史莉萍 李 文 林沁華

（贛南衛(wèi)生健康職業(yè)學(xué)院藥學(xué)系，江西 贛州，341000）

對(duì)乙酰氨基酚是廣泛應(yīng)用于解熱鎮(zhèn)痛的一大類(lèi)非甾體類(lèi)抗炎藥， 但對(duì)乙酰氨基酚的中間代謝產(chǎn)物N-乙酰苯醌亞胺（N-acetyl-1，4-benzoquinoneimine，NAPQI）具有肝細(xì)胞毒性[1]。因患者不遵醫(yī)囑、誤服或者過(guò)量服用等，可造成急性肝損傷（acute liver injury，ALI）甚至肝衰竭，且由對(duì)乙酰氨基酚引發(fā)的ALI 呈上升趨勢(shì)。對(duì)乙酰氨基酚已成為導(dǎo)致藥物性肝損傷最常見(jiàn)的藥物之一，并成為歐美等發(fā)達(dá)國(guó)家引起急性肝衰竭的首要因素[2]。但是目前臨床上用于治療對(duì)乙酰氨基酚所致ALI 的有效藥物和措施不多，且公認(rèn)的解毒藥N-乙酰半胱氨酸（N-acetyl-L-cysteine，NAC）具有一系列不良反應(yīng)[3-5]。因此，尋找理想的肝保護(hù)藥物，降低對(duì)乙酰氨基酚在使用中的肝臟毒性具有重要的臨床意義。甘草是豆科植物甘草的根及塊狀莖，是一種常見(jiàn)的中藥，有清熱解毒、補(bǔ)脾益氣、鎮(zhèn)咳怯痰的作用，而甘草酸苷為其主要活性成分之一?，F(xiàn)代研究表明甘草酸苷具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎、抗病毒、保護(hù)肝臟的作用[6-7]。已有學(xué)者研究提示甘草酸苷對(duì)對(duì)乙酰氨基酚介導(dǎo)的肝損傷具有保護(hù)作用[8-9]，但其作用機(jī)制仍有待深入探討。因此，本研究通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證甘草酸苷對(duì)對(duì)乙酰氨基酚所致ALI 小鼠的肝臟保護(hù)作用并探討其具體機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康昆明種雌性小鼠24 只、雄性小鼠24 只，SPF 級(jí)，體質(zhì)量25～35 g，中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)期間均遵守本單位實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心的管理規(guī)范照料和使用原則。

1.2 藥品與試劑

對(duì)乙酰氨基酚注射液（生產(chǎn)企業(yè)：合肥中龍神力動(dòng)物藥業(yè)有限公司，獸藥字120152532，規(guī)格10 mL:1 g），取適量對(duì)乙酰氨基酚溶于少量氯化鈉溶液，然后補(bǔ)足氯化鈉溶液配制成400 mg/mL 溶液備用[10]；注射用甘草酸苷（ 生產(chǎn)企業(yè)：瑞陽(yáng)制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20060537）；聯(lián)苯雙酯（生產(chǎn)企業(yè)：浙江海翔川南藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20153110）。藥用級(jí)橄欖油（生產(chǎn)企業(yè)：通化德濟(jì)參藥業(yè)有限公司，規(guī)格：500 mL/瓶）；0.9%氯化鈉溶液、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）測(cè)試盒（賴(lài)氏法）（規(guī)格：96T）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate transaminase，AST）測(cè)試盒（微板法）（規(guī)格：96T）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）測(cè)試盒（微板法）（規(guī)格：96T）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）測(cè)試盒（規(guī)格：96T）、白介素-6（interleukin-6，IL-6）測(cè)試盒（規(guī)格：96T）、還原型谷胱甘肽（GSH）測(cè)定試劑盒（微板法）（規(guī)格：96T）、總超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）測(cè)試盒（羥胺法）（規(guī)格：100管/96 樣）、丙二醛(A)測(cè)定試劑盒(TBA 法)（規(guī)格：100 管/96樣）；免疫組化用蘇木素-伊紅（hematoxylin eosin，HE）染液（規(guī)格：50ml*2）（生產(chǎn)企業(yè)：南京建成生物工程研究所有限公司）。

1.3 主要設(shè)備與儀器

醫(yī)用離心機(jī)（生產(chǎn)企業(yè)：湖南赫西儀器裝備有限公司，型號(hào)：DD5 型）；酶標(biāo)儀（生產(chǎn)企業(yè)：南昌普朗醫(yī)用設(shè)備有限公司，型號(hào)：DNM-9602 型）；自動(dòng)脫水儀（生產(chǎn)企業(yè)：北京中瑞祥科技有限公司，型號(hào)：ZRX-29768 型）；石蠟切片機(jī)（生產(chǎn)企業(yè)：美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司，型號(hào)：HM340E 型）；光學(xué)顯微鏡（生產(chǎn)企業(yè)：日本Olympus 株式會(huì)社，型號(hào)：CX43型）；蛋白質(zhì)凝膠電泳儀（生產(chǎn)企業(yè)：北京六一生物科技有限公司，型號(hào)：DYCZ-24DN 型）。

1.4 建模、分組給藥與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處理

對(duì)乙酰氨基酚腹腔注射建立ALI 小鼠模型，質(zhì)量濃度400 mg/mL、劑量1 mL/100 g 小鼠體質(zhì)量，其中對(duì)乙酰氨基酚配置方法：取適量對(duì)乙酰氨基酚溶于少量氯化鈉溶液，然后補(bǔ)足氯化鈉溶液，使質(zhì)量終濃度為400 mg/mL[10]。將造模成功的小鼠采用隨機(jī)數(shù)表法分為模型組、聯(lián)苯雙酯組、甘草酸苷低劑量組、甘草酸苷中劑量組、甘草酸苷高劑量組，另設(shè)置對(duì)照組（建模時(shí)對(duì)照組僅腹腔注射1mL/100 g 小鼠體質(zhì)量的氯化鈉溶液），各8 只。聯(lián)苯雙酯組予以60 mg/kg 聯(lián)苯雙酯灌胃，甘草酸苷低、中、高劑量組分別予以50、100、150 mg/mL甘草酸苷灌胃（劑量均為1 mL/100 g 小鼠體質(zhì)量，其中甘草酸苷低劑量組為臨床等效劑量，甘草酸苷中劑量組為臨床等效劑量×2，甘草酸苷高劑量組為臨床等效劑量×4），聯(lián)苯雙酯和甘草酸苷均以四氯化碳橄欖油為溶劑。給藥24 h 后取眼眶靜脈血，后頸椎脫臼法處死，迅速剝離肝臟組織。血樣用于檢測(cè)肝功能、炎性反應(yīng)指標(biāo)；肝臟組織用于肝臟病理觀(guān)察。

1.5 肝功能指標(biāo)及炎癥指標(biāo)檢測(cè)

將小鼠血液樣本以4 000 r/min 離心10 min 分離血清。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)，酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔吸光光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算各組血清ALT、AST、LDH、TNF-α、IL-6 水平。

1.6 肝組織病理變化觀(guān)察

取各組小鼠左肝葉肝臟組織，制成0.5 cm×0.5 cm×0.2 cm 組織塊，采用10%甲醛溶液固定。24 h 后自動(dòng)脫水儀脫水，后石蠟包埋、切片（層厚5 μm）。恒溫烤干，以二甲苯脫蠟、梯度酒精脫水，采用HE 染色。于光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察并拍照。

1.7 肝組織氧化應(yīng)激測(cè)定

取各組小鼠肝組織，冰上勻漿，加入0.9 %氯化鈉溶液，3 000 r/min 離心10 min，取上清。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)，測(cè)定肝組織GSH、SOD。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 25.0 對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料經(jīng)檢驗(yàn)均符合正態(tài)分布，采用（±s）表示，多組計(jì)量資料比較采用單因素方差分析，比較采用t 檢驗(yàn)。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 聯(lián)苯雙酯和甘草酸苷對(duì)小鼠肝功能的影響

與對(duì)照組比較，模型組血清ALT、AST、LDH 水平均升高（P<0.05）；與模型組比較，聯(lián)苯雙酯組和甘草酸苷低、中、高劑量組血清ALT、AST、LDH 水平均降低（P<0.05）；與聯(lián)苯雙酯組比較，甘草酸苷低劑量組血清ALT、AST、LDH 水平均升高（P<0.05），甘草酸苷高劑量組血清ALT、AST、LDH 水平均降低（P<0.05），見(jiàn)圖1。

圖1 各組小鼠血清肝酶濃度

2.2 聯(lián)苯雙酯和甘草酸苷對(duì)小鼠血清炎性因子的影響

與對(duì)照組比較，模型組血清TNF-α、IL-6 水平均升高（P<0.05）；與模型組比較，聯(lián)苯雙酯組和甘草酸苷低、中、高劑量組血清TNF-α、IL-6 水平均降低（P<0.05）；與聯(lián)苯雙酯組比較，甘草酸苷低劑量組血清TNF-α、IL-6 水平均升高（P<0.05），甘草酸苷高劑量組血清TNF-α、IL-6 水平均降低（P<0.05），見(jiàn)圖2。

圖2 各組小鼠炎癥因子水平

2.3 聯(lián)苯雙酯和甘草酸苷對(duì)小鼠肝組織病理的影響

對(duì)照組中肝小葉結(jié)構(gòu)完整，中央靜脈形態(tài)完好，肝竇未見(jiàn)充血或擴(kuò)張，肝細(xì)胞形態(tài)及排列正常，未見(jiàn)明顯空泡樣變和水樣變，為0 級(jí)損傷。相較對(duì)照組，模型組小鼠肝組織HE染色切片有明顯的肝小葉結(jié)構(gòu)改變和肝索間隙擴(kuò)張，中央靜脈淤血，部分區(qū)域可觀(guān)察到肝細(xì)胞脂肪樣變、水樣變等病理性改變，并伴有炎性反應(yīng)細(xì)胞浸潤(rùn)，達(dá)到Ⅲ級(jí)肝損傷。與模型組相比，甘草酸苷低劑量組肝組織結(jié)構(gòu)改變減輕，肝小葉形態(tài)變化減輕，中央靜脈附近和肝細(xì)胞間有部分炎性反應(yīng)細(xì)胞浸潤(rùn)；甘草酸苷中劑量組和聯(lián)苯雙酯組肝組織結(jié)構(gòu)和肝小葉形態(tài)輕微改變，中央靜脈附近和肝細(xì)胞間少有炎性反應(yīng)細(xì)胞浸潤(rùn)；甘草酸苷高劑量組肝組織結(jié)構(gòu)和肝小葉形態(tài)接近正常，中央靜脈附近和肝細(xì)胞間基本沒(méi)有炎性反應(yīng)細(xì)胞浸潤(rùn)，未見(jiàn)肝細(xì)胞脂肪樣變、水樣變，見(jiàn)圖3。

圖3 小鼠肝組織HE 染色切片（×100）

2.4 聯(lián)苯雙酯和甘草酸苷對(duì)小鼠肝組織GSH、SOD 的影響

與對(duì)照組比較，模型組GSH、SOD 活性均降低（P<0.05），MDA 活性升高（P<0.05）；與模型組比較，聯(lián)苯雙酯組和甘草酸苷低、中、高劑量組GSH、SOD 活性均升高（P<0.05），MDA 活性均降低（P<0.05）；與聯(lián)苯雙酯組比較，甘草酸苷低劑量組GSH、SOD 活性均降低（P<0.05），MDA 活性均升高（P<0.05），甘草酸苷高劑量組GSH、SOD 活性均升高（P<0.05），MDA 活性降低（P<0.05），見(jiàn)圖4、5。

圖4 各組小鼠肝組織GSH、SOD 活性

圖5 各組小鼠肝組織MDA 活性

3 討論

對(duì)乙酰氨基酚是臨床常用的解熱鎮(zhèn)痛藥之一，過(guò)量使用將導(dǎo)致其毒性代謝產(chǎn)物在體內(nèi)蓄積，進(jìn)而導(dǎo)致肝損傷甚至肝衰竭[11-13]。聯(lián)苯雙酯是目前常用的藥物性肝損傷治療藥物，通過(guò)一定的抗氧化及免疫調(diào)節(jié)作用，達(dá)到促進(jìn)肝細(xì)胞再生并保護(hù)肝細(xì)胞，增強(qiáng)肝臟解毒功能，減輕肝臟的病理?yè)p傷，減輕因四氯化碳及硫代乙酰胺引起的血清ALT 升高，改善肝功能的目的。因此本研究采用該藥物作為陽(yáng)性對(duì)照。目前，甘草酸苷主要用于治療慢性肝病、改善肝功能異常[14]。有研究發(fā)現(xiàn)，甘草酸苷可以緩解雷公藤多苷所致的肝損傷[15]，其主要的機(jī)制包括減輕雷公藤多苷所致的細(xì)胞色素氧化酶CYP2B1的減少。本研究發(fā)現(xiàn)甘草酸苷對(duì)于對(duì)乙酰氨基酚誘導(dǎo)的急性肝損傷也有保護(hù)作用。組織學(xué)切片顯示，對(duì)乙酰氨基酚所致肝損傷主要體現(xiàn)在肝細(xì)胞的脂肪變性和淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)。血清中升高的炎性反應(yīng)指標(biāo)，TNF-α 和IL-6 反映了對(duì)乙酰氨基酚導(dǎo)致的炎性反應(yīng)水平的升高。免疫細(xì)胞浸潤(rùn)及一系列免疫反應(yīng)的激活是肝損傷的一個(gè)重要環(huán)節(jié)[16-17]。研究顯示，免疫浸潤(rùn)和炎性反應(yīng)與肝細(xì)胞的凋亡壞死常相互伴行[18]。使用甘草酸苷后，肝細(xì)胞的損傷及免疫浸潤(rùn)水平明顯減輕。

對(duì)乙酰氨基酚的毒性代謝產(chǎn)物導(dǎo)致肝損傷的重要機(jī)制是其引起細(xì)胞及組織內(nèi)過(guò)度的氧化應(yīng)激反應(yīng)[19]，其通過(guò)耗竭胞內(nèi)的還原型物質(zhì)GSH，導(dǎo)致氧化反應(yīng)無(wú)法被抗衡，進(jìn)而產(chǎn)生一系列應(yīng)激反應(yīng)、線(xiàn)粒體功能紊亂及細(xì)胞死亡[20]。NAC 正是具有強(qiáng)大的抗氧化作用，是目前緩解對(duì)乙酰氨基酚最有效的藥物。SOD 是細(xì)胞抗氧化體系的重要組成之一，而MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化的終產(chǎn)物，本研究結(jié)果顯示，甘草酸苷可有效緩解對(duì)乙酰氨基酚導(dǎo)致的GSH 及SOD 活性降低，有望取代NAC 成為緩解對(duì)乙酰氨基酚引起的肝內(nèi)氧化應(yīng)激水平的臨床藥物[21-23]。

綜上所述，甘草酸苷能夠減輕對(duì)乙酰氨基酚誘導(dǎo)的ALI，對(duì)其肝功能有保護(hù)作用，且還可減輕炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激和肝組織病理改變。本研究為臨床治療對(duì)乙酰氨基酚誘導(dǎo)的ALI 提供了一種新的藥物，但其是否具有其他作用機(jī)制、在臨床中應(yīng)用的有效性及安全性等仍需要進(jìn)一步探討，需作為后期的研究方向。