羅傳超 王佳星 朱勤偉

糖尿病(DM)是指機體常年處于血糖、碳水化合物和脂肪代謝紊亂的一種代謝性疾病[1]。近年來,隨著經(jīng)濟物質水平的提高,DM的發(fā)病率逐年上升,成為全世界國家的常見疾病,嚴重威脅著人類健康[2]。2型糖尿病(T2DM)占DM總數(shù)90%以上,約60%的T2DM患者合并有心血管并發(fā)癥,約80%死于大血管病變[3]。因此DM的防治,特別是T2DM大血管并發(fā)癥的防治具有重大意義。近年來的研究認為氧化應激是導致血管內皮細胞損傷和功能障礙的重要原因[4]。低密度脂蛋白(LDL)與氧自由基發(fā)生反應之后產生氧化低密度脂蛋白(oxLDL),oxLDL發(fā)揮毒性作用需要與其受體LOX-1介導[5-7]。LOX-1表達上調之后,oxLDL與LOX-1結合增加,進入內皮細胞,ROS含量相應升高,激活核轉錄因子-κB(NF-κB),導致內皮細胞功能發(fā)生紊亂[8],形成泡沫細胞,最后將形成動脈粥樣硬化(AS)斑塊[9]。梓醇是地黃中主要的藥理成分,具有抗炎、抗氧化的作用,可以預防和治療多種氧化應激性損傷[10,11]。李文濤等[12]研究表明梓醇可減輕高糖引起的血管內皮細胞DNA的損傷。因此,本研究主要在T2DM大鼠模型上給予梓醇干預治療,觀察其對DM大血管病變的保護作用,并探討與oxLDL/LDL及NF-κB信號通路的關系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：選取健康180～200 g雄性Wistar大鼠50只,購自安領生物醫(yī)藥(深圳)有限公司,合格證號：SYXK(粵)2021-0268,適應性飼養(yǎng)7 d,自由取食和飲水,環(huán)境溫度(22±2)℃,相對濕度(60±5)%,自然晝夜采光。

1.1.2 主要試劑與儀器：梓醇購自上海澄紹生物科技有限公司;二甲雙胍購自丹東醫(yī)創(chuàng)藥業(yè)有限責任公司;STZ購自上海雅吉生物科技有限公司;蛋白提取試劑盒購自艾美捷科技有限公司;CX41顯微鏡、AU2700全自動生化分析儀均購自日本Olympus公司;LOX-1、NF-κB p65、MCP-1單抗及二抗均購自美國Abcam公司;Trizol試劑均購自廣州威佳科技有限公司;總RNA提取試劑盒購自上海海方生物技術有限公司;RT-PCR試劑盒購自上海西格生物科技有限公司;MCP-1和oxLDL試劑盒均購自伊艾博(武漢)科技股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 模型建立：從50只雄性Wistar大鼠中隨機選取10只作為對照組,剩余40只進行造模。造模組喂以高糖高脂飼料,4周后大鼠按照25 mg/kg的劑量一次性腹腔內注射STZ[13],繼續(xù)高糖高脂飼料喂養(yǎng),對照組喂以標準飼料,并注射等量0.9%氯化鈉溶液,檢測第7天餐后2 h血糖值,血糖值>11.1 mmol/L的大鼠為造模成功,選取其中30只大鼠作為后續(xù)研究對象。

1.2.2 分組及給藥：將造模成功的大鼠隨機分為模型組、二甲雙胍組、梓醇組,每組10只,繼續(xù)喂以高糖高脂飼料,同時二甲雙胍組每天給予二甲雙胍(134 mg·kg-1·d-1)[13],梓醇組每天給予梓醇(10 mg·kg-1·d-1)[14],對照組和模型組給予同體積的0.9%氯化鈉溶液,給藥方式為灌胃,1次/d,喂養(yǎng)4周。

1.2.3 大鼠血清空腹血糖(FBG)、總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)檢測：治療結束后,禁食12 h,采取靜脈血4 ml,3 500 r/min速度離心10 min取上清,全自動生化分析儀進行檢測。

1.2.4 血清MCP-1、oxLDL的測定：取50 μl血清于相應反應板中,按照酶聯(lián)免疫試劑盒說明書操作步驟進行檢測。

1.2.5 RT-PCR法檢測主動脈壁LOX-1、NF-κB p65、MCP-1mRNA表達：取4組鼠動脈組織100 mg,剪碎,勻漿,使用Trizol試劑提取主動脈壁總RNA,將RNA逆轉錄為cDNA后,以cDNA為模板進行熒光定量PCR擴增。LOX-1、NF-κB p65和MCP-1 mRNA以β-actin為內參,使用2-ΔΔCt方法計算LOX-1、NF-κB p65和MCP-1 mRNA的相對表達量。引物：LOX-1：正向：5’-AAAAAGTCGGGAGAATTGCCTATC-3’;反向5’-CCGGGTTTTTGCTTCTGGTCTT-3’;NF-κB p65：正向：5’-AAGAGGACTGGGCCGGGATGAG-3’;反向：5’-GTTCCCACTTCAAGACCCACCT-3’;MCP-1：正向：5’-ATAGCAGCCACCTTCATTCC-3’;反向：5’-GCTTCTTTGGGACACTTGCT-3’;β-actin：正向：5’-CCTCTATGCCAACACAGTGC-3’;反向：5’-GTCCTCCTGCTTGCTGATCC-3’。

1.2.6 Western blot檢測主動脈壁LOX-1、NF-κB p65、MCP-1蛋白表達：取4組大鼠主動脈組織,加入組織裂解液和PMSF,并使用細胞破碎儀將細胞破碎,低溫裂解。離心后收集上清,測定蛋白濃度。另取適量蛋白變性,電泳進行分離并轉膜,用封閉液封閉待用。加入LOX-1、NF-κB p65和MCP-1(稀釋1∶2 000)一抗,4℃搖床過夜,洗膜,然后再分別加入相應的二抗(稀釋1∶5 000)孵育2 h,ECL顯影,用Image-Pro Plus進行定量分析。

1.2.7 染色觀察大鼠主動脈內皮細胞結構：切取大鼠主動脈(約1 cm),3%戊二醛固定,清洗,1%四氧化鋨二次固定,乙醇脫水,環(huán)氧樹脂浸透、包埋、切片(70 nm左右),醋酸鈾和檸檬酸鉛染色,于透射電鏡下觀察拍照。

2 結果

2.1 4組大鼠血清TG、FBG、TC、LDL、HDL的表達 與對照組比較,模型組FBG、TC、TG、LDL顯著性升高(P<0.05),HDL無統(tǒng)計學意義(P>0.05);與模型組比較,二甲雙胍組和梓醇組FBG、TC、TG、LDL顯著性降低(P<0.05),HDL比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 4組大鼠血清代謝指標比較 n=10,

2.2 4組血清MCP-1、oxLDL比較 與對照組比較,模型組大鼠血清MCP-1和oxLDL顯著升高(P<0.05);與模型組比較,二甲雙胍組和梓醇組MCP-1和oxLDL顯著降低(P<0.05)。見表2。

表2 4組大鼠血清MCP-1和oxLDL指標比較 n=10,

2.3 4組大鼠主動脈壁LOX-1、NF-κB p65、MCP-1 mRNA表達比較 與對照組比較,模型組大鼠主動脈壁LOX-1、NF-κB p65、MCP-1 mRNA表達顯著升高(P<0.05);與模型組比較,二甲雙胍組和梓醇組LOX-1、NF-κB p65、MCP-1 mRNA表達顯著降低(P<0.05)。見表3。

表3 4組大鼠主動脈壁LOX-1、NF-κB p65、MCP-1 mRNA表達比較 n=10,

2.4 Western blot檢測主動脈壁LOX-1、NF-κB p65、MCP-1蛋白表達 與對照組比較,模型組LOX-1、NF-κB p65、MCP-1蛋白表達量均顯著性升高(P<0.05);與模型組比較,二甲雙胍組和梓醇組LOX-1、NF-κB p65、MCP-1蛋白表達量均顯著性降低(P<0.05)。見圖1,表4。

圖1 4組大鼠主動脈壁LOX-1、NF-κB p65、MCP-1蛋白表達

表4 Western blot檢測主動脈壁LOX-1、NF-κB p65、MCP-1蛋白表達 n=10,

2.5 4組大鼠主動脈內皮細胞超微結構圖 對照組大鼠主動脈內皮細胞形態(tài)規(guī)則,胞漿、線粒體形態(tài)正常,細胞核形態(tài)規(guī)則完好。模型組內皮細胞顯著腫脹,連續(xù)性中斷、見空泡,部分內皮細胞有顯著的脫落,細胞核褶皺變形,線粒體、內質網(wǎng)中度腫脹,嵴腫脹紊亂或溶解,見脂滴、糖原顆粒。二甲雙胍組和梓醇組內皮細胞形態(tài)結構輕微腫脹,線粒體、內質網(wǎng)結構正常,細胞核輕微變形,部分內皮細胞有輕微脫落,損傷程度顯著輕于模型組。見圖2。

圖2 4組大鼠主動脈內皮細胞超微結構改變圖(HE×5 000)

3 討論

隨著人類社會經(jīng)濟物質水平的不斷提高,高糖高脂食物的過量攝入,DM逐漸成為人類的一種慢性代謝性疾病。近年來,DM的患病率呈逐漸增加的趨勢,其死亡率僅次于心血管疾病和癌癥,位居第三位[15]。T2DM是DM的主要分型,占DM比例的90%,其病理基礎為高血糖和脂代謝紊亂,均與血管內皮功能障礙有關,其主要是誘因氧化應激導致。因此,抗氧化有望成為治療糖尿病血管病變的新方向[16]。本研究通過高糖高脂飼料喂養(yǎng)和腹腔注射STZ復合因素建立T2DM大鼠模型,結果顯示,模型組大鼠主動脈內皮細胞顯著腫脹,連續(xù)性中斷、見空泡,部分內皮細胞有顯著的脫落現(xiàn)象,細胞核褶皺變形,線粒體、內質網(wǎng)中度腫脹,嵴腫脹紊亂或溶解,見脂滴、糖原顆粒,血液中FBG、TC、TG、HDL和LDL水平顯著升高,提示造模成功,糖尿病大鼠血管發(fā)生病變。

梓醇是一種環(huán)烯醚萜類物質,主要存在于地黃中,梓醇具有抗氧化、抗糖尿病、抗炎等作用[17]。有研究表明,梓醇可上調糖尿病小鼠超氧化物歧化酶(SOD)、谷光甘肽過氧化物酶(GSH)活性,下調丙二醛(MDA),減輕氧化損傷,增強糖尿病肝臟抗氧化能力[18]。還有研究表明,梓醇顯著降低DM大鼠血清中ROS和MDA,提高SOD活性,改善糖和脂肪的代謝紊亂,激活Nrf/HO-1抗氧化通路,減輕糖尿病并發(fā)癥大血管病變氧化損傷[19]。本研究結果表明梓醇可以降低FBG、TC、TG、LDL水平,發(fā)揮大血管病變的保護作用。顯微結構結果也表明梓醇組內皮細胞形態(tài)結構輕微腫脹,線粒體、內質網(wǎng)結構正常,細胞核輕微變形,部分內皮細胞有輕微脫落,損傷程度顯著輕于模型組,也證明上述論斷。

胞內氧化應激主要是高血糖造成的病理損害誘導所致。oxLDL是氧化應激的產物,也是誘發(fā)血管內皮功能紊亂的主要因子,其可降低血管舒張功能,誘導血栓形成和炎性反應[20]。oxLDL主要通過與蛋白受體LOX-1結合發(fā)揮作用,還可以激活NF-κB,在轉錄水平誘導單核細胞趨化蛋白MCP-1表達。有研究表明LOX-1在高糖高脂飼料喂養(yǎng)的AS兔中過表達并在血管內皮功能障礙中發(fā)揮重要作用[21]。Zhu等[22]研究表明梓醇可以降低STZ誘導的糖尿病大鼠血糖、TC、TG、MDA含量,提高SOD、CAT和GSH-Px活性。本研究結果也表明,模型組大鼠LOX-1、NF-κB p65和MCP-1 mRNA表達和蛋白表達水平,MCP-1和oxLDL顯著升高,表明T2DM大鼠大血管病變與oxLDL/LOX-1和NF-κB信號通路有關。梓醇治療后,LOX-1、NF-κB p65和MCP-1 mRNA表達和蛋白表達水平,MCP-1和oxLDL顯著性降低,表明梓醇可通過抑制oxLDL/LOX-1和NF-κB信號通路,對大鼠大血管進行保護。

綜上所述,梓醇可以減輕糖尿病大鼠的氧化應激,其作用機制可能與抑制oxLDL/LDL和NF-κB信號通路有關,其具體的分子機制還需要進一步實驗進行探究。