-41]。

褪黑素通過調(diào)控卵母細胞成熟促進因子表達，促進卵母細胞減數(shù)分裂恢復(fù)[42]。在卵母細胞成熟過程中，褪黑素可增加孕酮分泌，促進卵母細胞成熟促進因子合成和卵泡的破裂排卵[43]。在豬卵母細胞的體外培養(yǎng)液中添加褪黑素，可顯著提高絲裂原激活蛋白激酶表達，上調(diào)卵母細胞中成熟促進因子水平，促進卵母細胞減數(shù)分裂恢復(fù)和卵母細胞體外成熟，提高卵母細胞的發(fā)育潛力[44]。

褪黑素促進顆粒細胞發(fā)育顆粒細胞是卵泡的主要功能細胞，可合成類固醇激素和多種生長因子，為卵母細胞生長發(fā)育和成熟提供良好的微環(huán)境。褪黑素可降低顆粒細胞中抑制素α、抑制素βB 、FSH受體和轉(zhuǎn)化生長因子β受體3的表達，下調(diào)顆粒細胞中抑制素β和激活素B的豐度，降低顆粒細胞對FSH刺激的敏感度，同時提高顆粒細胞中LHR和抑制素βA的表達，增加顆粒細胞對孕酮的分泌，促進顆粒細胞分化[45]。褪黑素也可促進G蛋白偶聯(lián)雌激素受體1和抗增殖蛋白2表達，使得顆粒細胞周期停滯，避免顆粒細胞過早分化，同時也可通過延緩線粒體蛋白合成，使竇卵泡顆粒細胞處于緩慢生長階段[46-47]。褪黑素還可調(diào)控細胞基質(zhì)受體和磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信號通路，影響血管形成和黃體細胞外基質(zhì)重塑，調(diào)節(jié)顆粒細胞黃素化[48]。褪黑素也可上調(diào)B淋巴細胞瘤超大型蛋白、Bcl-2、谷胱甘肽過氧化物酶4和SOD1蛋白的表達，降低半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3、Bcl-2相關(guān)X蛋白和腫瘤蛋白53的表達，抑制顆粒細胞凋亡[45]。由此可見，褪黑素通過多種途徑調(diào)控著卵巢顆粒細胞的生長發(fā)育、增殖分化和凋亡。

褪黑素促進卵母細胞成熟在卵母細胞減數(shù)分裂過程中，核小體間相互作用、染色體分離等都受到組蛋白乙?；揎椀恼{(diào)控[49]。在自然衰老的小鼠中，乙?；M蛋白H4K16過表達會引起卵母細胞減數(shù)分裂缺陷，褪黑素可通過提高去乙?；窼IRT2表達而降低H4K16的乙酰化水平，減少與母體衰老相關(guān)的卵母細胞減數(shù)分裂缺陷，顯著提高老化卵母細胞的成熟質(zhì)量[49]。褪黑素與卵母細胞上 MT1結(jié)合，可提高卵丘細胞擴展相關(guān)基因透明質(zhì)酸合成酶1和穿透素3表達水平，促進卵丘細胞擴展，增加表皮生長因子受體和LHR表達，促進卵母細胞減數(shù)分裂的關(guān)鍵基因減數(shù)分裂阻滯蛋白1表達，提高卵母細胞的成熟率[41，50-51]。

褪黑素可參與調(diào)控卵母細胞中cAMP水平，從而促進卵母細胞減數(shù)分裂恢復(fù)和卵母細胞成熟[52]。網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用也參與調(diào)節(jié)cAMP的表達，抑制網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用可提高cAMP水平，抑制卵母細胞成熟[53]。褪黑素可促進卵母細胞中網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用相關(guān)蛋白網(wǎng)格蛋白輕鏈B、動力蛋白2和銜接蛋白2的表達，降低cAMP水平，促進卵母細胞成熟[52]。褪黑素也可通過MT1介導(dǎo)，降低卵母細胞中cAMP 水平，恢復(fù)卵母細胞減數(shù)分裂，促進核成熟[54]。有趣的是，褪黑素具有提高體外成熟卵母細胞產(chǎn)生的早期胚胎發(fā)育能力，而對體內(nèi)成熟卵母細胞產(chǎn)生的胚胎作用卻不明顯，說明目前卵母細胞的體外成熟條件還不完善，褪黑素可能成為保護卵母細胞體外發(fā)育的重要添加物[55]。

褪黑素對臨床卵巢卵泡損傷的治療潛能

環(huán)境、藥物、疾病和衰老等因素可引起卵巢/卵泡損傷，進而影響女性或雌性動物的生育。褪黑素作為一種內(nèi)源性分泌激素，在睪丸、卵巢和子宮上均存在結(jié)合位點，對生殖活動具有重要的調(diào)控作用[37]。臨床上，卵胞漿內(nèi)單精子注射患者在取卵前3個月口服肌醇和褪黑素，卵胞漿內(nèi)單精子注射后再連續(xù)口服褪黑素和維生素D 3個月，可顯著改善患者卵母細胞和囊胚的質(zhì)量，提高臨床妊娠率[56]。對反復(fù)產(chǎn)生低質(zhì)量胚胎患者，獲取卵母細胞體外受精后，在培養(yǎng)液中添加褪黑素，培養(yǎng)5～7 d，可顯著提高患者卵裂第3天高質(zhì)量胚胎的發(fā)育率、可移植囊胚的發(fā)育率和臨床妊娠率[57]。在冷凍解凍后的卵裂第3天胚胎的培養(yǎng)液中添加褪黑素，培養(yǎng)3 d，可顯著提高冷凍解凍后卵裂胚的囊胚發(fā)育率[57]。卵巢儲備功能下降的患者，從取卵前1個月經(jīng)周期的第5天開始，每天晚上口服褪黑素，一直服用到取卵，可顯著增加取卵時患者體內(nèi)的雌激素水平和減數(shù)分裂Ⅱ的中期卵母細胞獲得率[58]。

在輔助生殖技術(shù)領(lǐng)域，褪黑素可以保護卵母細胞和顆粒細胞的正常發(fā)育，減輕卵母細胞紡錘體和染色體異常，緩解冷凍保存帶來的卵母細胞和胚胎發(fā)育損傷，提高妊娠率。褪黑素在臨床上為多囊卵巢綜合征患者、卵巢儲備功能下降患者和體外受精反復(fù)失敗患者提供了一種潛在的拯救策略，為廣大不孕癥患者帶來了新的希望[59]。

小 結(jié)

褪黑素對卵泡發(fā)揮著抗氧化、抗凋亡和激活促卵泡生長發(fā)育的信號通路的作用，調(diào)控著卵泡生長、發(fā)育和閉鎖等重要生理過程(圖1)。褪黑素不僅能促進卵母細胞成熟，也能通過表觀遺傳的調(diào)控機制保證核成熟的質(zhì)量，減少減數(shù)分裂異常發(fā)生。在輔助生殖技術(shù)領(lǐng)域，外源性褪黑素補充劑能保護卵泡生長發(fā)育，改善卵母細胞質(zhì)量，增加受精率和優(yōu)質(zhì)胚胎的數(shù)量，提高女性妊娠率。隨著褪黑素在生殖調(diào)控分子機制研究的不斷深入，將會進一步推動褪黑素臨床的廣泛使用，為廣大不孕不育癥女性患者帶來新的福音。