徐 娜,宋雪杰,司季青,王芝敏,張曉靜,梁 雪,司富春,趙 化

(1.河南省生殖健康科學(xué)技術(shù)研究院,河南 鄭州450002; 2.河南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥科學(xué)院河南省中醫(yī)方證信號(hào)傳導(dǎo)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河南 鄭州 450046; 3.河南省中醫(yī)院,河南 鄭州 450002)

雌激素主要由卵巢顆粒細(xì)胞合成和分泌,雌二醇(estradiol,E2)是雌激素中生物活力最強(qiáng)的類固醇激素,具有抗雄激素、促進(jìn)子宮內(nèi)膜增生、增強(qiáng)子宮平滑肌收縮等作用[1-3]。當(dāng)前生活習(xí)慣、環(huán)境等因素影響下,E2低水平導(dǎo)致的多囊卵巢綜合征、不孕、卵巢早衰等成為育齡女性的常見疾病,其中多囊卵巢綜合征的發(fā)病率較高。據(jù)報(bào)道,世界女性多囊卵巢綜合征發(fā)病率為4%～12%,占育齡期女性的5%～10%,由其導(dǎo)致的不孕占無排卵性不孕的50%～70%。此外,卵巢早衰發(fā)病率為1%～3%[4-6]。對(duì)于E2低水平所致的多囊卵巢綜合征等疾病,目前西醫(yī)學(xué)多采用激素藥物對(duì)癥治療,顯效較慢,易復(fù)發(fā),有高排卵率、高流產(chǎn)率、低妊娠率等不良反應(yīng)。深入研究可促進(jìn)E2分泌的治療方法和有效藥物是治療該類疾病的關(guān)鍵。前期筆者從調(diào)節(jié)卵巢顆粒細(xì)胞性激素分泌的295種中藥中篩選出當(dāng)歸、山茱萸、白芍、女貞子、龜板、清半夏、浙貝母、川芎、牡丹皮、赤芍、丹參、柴胡12味有效中藥組成當(dāng)歸半夏湯。本研究在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步優(yōu)化篩選,研制能調(diào)節(jié)E2分泌的高效方劑,并研究其對(duì)E2分泌的調(diào)節(jié)作用,以期為此類疾病的臨床治療、研究和藥物開發(fā)提供有效實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。卵巢顆粒細(xì)胞是卵巢的主要功能細(xì)胞,其增殖與分化直接影響卵泡的生長(zhǎng)啟動(dòng)、發(fā)育、排卵、黃體形成及甾體激素分泌等活動(dòng)。本實(shí)驗(yàn)選取可分泌E2的人卵巢癌細(xì)胞HO-8910作為研究對(duì)象。

1 材料與方法

1.1 細(xì) 胞

人卵巢癌細(xì)胞HO-8910,購自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心。

1.2 藥品、試劑及儀器

當(dāng)歸半夏湯藥物組成:當(dāng)歸、山茱萸、白芍、女貞子、龜板、清半夏、浙貝母、川芎、牡丹皮、赤芍、丹參、柴胡。藥材均購自河南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院。取上述12味中藥各50 g,分別避光浸泡于250 mL 體積分?jǐn)?shù) 950 mL /L乙醇中;振蕩,2次/d;7 d天后將每味中藥的乙醇提取物過濾,旋蒸,濃縮,干燥;待藥物充分干燥后,稱取適量中藥,先配制成300 g/L的二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)藥液,再用培養(yǎng)基稀釋成4 g/L的藥物儲(chǔ)備液;0.22 μm濾頭過濾除菌,-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?實(shí)驗(yàn)時(shí)配制成所需質(zhì)量分?jǐn)?shù)的藥液。950 mL /L 分析純乙醇,天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司產(chǎn)品,批號(hào)20201210;RPMI 1640培養(yǎng)基,賽默飛世爾科技公司GIBCO品牌產(chǎn)品,批號(hào)2333386;胎牛血清,上海雙洳生物科技有限公司LONSERA胎牛血清,批號(hào)OH12343;胰蛋白酶、青鏈霉素混合液(100×)、噻唑藍(lán)溴化四唑(MTT)、DMSO,均為北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品,批號(hào)依次為12271041、20200626、917Q057、1121E0333。RE-6000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品;DK-S24型電熱恒溫水浴鍋,上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品;DZF-6050型真空干燥箱,德國(guó)賓德公司產(chǎn)品;HERA cell 150Heraeus細(xì)胞培養(yǎng)箱,美國(guó)科峻公司(Kendro)產(chǎn)品;Axiovert25倒置熒光顯微鏡,蔡司光學(xué)儀器(上海)國(guó)際貿(mào)易有限公司產(chǎn)品;EPOCH型酶標(biāo)儀,美國(guó)伯騰儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

將細(xì)胞置于體積分?jǐn)?shù) 50 mL /L CO2、37 ℃、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng),當(dāng)細(xì)胞匯合率為70%～80%時(shí),給予含乙二胺四乙酸胰蛋白酶消化傳代處理,2～3 d傳代1次。細(xì)胞消化處理后,使用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)算細(xì)胞濃度,取1×106個(gè)細(xì)胞接種于直徑10 cm培養(yǎng)皿中,顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)。

1.4 當(dāng)歸半夏湯中單味中藥的篩選

設(shè)空白對(duì)照組和加藥組,每組3個(gè)復(fù)孔。取生長(zhǎng)旺盛的HO-8910細(xì)胞,用胰蛋白酶消化處理為單細(xì)胞懸液,用不含血清的1640培養(yǎng)基以1×104個(gè)細(xì)胞/孔接種于1.5 mL EP管中,100 μL/孔,置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)50 mL /L CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。適應(yīng)性培養(yǎng)30 min后,空白對(duì)照組每孔加100 μL 1640培養(yǎng)基;加藥組將當(dāng)歸半夏湯中12味待選中藥儲(chǔ)備液配成質(zhì)量分?jǐn)?shù)200 mg/L的工作液,每孔加入100 μL,使藥物最終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100 mg/L;繼續(xù)培養(yǎng)24 h;將EP管以離心半徑5 cm、轉(zhuǎn)速1 000 r/min離心10 min,收集細(xì)胞上清。采用放射免疫測(cè)定(radioimmunoassay,RIA)法測(cè)定各組上清液中E2含量,篩選出對(duì)HO-8910細(xì)胞增殖無顯著影響但可促進(jìn)E2分泌的藥物。中藥促進(jìn)細(xì)胞E2分泌百分比(%)=(加藥組單位細(xì)胞分泌E2水平-空白對(duì)照組單位細(xì)胞分泌E2水平)/空白組單位細(xì)胞分泌E2水平×100%

1.5 單味藥量效關(guān)系檢測(cè)

取生長(zhǎng)旺盛的HO-8910細(xì)胞,用胰蛋白酶消化處理為單細(xì)胞懸液,用不含血清的1640培養(yǎng)基以1×104個(gè)細(xì)胞/孔接種于96孔培養(yǎng)板,100 μL/孔,置于37℃、50 mL /L CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。設(shè)空白對(duì)照組和加藥組,每組3個(gè)復(fù)孔。根據(jù)1.4項(xiàng)下藥材篩選結(jié)果,把各入選藥物分別配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.125、6.25、12.5、25、50、100、200、400 mg/L 8個(gè)梯度藥液,進(jìn)行藥物劑量-藥理效應(yīng)實(shí)驗(yàn)。加藥方法同1.4,空白對(duì)照組每孔加100 μL 1640培養(yǎng)基,中藥組加入不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)藥液,繼續(xù)培養(yǎng)24 h;收集細(xì)胞上清,采用RIA法測(cè)E2水平;收集上清,每孔加入100 μL MTT,培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h后去掉上清;每孔加入150 μL DMSO溶液,酶標(biāo)儀測(cè)定OD值。計(jì)算空白對(duì)照組和加藥各組單位細(xì)胞分泌E2水平(即E2水平/相應(yīng)OD值)。采用GraphPad Prism 8.0.1軟件,以藥物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為橫坐標(biāo)、藥物促進(jìn)HO-8910細(xì)胞E2分泌百分比為縱坐標(biāo)繪制劑量-效應(yīng)關(guān)系曲線,求出單味藥促進(jìn)E2分泌的半數(shù)效應(yīng)濃度(median effect concentration,EC50)。

1.6 當(dāng)歸半夏湯全方及拆方對(duì)HO-8910細(xì)胞E2分泌的量效關(guān)系

將1.4項(xiàng)下篩選出的8味中藥按照功效分為補(bǔ)腎養(yǎng)血(酒萸肉、當(dāng)歸、白芍)、化痰(浙貝母、清半夏)和活血(丹參、牡丹皮、赤芍)3類,分別組成補(bǔ)腎養(yǎng)血方、化痰方和活血方。設(shè)3個(gè)拆方組和1個(gè)全方組,分別以各組方中單味藥EC50值的0.031 25、0.062 5、0.125、0.25、0.5、1、2、4倍的量進(jìn)行混合,同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組,每組3個(gè)復(fù)孔。加藥和結(jié)果測(cè)定方法同1.5,計(jì)算空白對(duì)照組和加藥各組HO-8910細(xì)胞分泌的E2水平。采用GraphPad Prism 8.0.1軟件,以藥物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為橫坐標(biāo)、藥物促進(jìn)HO-8910細(xì)胞E2分泌百分比為縱坐標(biāo)繪制劑量-效應(yīng)關(guān)系曲線,求出當(dāng)歸半夏湯全方和補(bǔ)腎養(yǎng)血、化痰、活血拆方的EC50。

1.7 當(dāng)歸半夏湯全方及拆方對(duì)HO-8910細(xì)胞E2分泌作用的時(shí)效關(guān)系

全方組及拆方組分別以各組方中單味藥EC50值進(jìn)行混合,同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組,每組3個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞處理和加藥同1.5,采用MTT比色法檢測(cè)12、24、36、48、60、72 h 6個(gè)時(shí)間點(diǎn)全方及3個(gè)拆方促進(jìn)HO-8910細(xì)胞E2分泌百分比,繪制時(shí)效關(guān)系曲線,確定時(shí)間-藥效關(guān)系。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism 8.0.1軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)算EC50[7]。

2 結(jié) 果

2.1 當(dāng)歸半夏湯中單味中藥的篩選結(jié)果

以質(zhì)量分?jǐn)?shù)100 mg/L的各單味中藥作用24 h,得到對(duì)HO-8910細(xì)胞增殖無顯著影響但對(duì)E2分泌有明顯促進(jìn)作用的8味中藥,分別是酒萸肉、當(dāng)歸、白芍、浙貝母、清半夏、丹參、赤芍和牡丹皮。見表1。此8味中藥作用HO-8910細(xì)胞24 h,對(duì)細(xì)胞形態(tài)無顯著影響,細(xì)胞呈不規(guī)則橢圓形或梭形,核漿比較豐富。

表1 當(dāng)歸半夏湯中12味中藥對(duì)HO-8910細(xì)胞分泌E2的影響

2.2 8種中藥與HO-8910細(xì)胞E2分泌的量效關(guān)系

8味中藥對(duì)HO-8910細(xì)胞E2分泌的促進(jìn)作用隨著藥物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而增強(qiáng),見表2。經(jīng)GraphPad Prism 8.0.1統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算,各單味藥的EC50分別是:酒萸肉 198.7 mg/L,當(dāng)歸 162.8 mg/L,白芍342.1 mg/L,浙貝母116.5 mg/L,清半夏 486.8 mg/L,丹參 82.83 mg/L,牡丹皮 143.9 mg/L,赤芍 218.8 mg/L。

表2 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的8種藥物促進(jìn)HO-8910細(xì)胞E2分泌百分比

2.3 當(dāng)歸半夏湯全方及拆方與HO-8910細(xì)胞E2分泌的量效關(guān)系

補(bǔ)腎養(yǎng)血方、化痰方、活血方及當(dāng)歸半夏湯全方均可促進(jìn)HO-8910細(xì)胞E2分泌,對(duì)E2分泌的促進(jìn)作用隨藥物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而增強(qiáng),見表3和圖1。作用大小依次為:全方>活血方>補(bǔ)腎養(yǎng)血方>化痰方。補(bǔ)腎養(yǎng)血方組、化痰方、活血方及全方所含各單位中藥的EC50依次是上述2.2項(xiàng)下量效關(guān)系得出的單位中藥EC50的0.47、0.90、0.30、0.19倍。

圖1 當(dāng)歸半夏湯全方及拆方促進(jìn)HO-8910細(xì)胞

表3 不同劑量當(dāng)歸半夏湯全方及拆方促進(jìn)HO-8910細(xì)胞E2分泌百分比

2.4 當(dāng)歸半夏湯全方及拆方與HO-8910細(xì)胞E2分泌的時(shí)效關(guān)系

補(bǔ)腎養(yǎng)血方、化痰方、活血方及全方均可促進(jìn)HO-8910細(xì)胞E2分泌,對(duì)E2分泌的促進(jìn)作用在12～48 h之間隨時(shí)間的增加而增強(qiáng),見表4和圖2。

圖2 當(dāng)歸半夏湯全方及拆方促進(jìn)HO-8910細(xì)胞E2分泌時(shí)效關(guān)系對(duì)比

表4 不同作用時(shí)間當(dāng)歸半夏湯全方及拆方促進(jìn)HO-8910細(xì)胞E2分泌百分比

3 討 論

E2是雌激素中最主要、活性最強(qiáng)的激素?；贓2在生殖系統(tǒng)中的重要作用,本研究運(yùn)用可分泌E2的人卵巢癌細(xì)胞HO-8910建立調(diào)節(jié)E2分泌的藥物篩選方法,在前期初步篩選所得12味有效中藥基礎(chǔ)上進(jìn)一步篩選,得到可促進(jìn)HO-8910細(xì)胞E2分泌的酒萸肉、當(dāng)歸、白芍、浙貝母、清半夏、丹參、赤芍、丹皮8味中藥,并探究其與E2水平的量效和時(shí)效關(guān)系,為E2低水平導(dǎo)致的不孕、卵巢早衰、多囊卵巢綜合征、月經(jīng)不調(diào)等疾病臨床治療和藥物研發(fā)提供新的依據(jù)。由8種中藥組成的當(dāng)歸半夏湯及補(bǔ)腎、化痰、活血拆方與多囊卵巢綜合征、卵巢早衰、不孕的中醫(yī)病機(jī)相合。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為,腎主生殖,為先天之本。腎中精氣充盈,滋養(yǎng)五臟六腑,維持正常的生長(zhǎng)發(fā)育。對(duì)于女性而言,腎精充足,腎陰腎陽得以相互轉(zhuǎn)化,滋養(yǎng)天癸,沖任調(diào)暢,經(jīng)水應(yīng)期而至,正常行經(jīng)受孕。若腎中精氣虧虛,腎陰腎陽失衡,轉(zhuǎn)化不利,則會(huì)引起人體生長(zhǎng)和生殖機(jī)能障礙。腎陰是卵泡生長(zhǎng)發(fā)育的物質(zhì)基礎(chǔ),能滋養(yǎng)孕卵促其生長(zhǎng)成熟;腎陽是卵子排出的內(nèi)在動(dòng)力,能鼓動(dòng)卵子順利排出;因此,腎虛是生殖內(nèi)分泌功能異常、雌激素分泌異常的主要原因[8-10]。同時(shí),腎為水臟,與體內(nèi)水液調(diào)控密切相關(guān)。若腎氣不足,腎陽虛損影響氣化功能,蒸騰氣化失司而影響津液代謝,濕邪停滯,阻遏氣機(jī),則聚集成痰;此外,氣虛血瘀,瘀血凝滯胞宮或濕濁流注沖任胞宮,使沖任失調(diào),引起月經(jīng)失調(diào);或腎虛不能攝精成孕,而致不孕。因此,治療E2分泌水平低導(dǎo)致的不孕、卵巢早衰、多囊卵巢綜合征、月經(jīng)不調(diào)等疾病,應(yīng)順應(yīng)腎中陰陽消長(zhǎng)的生理變化,進(jìn)行補(bǔ)腎、活血、化痰[11-13]。酒萸肉補(bǔ)益肝腎,固沖任;當(dāng)歸補(bǔ)血調(diào)經(jīng);白芍?jǐn)筷庰B(yǎng)血;酒萸肉、當(dāng)歸、白芍補(bǔ)肝腎,養(yǎng)血;浙貝母清熱化痰;生半夏燥濕化痰;丹參活血調(diào)經(jīng);牡丹皮、赤芍活血祛瘀。8味藥共奏補(bǔ)腎養(yǎng)血、化痰活血之效。雌激素分泌減少是育齡婦女發(fā)生生殖內(nèi)分泌功能異常疾病的主要原因,本研究得出的當(dāng)歸半夏湯可為雌激素減少而引起的生殖內(nèi)分泌功能異常所致的不孕、月經(jīng)紊亂等的臨床治療、研究和藥物開發(fā)提供了研究基礎(chǔ)。