付海平, 王 飛, 郇顏強, 阿拉木蘇

(內蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院/內蒙古大學人民醫(yī)院脊柱外科, 內蒙古 呼和浩特 010017)

目前,結核病仍然是我國的常見病,每年有近1000萬新發(fā)病例,其中約2%涉及脊柱[1]。中晚期脊柱結核常伴有嚴重的后凸畸形,并可能因脊髓受壓而導致癱瘓。如果脊柱結核能夠在早期得到診斷,并及時給予定期和足夠的抗結核藥物治療,則可以阻止這種疾病的進展。目前,醫(yī)生對脊柱結核的診斷仍主要通過影像學檢查和對臨床表現的經驗認知來實現。由于脊柱結核在臨床和影像學表現上與其他脊柱感染性疾病非常相似,因此準確診斷脊柱結核具有挑戰(zhàn)性。近年來,診斷生物標志物的研究取得了重大進展。微小RNA(MicroRNAs,miRNAs)是小的非編碼RNA,根據與信使RNA(mRNA)的堿基配對,介導mRNA切割、翻譯抑制或mRNA去穩(wěn)定化。miRNAs表達的改變和隨后其靶基因的失調已被證明參與結核的病理生理學。miRNAs除了在細胞內表達,還以穩(wěn)定的形式存在于體液中,不受內源性RNA酶活性的影響。因此,細胞外miRNAs可能是一種多功能的通訊工具,它們在體液中的可及性或在組織中的表達特征使它們成為潛在的臨床生物標志物[2]。本研究的目的是確定與健康對照相比,脊柱結核患者外周血中差異表達的miRNA,并確定這些miRNA在脊柱結核臨床診斷中的潛在意義。

1 材料與方法

1.1一般資料:自2020年5月至2023年5月,納入本院脊柱骨科收治的50例脊柱結核患者(實驗組)和30例健康體檢者(對照組)為研究對象。其中實驗組男性25例,女性25例,年齡18～77歲,平均年齡(50.47±16.33歲),對照組男性13例,女性17例,年齡40～72歲,平均年齡(52.39±9.67)歲。兩組性別、年齡比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。本研究的實驗方案經本院倫理委員會審查批準(編號:201913H6Z)。脊柱結核患者的納入標準:①臨床癥狀(如:盜汗、背痛、乏力等)、實驗室和影像學檢查綜合診斷為脊柱結核患者;②納入研究前未進行抗結核治療;③近期未服用激素或免疫抑制藥物。排除標準:①糖尿病、惡性腫瘤及其他感染性疾病患者;②近期用藥可能引起血常規(guī)值變化的患者;③處于月經周期的婦女;④布魯氏菌病等化膿性感染和腰椎病變患者;⑤資料不全或拒絕參與調查研究的參與者。健康人群納入標準:①既往健康,無高血壓等慢性疾病,無糖尿病、惡性腫瘤、結核病病史,近1個月內未服用免疫激活或抑制藥物;②近兩周內無病毒和細菌感染史;③體檢無異常表現。排除標準:①有活動性肺結核、糖尿病、惡性腫瘤、感染性疾病;②近期服用可能導致血常規(guī)值變化的藥物;③處于月經周期的女性;④免疫缺陷疾病或其他免疫系統(tǒng)疾病;⑤參與者信息不完整或拒絕參與調查。

1.2RNA分離和miRNAs圖譜:在入院后的第2天早晨,從所有受試者的肘靜脈抽取10mL血液,并置于EDTA試管中。在冰箱中于4℃靜置30min后,靜脈血以2500rpm離心5min。使用移液管輕輕提取澄清的上清液(即血漿),然后放入2mL不含酶的冷凍保存管中。立即分離血漿中的miRNAs。使用TRIzol-LS(美國Invitrogen公司)收獲總RNA。在使用NanoDrop 1000通過RNA數量測量后,使用miRCURY Hy3/Hy5 Power labeling kit(美國Exiqon公司)標記樣品,并在miRCURY LNA陣列(v.18.0)(美國Exiqon公司)上雜交。在清洗步驟之后,使用Axon GenePix 4000B微陣列掃描儀(美國Axon Instruments公司)收集數據。然后將掃描的圖像導入GenePix Pro6.0軟件(美國Axon Instruments公司)進行網格對齊和數據提取。對復制的miRNAs進行平均,并選擇所有樣品中強度≥ 30的miRNAs用于計算歸一化因子。標準化后,通過Benjamin Hochberg (BH)將校正P值(q值)設為q<0.1,將log2倍數變化(FC)的絕對值設為>2,鑒定出兩組間顯著差異表達的miRNAs。最后,進行系統(tǒng)聚類以顯示樣品中可區(qū)分的miRNA表達譜。

1.3反轉錄和定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR)驗證血清中選定的miRNAs:使用TRIzol-LS從250μL血清中分離總RNA。在RNA分離過程中加入秀麗隱桿線蟲合成miRNA-39-5p(cel-miR-39-5p),用作內部對照。使用miScript Ⅱ RT試劑盒(美國Qiagen公司)將100ng總RNA進行逆轉錄。在ABI 7900實時PCR系統(tǒng)(美國Applied Biosystems公司)上使用All-in-One qPCR試劑盒(美國GeneCopoeia公司)對選擇的差異表達的miRNAs進行相對定量。使用2-△CT方法計算miRNA的相對表達水平,該方法將每個miRNA相對于cel-miR-39-5p水平的miRNA表達值標準化。然后從cel-miR-39-5p的Ct值中減去每個miRNA的重復分析的Ct值,得到用于進一步分析的△Ct值。引物購自美國GeneCopoeia公司。

1.4統(tǒng)計分析:使用SPSS24.0和GraphPad Prism 9.0進行所有統(tǒng)計分析。采用D'Agostino-Pearson算法進行數據分布正態(tài)性檢驗。使用卡方檢驗比較分類變量數據組,和Kruskal-Wallis檢驗或t檢驗比較連續(xù)數據組。多變量logistic回歸方法建立診斷模型計算預測值,Youden's J指數確定最佳分類閾值。相關性通過Spearman相關分析進行評估。雙側P<0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1脊柱結核患者和健康人群血清中的MicroRNA微陣列分析:使用miRCURYTM LNA陣列(v.18.0)在10例實驗組患者和10例對照組健康人群中篩選miRNAs表達譜。與健康人群相比,在脊柱結核患者血清中發(fā)現288種miRNAs差異表達(123種上調,165種下調)(倍數變化>2,P<0.05)。圖1顯示了健康人群和脊柱結核患者的差異表達miRNAs中前20個上調和下調miRNAs。

圖1 健康人群和脊柱結核患者的差異表達miRNAs中前20個上調和下調miRNAs。

2.2脊柱結核患者和健康人群血清樣本中差異表達miRNAs的驗證:我們通過RT-qPCR在研究隊列中驗證了10個選擇的miRNAs的表達水平,包括5個上調的miRNAs(hsa-miR-4708-3p、hsa-miR-5100、hsa-miR-3960、hsa-miR-4722-3p、hsa-miR-5701)和5個下調的miRNAs(hsa-miR-493-3p、hsa-miR-4503、hsa-miR-199a-5p、hsa-miR-4796-5p、hsa-miR-323b-3p)。與對照組相比,實驗組血清樣本中hsa-miR-4708-3p、hsa-miR-5100水平顯著上調(P<0.05),hsa-miR-493-3p水平顯著下調(P<0.05)(圖2)。

圖2 脊柱結核患者和健康人群血清樣本中差異表達miRNAs的驗證

2.3在研究隊列中選擇的候選性miRNAs對脊柱結核的診斷性能:隨后,研究選擇hsa-miR-4708-3p、hsa-miR-5100、hsa-miR-493-3p用于構建基于miRNAs的脊柱結核診斷模型(STB模型)。基于3個選擇的miRNAs的表達水平作為變量,建立的多元logistic回歸模型如下:0.582+1.055×(hsa-miR-4708-3p)+0.811×(hsa-miR-5100)-0.970×(hsa-miR-493-3p)。與對照組相比,實驗組STB模型評分顯著升高(0.32±0.04vs0.65±0.08,t=6.09,P<0.001)(圖3A)。為了解釋和評估生物標志物,通過Youden的J指數場確定最佳閾值。當臨界值設置為0.46時,STB模型鑒別脊柱結核的ROC曲線下面積(AUC)為0.911,靈敏度為88.9%,特異度為77.0%(圖3B)。

圖3 基于miRNAs的脊柱結核診斷模型(STB模型)的診斷性能分析

2.4實驗室測試的結果:在實驗檢查指標中,比較了對照組和實驗組患者的實驗室測試結果,發(fā)現兩組在年齡、白細胞、中性粒細胞、淋巴細胞等方面無統(tǒng)計學差異。然而,實驗組患者的紅細胞沉降率和CRP測定值顯著高于對照組(P<0.05),見表1。

表1 對照組和實驗組的實驗室測試結果比較

2.5STB模型的臨床診斷分析:在實驗組中,根據實驗室測試結果異常和正常劃分,比較STB模型的分布差異。結果顯示,CRP和紅細胞沉降率異常的脊柱結核患者的STB模型評分顯著高于CRP和紅細胞沉降率正常的脊柱結核患者(P<0.05),見表2。相關性分析顯示,STB模型評分與CRP、紅細胞沉降率呈顯著正相關(r=0.633、0.499,均P<0.001)(圖4)。

表2 STB模型在實驗組臨床表型中的分布

圖4 STB模型評分與CRP(A)、紅細胞沉降率(B)的相關性分析

3 討 論

脊柱結核是肺外結核病的一種常見形式,由結核分枝桿菌引起,通過循環(huán)系統(tǒng)擴散并局限于骨的血管,導致破壞性骨和關節(jié)疾病的發(fā)生[3]。早期癥狀、臨床表現不典型以及病程隱匿是脊柱結核治療不及時和嚴重并發(fā)癥的主要原因。因此早期診斷對脊柱結核的治療和預后具有重要意義。由于缺乏特異、敏感的診斷指標,導致脊柱結核患者診治延誤。先前大量研究已經證明了血清、血漿或尿液中存在大量miRNA,并且這些miRNA水平可以用作各種疾病的生物標志物。在本研究中,我們通過MicroRNA微陣列分析發(fā)現在脊柱結核患者與健康對照中存在許多血清差異表達miRNAs。與對照組相比,實驗組血清樣本中hsa-miR-4708-3p、hsa-miR-5100水平顯著上調,和hsa-miR-493-3p水平顯著下調。此外,基于這3個選擇的miRNAs的表達水平建立的STB模型具有較好的脊柱結核診斷性能。這些結果表明,血清hsa-miR-4708-3p、hsa-miR-5100和hsa-miR-493-3p可能是脊柱結核的潛在生物標志物。

近年來,隨著高通量檢測技術的進步,學者們研究了各種感染性疾病患者的miRNA表達,并取得了許多可喜的成果[4]。Wang等[5]在結核病患者血清中發(fā)現92個差異表達的miRNAs,其中59個上調,23個下調。Alipoor等[6]發(fā)現結核患者血清外泌體中miR-484、miR-425和miR-96的表達水平顯著增加。還有研究發(fā)現,miR-223、miR-197、let-7和miR-320不僅可以指示感染患者,還可以識別耐藥患者[7]。然而,目前較少關于脊柱結核患者循環(huán)miRNAs的發(fā)現和驗證的研究。Yang等證實了血漿miRNA-155的表達及其在脊柱結核導致椎間盤破壞的發(fā)病機制中的作用[8]。在目前的研究中,我們使用高通量陣列平臺在脊柱結核患者和正常健康人群的血漿樣品中發(fā)現了候選miRNAs。通過qRT-PCR在大樣本隊列中驗證候選miRNAs,并確定了hsa-miR-4708-3p、hsa-miR-5100和hsa-miR-493-3p存在差異表達,這與以前研究中的miRNAs不同。我們認為脊柱結核的發(fā)病部位不同于肺結核;在發(fā)病過程中,參與骨感染、骨形成和骨破壞的病理生理過程的miRNAs會在血管中滲入血液,引起血漿中循環(huán)miRNAs表達的變化。此外,這還可能與不同的樣本來源和大小有關。

先前的研究表明,hsa-miR-4708-3p調節(jié)人間質基質細胞的成脂分化[9]。miR-5100過表達已顯示通過靶向PODXL降低胰腺癌細胞的侵襲性表型。miR-5100可以靶向并調節(jié)AMPK-mTOR信號通路的必需蛋白Dickkopf 1和Smad 7,進而增加胃癌細胞的侵襲性表型[10]。Kisan等[11]發(fā)現hsa-miR-493-3p可以通過介導YTHDF調節(jié)骨穩(wěn)態(tài)。然而,這些miRNAs在脊柱結核發(fā)病機制中的作用尚未見報道。在目前的研究中,我們基于這三個選定的生物標志物開發(fā)了一個STB特異性診斷模型。性能分析表明,包含三個miRNA生物特征的診斷模型表現出診斷脊柱結核的高準確性。此外,我們進一步分析了診斷模型與患者臨床特征的相關性,發(fā)現模型評分與紅細胞沉降率和CRP水平呈正相關。眾所周知,紅細胞沉降率和CRP是評估脊柱結核患者的重要檢測指標。因此,本研究建立的脊柱結核診斷模型滿足作為診斷標記的要求。

總之,本研究發(fā)現hsa-miR-4708-3p、hsa-miR-5100和hsa-miR-493-3p在脊柱結核患者外周血中有穩(wěn)定的差異表達,包含這三種miRNAs的診斷模型具有較好的脊柱結核診斷性能。然而,目前關于這3種miRNAs在脊柱結核發(fā)病相關機制中的作用尚不清楚,需要進一步開展機制研究。此外,由于這項研究收集的樣本量相對較小,本研究開發(fā)的STB模型需要通過擴大樣本進行驗證。