喻錦嫻, 俞 梅, 李 娜

(湖北省武漢市中醫(yī)醫(yī)院口腔科, 湖北 武漢 430000)

牙周炎是一種常見的慢性炎癥性疾病,其特征是牙槽骨缺失和牙齒松動(dòng)[1],如果不及時(shí)治療,將最終導(dǎo)致牙齒脫落。目前常通過(guò)清除牙菌斑,藥物消除牙齦炎癥對(duì)牙周炎進(jìn)行干預(yù),常用抗生素消除炎癥,然而抗生素長(zhǎng)期使用會(huì)產(chǎn)生耐藥性[2],為了解決此問(wèn)題,中藥因副作用相對(duì)較小走進(jìn)人們視野。川陳皮素是一種多甲氧基黃酮,具有抗炎、抗氧化、抗病毒功能,據(jù)報(bào)道,川陳皮素可抑制白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)刺激的人牙周韌帶細(xì)胞中的炎癥反應(yīng)[3]。但川陳皮素對(duì)體內(nèi)牙周炎模型的研究尚未見報(bào)道。趨化因子在炎癥過(guò)程中至關(guān)重要,它們可使免疫炎癥細(xì)胞充分募集到微生物感染部位,例如牙齦。然而,在C-C趨化因子配體2(C-C Chemokine ligand 2,CCL2)等趨化因子的調(diào)節(jié)下,大量免疫細(xì)胞聚集在炎癥部位,導(dǎo)致炎癥反應(yīng)持續(xù)放大,因此CCL2已成為包括牙周炎在內(nèi)的炎癥性疾病的治療靶點(diǎn)[4]。有研究表明與牙周健康部位相比,人和大鼠牙周炎部位的牙齦中發(fā)現(xiàn)更高水平的CCL2[5]。因此,抑制CCL2表達(dá)有可能為牙周炎治療提供新的思路。本文通過(guò)構(gòu)建牙周炎大鼠研究川陳皮素在牙周炎大鼠中發(fā)揮的抗炎作用及其可能機(jī)制,以期為牙周炎的治療提供實(shí)驗(yàn)參考。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:SPF級(jí)雄性SD大鼠50只,體重(200±20)g,購(gòu)自三峽大學(xué)(許可證號(hào)SCXK(鄂)2022—0012)。大鼠飼養(yǎng)溫度在18～24℃,相對(duì)濕度在40%～70%,每日光照12h,不限飲水,定時(shí)供給普通飼料。本研究經(jīng)武漢市中醫(yī)醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào)20220315)。

1.2主要試劑:川陳皮素(純度>98%)購(gòu)自成都瑞芬思生物科技有限公司;蘇木素伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色試劑盒購(gòu)自碧云天公司;DAB顯色劑購(gòu)自中衫金橋;Anti-CCL2抗體購(gòu)自Abcam公司;C-C趨化因子受體2(C-C Chemokine acceptor 2,CCR2)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、IL-6、β-actin抗體購(gòu)自CST公司。

1.3方 法

1.3.1牙周炎大鼠模型建立:采用絲線結(jié)扎聯(lián)合10%蔗糖飲水建立牙周炎模型:戊巴比妥鈉將大鼠進(jìn)行麻醉并將大鼠固定好,在大鼠上頜左邊第二和三磨牙間穿過(guò)3-0的絲線,結(jié)扎第二磨牙,并將大鼠飲水換為10%蔗糖水溶液,每天檢查結(jié)扎是否在原位置,如果發(fā)現(xiàn)脫落應(yīng)重新及時(shí)結(jié)扎,4周后觀察大鼠出現(xiàn)牙齒松動(dòng)、牙齦紅腫出血和牙槽骨吸收現(xiàn)象,表明牙周炎大鼠模型構(gòu)建成功。

1.3.2分組:將50只大鼠分為對(duì)照組、模型組、川陳皮素低劑量組、川陳皮素中劑量組、川陳皮素高劑量組,每組10只。除對(duì)照組外,其他4組建立牙周炎模型。造模成功后開始給藥,川陳皮素低劑量組、川陳皮素中劑量組、川陳皮素高劑量組每天分別灌胃25、50、100mg/kg川陳皮素;對(duì)照組、模型組每天灌胃等量生理鹽水。

1.3.3HE染色檢測(cè)各組大鼠牙周組織病理形態(tài)變化:灌胃結(jié)束后,取各組大鼠上頜組織,PBS漂洗后固定于10%甲醛中,48h后進(jìn)行脫鈣處理,1個(gè)月后進(jìn)行石蠟切片,HE染色,觀察牙周組織病理形態(tài)變化,包括炎性細(xì)胞浸潤(rùn)以及牙槽骨吸收情況。

1.3.4免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)各組大鼠牙周組織CCL2表達(dá):取石蠟切片,抗原修復(fù),滴加3%雙氧水溶液,山羊血清封閉,加入一抗CCL2(1∶100),4℃下過(guò)夜孵育,加入HRP標(biāo)記二抗(1∶200),37℃下孵育1h,DAB顯色,蘇木素復(fù)染,封片,光鏡下觀察拍照,CCL2陽(yáng)性染色為棕黃色。

1.3.5qPCR檢測(cè)各組大鼠牙周組織CCL2、CCR2、TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA水平:Trizol裂解各組大鼠牙周組織,提取細(xì)胞總RNA,將RNA反轉(zhuǎn)錄得到cDNA,以cDNA為模板進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)CCL2、CCR2、TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表達(dá),內(nèi)參為β-actin。引物如下:CCL2正向5'-AAACCAGCCAACTCTCACT-3';反向5'-GTAGTTCTCCAGCCGACTC-3'。CCR2正向5'-TGTGAAGCAAATTGGAGCTTGG-3';反向5'-GAATGGGAGTGTGAGCAGGAA-3'。TNF-α正向5'-TCTTCTCATTCCTGCTCGTG-3';反向5'-GAGGCTGACTTTCTCCTGGT-3'。IL-1β正向5'-CTATGTCTTGCCCGTGGAG-3';反向5'-CTGCTTGAGAGGTGCTGATG-3'。IL-6正向5'-CCACTGCCTTCCCTCTTCA-3';反向5'-TCTTGGTCCTTAGCCACTCC-3'。β-actin正向5'-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3';反向5'-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3'。采用2-ΔΔCT計(jì)算CCL2、CCR2、TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.3.6Western blot檢測(cè)各組大鼠牙周組織CCL2、CCR2、TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白表達(dá):RIPA裂解各組大鼠牙周組織,提取蛋白,將蛋白定量后進(jìn)行Western blot檢測(cè)CCL2、CCR2蛋白水平,操作如下:SDS-PAGE凝膠電泳,轉(zhuǎn)膜,脫脂乳封閉,4℃過(guò)夜孵育一抗CCL2、CCR2、TNF-α、IL-1β、IL-6(均1∶1000稀釋),室溫孵育二抗(1∶2000)1h,ECL將膜顯色,凝膠成像系統(tǒng)保留圖像,Image J軟件分析蛋白灰度值。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠牙周組織病理形態(tài)比較:對(duì)照組牙周組織結(jié)構(gòu)正常,未見明顯病理?yè)p傷;與對(duì)照組相比,模型組大鼠牙周組織出現(xiàn)牙槽骨吸收,有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn);與模型組相比,川陳皮素低、中、高劑量組大鼠牙周組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)逐漸減輕,成纖維細(xì)胞數(shù)量逐漸增加,見圖1。

圖1 HE染色檢測(cè)各組大鼠牙周組織病理形態(tài)(100×)

2.2各組大鼠牙周組織CCL2、CCR2、TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA水平比較:與對(duì)照組相比,模型組大鼠牙周組織CCL2、CCR2、TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA水平顯著升高(P<0.05);與模型組相比,川陳皮素低、中、高劑量組大鼠牙周組織CCL2、CCR2、TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA水平顯著降低(P<0.05),見表1。

表1 各組大鼠牙周組織CCL2 CCR2 TNF-α IL-1β IL-6 mRNA水平比較

2.3各組大鼠牙周組織CCL2表達(dá)比較:免疫組化染色結(jié)果顯示,CCL2陽(yáng)性染色為胞質(zhì)內(nèi)呈現(xiàn)棕黃色或棕色顆粒,上皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞中均可見CCL2陽(yáng)性表達(dá)。與對(duì)照組相比,模型組大鼠牙周組織CCL2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目增多;與模型組相比,川陳皮素低、中、高劑量組大鼠牙周組織CCL2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目減少,見圖2和表2。

圖2 免疫組化染色檢測(cè)CCL2在大鼠牙周組織中的表達(dá)(200×)

表2 各組大鼠牙周組織CCL2表達(dá)比較

2.4各組大鼠牙周組織CCL2、CCR2、TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白表達(dá):與對(duì)照組相比,模型組大鼠牙周組織CCL2、CCR2、TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白水平顯著升高(P<0.05);與模型組相比,川陳皮素低、中、高劑量組大鼠牙周組織CCL2、CCR2、TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白水平顯著降低(P<0.05),見圖3和表3。

圖3 Western blot檢測(cè)各組大鼠牙周組織CCL2、CCR2、TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白表達(dá)

表3 各組大鼠牙周組織CCL2 CCR2 TNF-α IL-1β IL-6蛋白水平比較

3 討 論

慢性牙周炎是最常見的口腔疾病之一,會(huì)導(dǎo)致牙周組織發(fā)炎,包括牙齦、牙周韌帶、牙骨質(zhì)和牙槽骨[1]。藥物治療常用抗生素,然而過(guò)量或長(zhǎng)期使用抗生素可能導(dǎo)致抗生素耐藥性。因此,本研究通過(guò)構(gòu)建牙周炎大鼠模型,以探究開發(fā)新的有效藥物。

近年來(lái),中醫(yī)因其副作用相對(duì)較小已逐漸被用作替代療法,比如魚腥草已被證明可以預(yù)防口腔傳染病[6]。川陳皮素是從中藥陳皮中提取的一類黃酮類化合物,具有抗氧化、抗炎、抗癌、抗菌、抗真菌等功效。Hosokawa等[3]首次證明川陳皮素在人牙周韌帶細(xì)胞發(fā)揮抗炎作用,可顯著抑制IL-1β誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng),認(rèn)為川陳皮素可能是治療牙周病的潛在藥物。TNF-α、IL-1β、IL-6是炎癥反應(yīng)中常見的炎癥因子,在牙周炎進(jìn)程中發(fā)揮重要促進(jìn)作用[7]。在本研究中,模型大鼠牙周組織出現(xiàn)牙槽骨吸收、大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),牙周組織炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平升高,表明牙周組織出現(xiàn)嚴(yán)重炎癥反應(yīng),而川陳皮素干預(yù)后,模型大鼠牙周組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)逐漸減輕,牙周組織炎性因子水平降低,表明川陳皮素可減輕牙周炎大鼠炎癥損傷。

CCL2是一種C-C型趨化因子,能夠趨化和激活單核/巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等,從而參與炎癥與免疫反應(yīng)[8]。在牙周炎中,CCL2促進(jìn)單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的募集,免疫細(xì)胞位于受損牙齦處形成防線[9]。但造成牙周組織持續(xù)性破壞的原因之一,也是產(chǎn)生可以趨化淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞進(jìn)入炎癥組織的趨化因子,有研究表明降低CCL2表達(dá)可減少炎癥細(xì)胞在牙周組織聚集,從而抑制牙周組織破壞[10]。本文發(fā)現(xiàn)牙周炎大鼠CCL2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目增多,牙周組織CCL2、CCR2水平顯著升高,提示抑制CCL2表達(dá)有可能是治療牙周炎的潛在策略。給予川陳皮素干預(yù)后,牙周炎大鼠牙周組織CCL2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目減少,CCL2、CCR2水平降低,表明川陳皮素可能通過(guò)抑制CCL2-CCR2信號(hào)軸減輕牙周炎大鼠炎性損傷。

綜上所述,川陳皮素可能通過(guò)抑制CCL2-CCR2信號(hào)軸減輕牙周炎大鼠炎性損傷,為治療牙周炎提供新的思路,但其作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探索。在未來(lái)的研究中課題組將結(jié)合體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)對(duì)CCL2-CCR2信號(hào)軸進(jìn)行干預(yù),深入驗(yàn)證川陳皮素抗牙周炎的作用與機(jī)制。