朱夢月

(南京醫(yī)科大學(xué)康達(dá)學(xué)院藥學(xué)部，江蘇 連云港 222000)

新藥研發(fā)是醫(yī)藥創(chuàng)新發(fā)展的核心驅(qū)動力，事關(guān)我國重要民生問題和發(fā)展需求，是人類社會健康可持續(xù)發(fā)展的重要保證。我國是醫(yī)藥大國，然而并非醫(yī)藥強(qiáng)國，我國原創(chuàng)新藥發(fā)展相對緩慢，其中一個(gè)關(guān)鍵性因素是具有自主知識產(chǎn)權(quán)的先導(dǎo)藥源分子有限。微生物作為地球上最豐富的物種資源，在生命活動過程中代謝產(chǎn)生的活性物質(zhì)在醫(yī)療方面發(fā)揮著舉足輕重的作用。微生物活性天然產(chǎn)物是先導(dǎo)藥源分子的重要來源[1-2]，探究其次級代謝產(chǎn)物，生物合成途徑，有助于挖掘及重構(gòu)生物合成途徑以獲得更多新型微生物活性天然產(chǎn)物[3]，從而擴(kuò)充藥物先導(dǎo)化合物庫，助力我國醫(yī)藥創(chuàng)新發(fā)展。

研究表明，海洋生態(tài)系統(tǒng)中蘊(yùn)藏著豐富的微生物資源[4]，在高鹽、高壓、低氧、低溫的特殊的生境條件篩選下，海洋微生物更易進(jìn)化出特殊的代謝途徑，從而產(chǎn)生更多獨(dú)特的次級代謝產(chǎn)物以應(yīng)對環(huán)境壓力。海洋放線菌中可以產(chǎn)生許多結(jié)構(gòu)新穎、活性獨(dú)特的新化合物，有蒽醌類化合物、肽類、脂類[5-6]等，許多最初被認(rèn)為是由海洋生物產(chǎn)生的化合物已被發(fā)現(xiàn)是由與宿主相關(guān)的放線菌產(chǎn)生[7]。隨著基因組測序技術(shù)和生物信息學(xué)的不斷發(fā)展，越來越多的微生物基因組信息得到解析，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)海洋微生物中蘊(yùn)含著大量負(fù)責(zé)天然產(chǎn)物(次級代謝產(chǎn)物)生物合成的基因簇，且該數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于目前鑒定的化合物結(jié)構(gòu)類型數(shù)量[8-13]，研究表明在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室條件下，微生物中的生物合成基因簇大多處于沉默狀態(tài)，意味著海洋放線菌中仍有大量新型活性天然產(chǎn)物亟待發(fā)掘，具有巨大的開發(fā)潛力，因此，這些海洋放線菌受到了國內(nèi)外的廣泛關(guān)注。

海洋放線菌次級代謝產(chǎn)物種類豐富，其中芳香族聚酮類化合物是由II型聚酮合成酶(PKSs)形成的天然產(chǎn)物，是一種生物活性強(qiáng)、結(jié)構(gòu)多樣化的細(xì)菌次生代謝物。在數(shù)代人的不懈努力下，許多II型聚酮類化合物及其半合成衍生物已作為高效藥物應(yīng)用于臨床，如四環(huán)素類抗生素及抗腫瘤藥物光神霉素和阿霉素等[14-15]。

基于海洋微生物的巨大資源優(yōu)勢，本文重點(diǎn)研究海洋來源的微生物，根據(jù)一批海洋微生物的次級代謝產(chǎn)物紫外圖譜，推測出一株海洋放線菌的次級代謝結(jié)構(gòu)上屬于聚酮類化合物，聚酮類化合物其結(jié)構(gòu)多樣、生物活性顯著，有望從中分離出活性較好的藥物先導(dǎo)化合物。于是著重研究這一株菌，通過測序確定海洋放線菌是鏈霉菌屬Streptomyces rishiriensis。從其次級代謝產(chǎn)物中分離出2個(gè)已知化合物(1、2)rishirilide A、rishirilide B(圖1)，結(jié)構(gòu)上都屬于II型聚酮類化合物。后期如分離到新化合物對生物合成后修飾研究有很重要作用，有助于發(fā)現(xiàn)新型酶催化機(jī)理，進(jìn)而挖掘出更多新穎的II型聚酮類化合物，從而擴(kuò)充新型藥物先導(dǎo)化合物庫，加速推進(jìn)新型藥物的研發(fā)。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料、試劑及培養(yǎng)基

1.1.1 材料

90 mm培養(yǎng)皿、剪刀、鑷子、研缽、培養(yǎng)皿、1 L錐形瓶、青霉素小瓶、EP管、酒精燈、涂布環(huán)、接種環(huán)、200 μL和1 mL槍頭、200 μL和1 mL移液槍、層析柱、樹脂、分液漏斗、旋蒸瓶、TLC硅膠板(5 cm×20 cm)，煙臺江友硅膠開發(fā)有限公司；柱色譜硅膠(200～300目)，青島海洋化工、反相柱色譜(ODS填料)，日本YMC有限公司；凝膠柱色譜填料(Sephadex LH-20)，Pharmacia Biotech公司。

1.1.2 儀器

半制備色譜柱MPLC(Agilent Eclipse XDB-C18，5 μm，250 mm×9.4 mm)分離粗膏、高效液相色譜儀HPLC(Agilient 1260 Infinity XDB-C18column，5 μm，250 mm×9.4 mm)制備純品化合物、核磁共振儀(Bruker Avance III 400/600)測定化合物核磁共振數(shù)據(jù)(TMS為內(nèi)標(biāo))、紫外測定儀(Nanodrop2000)測定紫外數(shù)據(jù)、傅里葉變換紅外光譜儀(Nexus 870 FT-IR)、紫外分光光度計(jì)(detector L-7400 UV)測紫外數(shù)據(jù)、電子天平用于測量重量、高壓蒸汽滅菌鍋用于高溫滅菌、生物安全柜、恒溫培養(yǎng)箱、恒溫?fù)u床、超凈工作臺、-80 ℃超低溫冰箱、超純水儀、高速離心機(jī)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀EYELAN-1000、冷凝循環(huán)裝置CA-1111等。

1.1.3 試劑

甲醇、乙腈等色譜級別溶劑，海市百靈威；乙腈等分析純，廣州金華大化學(xué)試劑公司；石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、氘代DMSO，上海市恩拿馬生物科技有限公司；二氯甲烷、纈氨酸、亮氨酸、D-FDAA等，西格瑪奧德里奇有限公司。

1.1.4 培養(yǎng)基

分菌用馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)：將200 g左右馬鈴薯去皮，切成小塊，加入1 L以下水，煮沸0.5 h后，用兩層醫(yī)用紗布過濾得濾液，加水定容至1 L，再稱取2 g蔗糖和10%瓊脂，混勻溶解后分裝于錐形瓶中，115 ℃滅菌30 min，冷卻至60 ℃，加卡那霉素和氨芐青霉素各150 mg，搖勻后倒入培養(yǎng)皿，冷卻凝固后備用。

高氏培養(yǎng)基(GS)：0.5 g三水合磷酸氫二鉀、1 g硝酸鉀、0.5 g七水合硫酸鎂、0.5 g氯化鈉、0.01 g七水合硫酸亞鐵、10 g瓊脂粉、20 g可溶性淀粉、加入1 L水，調(diào)節(jié)pH至7.4～7.6。

麥芽培養(yǎng)基(Malt)：麥芽20 g加水煮沸0.5 h，用兩層醫(yī)用紗布過濾得濾液，加20 g蔗糖，1 g蛋白胨，加水定容至1 L。

纖維素脯氨酸瓊脂培養(yǎng)基(CPA)：1.0 g脯氨酸，2.5 g羧甲基纖維素鈉，2.0 g丙酮酸鈉，0.2 g七水合硫酸鎂，0.25 g硝酸鉀，0.2 g磷酸氫二鉀，0.5 g氯化鈣，10 mg七水合硫酸亞鐵，20 g瓊脂粉，1 L水溶解(纖維素鈉提前用熱水溶解，需要不斷攪拌，培養(yǎng)基中還需要加入重鉻酸鉀，保證其終濃度在50 μg/mL)。

ISP4培養(yǎng)基：1.365 g磷酸氫二鉀，2 g氯化銨，1 g氯化鈉，2 g七水合硫酸鎂，0.1 mL微量元素，2 g碳酸鈣，20 g瓊脂粉，10 g可溶性淀粉，1 L水溶解。

38#培養(yǎng)基：4.0 g酵母浸出物，5.0 g麥芽浸出物，1 mL復(fù)合維生素，4.0 g葡萄糖，20 g瓊脂粉，用1 L水溶解。

TSB培養(yǎng)基：1 L水溶解30 mg TSB。

F培養(yǎng)基：20.0 g蔗糖，0.1 g酪蛋白水解物，10.0 g葡萄糖，0.25 g硫酸鉀，5.0 g酵母浸出物，1.0 g六水合氯化鎂，5 g MOPs，0.1 mL微量元素，1 L水溶解。

A培養(yǎng)基：1 g碳酸鈣，4 g酵母浸出物，0.1 g溴化鉀，2.0 g蛋白胨，0.04 g硫酸鐵，10.0 g可溶性淀粉，1 L水溶解。

Y培養(yǎng)基：4.0 g葡萄糖，4.0 g酵母浸出物，10.0 g麥芽浸出物，1 L水溶解。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種分離方法及菌種鑒定

分離方法：將南海海泥風(fēng)干后稱取5 g，用滅菌水37 ℃恒溫懸浮2 h，將懸浮海泥的無菌水稀釋成三個(gè)濃度梯度10-1、10-2、10-3，分別涂布在CPA、GS、PDA、純瓊脂培養(yǎng)基上，恒溫37 ℃培養(yǎng)到長出單菌落，再用Malt、ISP4、38#培養(yǎng)基純化，發(fā)現(xiàn)該菌株只在Malt培養(yǎng)基上生長，呈現(xiàn)零散的單孢形狀。

菌種鑒定：將菌種孢子粉末沾取少量至EP管中，加入裂解液、Tris-HCl緩沖液(pH=8.0)、EDTA、NaCl和二烷基硫酸鈉，置于渦旋混合儀混合，放入60 ℃水浴鍋中孵育20 min，上下顛倒充分混勻。之后向混懸液中加入醋酸鉀溶液，混勻后，離心10 min，吸取500 μL上清至新EP管中，再加入同體積異丙醇，EP管上下顛倒至出現(xiàn)白色絮狀沉淀，離心5 min，撇去上清液，再在EP管中加70%乙醇，混勻后離心3 min，再撇去上清，循環(huán)操作兩次將帶有基因組的EP管打開于室溫下晾10 min后加65 ℃熱水，基因組溶解后用NanoDrop2000測濃度，并將提取的基因組片段送至擎科生物公司測序鑒定菌種。通過形態(tài)學(xué)和18S rRNA序列對比，菌株鑒定結(jié)果表明屬于該海洋放線菌NA07600是Streptomyces rishiriensis。

1.2.2 菌種的發(fā)酵及提取分離方法

將海洋放線菌NA07600(Streptomyces rishiriensis)純化到ISP4平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)7天，長出孢子后，配制1 L TSB培養(yǎng)液平均分裝到6個(gè)錐形瓶中，將長滿孢子的ISP4培養(yǎng)基挑塊接種至錐形瓶中，140 rpm/min、恒溫28 ℃，培養(yǎng)至瓶中長出密集菌粒，即可作為種子液。配制Y培養(yǎng)基15L，每瓶封裝250 mL于體積1 L的錐形瓶中，115 ℃滅菌30 min，待冷卻后，接種培養(yǎng)液量的5%即12.5 mL種子液，30 ℃恒溫、220 rpm搖床發(fā)酵8.5天，用兩層紗布過濾，紗布上可得菌體，下方濾液是菌液。用乙酸乙酯萃取菌液3次，合并萃取液后旋蒸濃縮后得5.6 g粗膏。

5.6 g粗膏先用中壓制備色譜MPLC分離，流動相為甲醇和水，梯度洗脫后，將洗脫液進(jìn)行TLC分析，將類似組分合并后，分為7組即Fr1～Fr7。對Fr2和Fr4進(jìn)一步純化，F(xiàn)r2段用正相硅膠柱初步分離后，再用凝膠柱層析和HPLC純化，F(xiàn)r4段用凝膠柱層析初步分離，再利用HPLC純化，最終分到化合物1和2。具體分離流程如圖2所示。

圖2 化合物1和2的分離純化流程Fig.2 Separation and purification process of compounds 1～2

2 化合物的結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：橙紅色無定形粉末，高分辨質(zhì)譜HRESIMS顯示m/z：401.1535[M+Na]+，合理分子式C21H24O7，不飽和度為10，核磁數(shù)據(jù)見表1。

表1 化合物1的1H NMR(400 MHz)和13C NMR(100 MHz)數(shù)據(jù)歸屬(DMSO-d6)Table 1 1H NMR (400 MHz)and 13C NMR (100 MHz) data attribution of compound 1 (DMSO-d6)

1HNMR(400 MHz，DMSO-d6)譜中，低場區(qū)給出一個(gè)苯環(huán)上3個(gè)相鄰氫信號(δH6.99，7.04，7.22)，H-9和H-10兩個(gè)氫間有COSY相關(guān)且與δC130.93，155.45有HMBC相關(guān)，可推斷與3個(gè)相鄰氫苯環(huán)相連，C-10的δC為62.97，符合C-10位連O的特征；同時(shí)H-10、H-9又與δC123.01，83.85存在HMBC相關(guān)，符合苯環(huán)連O且存在雙鍵的特征；H-9、H-10與δC80.56，198.25存在HMBC相關(guān)，H-2與δC80.49，198.25，80.56有HMBC關(guān)聯(lián)，4-OH與δC80.49，80.56有HMBC相關(guān)，3-OH與δC80.49，49.44有HMBC相關(guān)，符合三環(huán)并列特征；3-OH與δC175.75有HMBC相關(guān)，推測3-COOH與4a脫水后形成螺環(huán)，很重要的推測原因是已經(jīng)分到了3-COOH化合物，一維和二維圖譜都證明了三環(huán)并列存在螺環(huán)結(jié)構(gòu)的合理性，查閱文獻(xiàn)并對比確定是已知化合物rishirilide A[16](圖3)。

圖3 化合物1的結(jié)構(gòu)和二維核磁相關(guān)Fig.3 The structure of compound 1 was related to two-dimensional nuclear magnetism

化合物2：橙紅色無定型粉末，高分辨質(zhì)譜HRESIMS顯示m/z：395.076 5[M+Na]+，分子式C21H24O6，不飽和度為10，核磁數(shù)據(jù)見表2。

表2 化合物2的1H NMR(400 MHz)和13C NMR (100 MHz)數(shù)據(jù)歸屬(DMSO-d6)Table 2 1H NMR (400 MHz)and 13C NMR (100 MHz)data attribution of compound 2(DMSO-d6)

1HNMR(400 MHz，DMSO-d6)譜中，低場區(qū)也就是芳香區(qū)存在3個(gè)相鄰氫的苯環(huán)(δH6.96，7.31，7.49)特征信號，δH8.31，8.29相應(yīng)碳位移為δC126.57，120.33，符合苯環(huán)上單峰特征信號，13C NMR譜上有10個(gè)芳香區(qū)碳(δC110～150)，符合萘環(huán)特征信號；H-2 (δH3.06)與C-16 (δC175.06)、C-3 (δC84.55)、C-1 (δC197.01)存在HMBC相關(guān)，H-9 (δH8.31)與C-1(δC197.01)有HMBC相關(guān)、H-11 (δH2.24)與C-3 (δC84.55)、C-4 (δC78.16)、C-4a (δC130.06)相關(guān)，符合三環(huán)并列特征信號，與1對比特征信號，確定2也有六元環(huán)和五碳支鏈，但2沒有形成螺環(huán)，查閱文獻(xiàn)并對比信號確定2是已知化合物rishirilide B[17](圖4)。

圖4 化合物2的結(jié)構(gòu)和二維核磁相關(guān)Fig.4 The structure of compound 2 was related to two-dimensional nuclear magnetism

3 結(jié) 論

本文研究海洋放線菌StreptomycesrishiriensisNA07600的次級代謝產(chǎn)物，通過發(fā)酵、分離和純化得到聚酮類化合物1和2，此類化合物在之前被報(bào)道過具有抑制谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶的活性，被用于預(yù)防和治療血栓[16]，化合物1和2是一類具有多環(huán)酚醛骨架的芳香族聚酮類化合物，這一類化合物被證明具有多種生物活性，因此值得深入研究。