朱艷 江芳芳 熊累累 盛霞 秦淑蘭 宗明

糖尿病是臨床常見基礎(chǔ)疾病,好發(fā)于老年群體[1]。流行病學(xué)研究顯示,我國老齡化進程加快,60歲以上人口總數(shù)已超過2.2億,其中合并糖尿病總數(shù)超過1億人[2]。持續(xù)的高糖環(huán)境可誘發(fā)多種并發(fā)癥,其中糖尿病足是糖尿病常見且嚴(yán)重的并發(fā)癥[3]。糖尿病足合并的慢性難愈創(chuàng)面可對患者日常生活質(zhì)量產(chǎn)生嚴(yán)重負(fù)面影響,嚴(yán)重者可危及生命[4]。血管生成受損、慢性炎癥、縫隙連接異常和受損的角質(zhì)細(xì)胞遷移和增殖是導(dǎo)致糖尿病病足創(chuàng)面難愈的主要原因,其中角質(zhì)細(xì)胞的功能紊亂是導(dǎo)致糖尿病創(chuàng)面愈合不良的核心靶點[5]。前期實驗發(fā)現(xiàn),miR-96-5p的差異化表達(dá)與糖尿病足病情發(fā)展密切相關(guān),然而miR-96-5p的具體作用機制仍未完全明確?；诖吮尘?本次研究以期采用人角質(zhì)形成細(xì)胞構(gòu)建體外模型并采用高糖培養(yǎng)基處理以模擬糖尿病病理環(huán)境,旨在深入闡明miR-96-5p的差異化表達(dá)對人角質(zhì)形成細(xì)胞增殖、侵襲、遷移等機制的影響,為后續(xù)臨床靶向治療提供思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 人角質(zhì)形成細(xì)胞(human keratinocytes, hKCs)的分離、培養(yǎng)及高糖處理：①人角質(zhì)形成細(xì)胞分離、培養(yǎng) 取正常人群經(jīng)環(huán)狀切除術(shù)后的包皮皮膚,將組織置入75%的乙醇中消毒,角度完成后采用PBS進行沖洗,隨后將結(jié)締組織、血管和皮下脂肪組織剔除,將處理后的組織處理成1 cm×1 cm塊并置入3.3 mg/ml dispase Ⅱ中進行消化,消化維持14 h,環(huán)境溫度保持于4℃。次日取消化完成組織將真皮層和表皮層分娩,并將表皮置入離心管中進行離心,離心完成后再次消化15 min。隨后再次進行離心(5 min,1 500 r/min),并在離心完成后進行震蕩,并過濾吸取細(xì)胞懸液,移液至0.1% Ⅰ型牛膠原的培養(yǎng)皿中,將培養(yǎng)皿中細(xì)胞調(diào)整至3×106個。標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下再次進行培養(yǎng),環(huán)境為5% CO2,37℃。次日待細(xì)胞生長融合至80%時終止消化并離心采集細(xì)胞,并繼續(xù)進行傳代操作。②高糖損傷細(xì)胞模型構(gòu)建：以50 mmol/L葡萄糖終濃度模擬高糖環(huán)境,并設(shè)置12.5 mmol/L葡萄糖濃度的作為正常對照。培養(yǎng)72 h后進行后續(xù)實驗。

1.1.2 主要試劑及儀器：CELLnTEC表皮細(xì)胞培養(yǎng)基：北京百奧創(chuàng)新科技有限公司;MesenCult-XF Medium無血清培養(yǎng)基：上海撫生實業(yè)有限公司;TrypLE Express消化酶、DNase I酶、Annexin V/FITC凋亡檢測試劑盒：上海賽培森生物科有限公司;Ⅱ型dispease酶：上海華藍(lán)化學(xué)科技有限公司;CCK-8試劑：上海炎熙生物科技有限公司;倒置熒光顯微鏡：上海木森生物科技有限公司;CO2培養(yǎng)箱：北京賽瑞福科技有限公司;酶標(biāo)儀：山東善達(dá)儀器有限公司。

1.1.3 分組：取對數(shù)生長期的細(xì)胞,以1×104/孔的密度接種于96孔培養(yǎng)板中,待細(xì)胞貼壁生長后進行分組。共5組,其中2組分別為高糖培養(yǎng)組+ miR-96-5p minic、高糖培養(yǎng)組+ miR-96-5p minic 2組。高糖培養(yǎng)均為培養(yǎng)基葡萄糖濃度為50 mmol/L,且經(jīng)lipo3 000轉(zhuǎn)染試劑要求分組處理細(xì)胞。并設(shè)立空白對照組(培養(yǎng)基葡萄糖濃度5.5 mmol/L),正常培養(yǎng)組(培養(yǎng)基葡萄糖濃度12.5 mmol/L)及高糖培養(yǎng)組(培養(yǎng)基葡萄糖濃度50 mmol/L)作為對照。每組實驗設(shè)置4個復(fù)孔。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞形態(tài)檢查：倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.2.2 細(xì)胞劃痕實驗：培養(yǎng)板背面畫橫線標(biāo)記,用移液槍將細(xì)胞吸取后鋪滿整個底板,并采用10 μl槍頭垂直于孔板制作劃痕,劃痕的刻畫盡可能保持寬度一致。隨后將細(xì)胞培養(yǎng)液吸棄,并采用PBS進行沖洗,沖洗操作重復(fù)3次。并加入無血清培養(yǎng)基后每12小時拍照記錄,參考并計算劃痕面積。

1.2.3 處理后24、48、72 h時使用CCK-8法檢測細(xì)胞增殖活力：采用TrypLE Express消化處理對數(shù)生長期細(xì)胞,并置入計數(shù)板上計數(shù),并按照每100 μL中3 000個細(xì)胞的參數(shù)將細(xì)胞移至96孔板中,并在標(biāo)準(zhǔn)條件下培養(yǎng)2 h,待細(xì)胞貼壁后取細(xì)胞加入10 μL CCK-8溶液并再次置入標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h,采用酶標(biāo)儀檢測450 nm波長處OD值,上述實驗均重復(fù)3次,結(jié)果取平均值。

1.2.4 細(xì)胞遷移能力：Transwell小室鋪膠,待細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后在Transwell小室的下室和上室中加入750 μl的培養(yǎng)基(20%胎牛血清)和200 μl細(xì)胞懸液,并在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h,培養(yǎng)箱環(huán)境同上,培養(yǎng)操作完成后用棉簽小心擦掉上室的基質(zhì)膠和細(xì)胞,并采用PBS進行沖洗,PBS沖洗操作反復(fù)進行3次。隨后對細(xì)胞進行染色(0.1%結(jié)晶紫)和固定(4%多聚甲醛),并拍照采集細(xì)胞遷移細(xì)胞數(shù)。

1.2.5 Western blot檢測BNIP3、FAK、FAK磷酸化蛋白(p-F AK)蛋白的表達(dá)水平：首先提取細(xì)胞中總蛋白(提取液配置：V組織裂解液∶V蛋白酶抑制劑=100∶1),隨后采用BCA法進行蛋白定量,并進行濃縮膠和分離膠的配置,配置操作完成后進行凝膠電泳(每孔滴入40 μg蛋白),電泳操作完成后濕轉(zhuǎn)到PVDF膜上,并進行封閉2 h(環(huán)境為：5%脫脂奶粉),隨后置于4℃冰箱孵育過夜。次日采用5%脫脂奶粉對一抗與二抗原液進行稀釋(V一抗原液：VTBST溶液=1∶1 000)。取出樣本后進行1 h復(fù)溫,并采用TBST進行洗滌,10 min/次,共洗3次。再次在室溫下進行1 h孵育,并再次進行洗滌,15 min/次,共3次。隨后采用ECL化學(xué)發(fā)光法顯色,并分析條帶灰度值(軟件為：Image J),計算BNIP3、FAK、p-F AK蛋白的相對表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)檢查 50 mmol/L高糖處理后角質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)變化,24 h后可見細(xì)胞折光性降低,同時出現(xiàn)空洞,72 h后細(xì)胞失去貼壁性,并出現(xiàn)褶皺。見圖1。

圖1 細(xì)胞形態(tài)檢查;A 50mmol/L處理24 h;B 50mmol/L處理72 h

2.2 細(xì)胞劃痕實驗結(jié)果分析 與空白組和正常培養(yǎng)組比較,高糖培養(yǎng)組、高糖培養(yǎng)+ miR-96-5p minic組和高糖培養(yǎng)+ miR-96-5p inhibitor組的各時間點細(xì)胞遷移量明顯更低(P<0.05),且高糖培養(yǎng)+ miR-96-5p inhibitor組細(xì)胞遷移量明顯高于高糖培養(yǎng)組和高糖培養(yǎng)+ miR-96-5p minic組(P<0.05)。見表1。

表1 細(xì)胞劃痕實驗結(jié)果分析 ×107,

2.3 細(xì)胞增殖實驗結(jié)果分析 與空白組和正常培養(yǎng)組比較,高糖培養(yǎng)組、高糖培養(yǎng)組+ miR-96-5p minic和高糖培養(yǎng)組+ miR-96-5p inhibitor的各時間點細(xì)胞增殖量明顯更低(P<0.05),且高糖培養(yǎng)組+ miR-96-5p inhibitor細(xì)胞增殖明顯高于高糖培養(yǎng)組和高糖培養(yǎng)組+ miR-96-5p minic(P<0.05)。見表2。

表2 細(xì)胞增殖實驗結(jié)果分析 ×105,

2.4 細(xì)胞侵襲實驗結(jié)果分析 與空白組和正常培養(yǎng)組比較,高糖培養(yǎng)組、高糖培養(yǎng)組+ miR-96-5p minic和高糖培養(yǎng)組+ miR-96-5p inhibitor的各時間點細(xì)胞侵襲量明顯更低(P<0.05),且高糖培養(yǎng)組+ miR-96-5p inhibitor細(xì)胞侵襲明顯高于高糖培養(yǎng)組和高糖培養(yǎng)組+ miR-96-5p minic(P<0.05)。見表3。

表3 細(xì)胞侵襲實驗結(jié)果分析 ×105,

2.5 BNIP3、FAK、p-F AK蛋白表達(dá)結(jié)果分析 與空白組和正常培養(yǎng)組比較,高糖培養(yǎng)組、高糖培養(yǎng)組+ miR-96-5p minic和高糖培養(yǎng)組+ miR-96-5p inhibitor的各時間點BNIP3、FAK、p-F AK蛋白表達(dá)量明顯更低(P<0.05),且高糖培養(yǎng)組+ miR-96-5p inhibitor的BNIP3、FAK、p-F AK蛋白表達(dá)量明顯高于高糖培養(yǎng)組和高糖培養(yǎng)組+ miR-96-5p minic,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 BNIP3、FAK、p-F AK蛋白表達(dá)結(jié)果分析

3 討論

創(chuàng)面愈合需要多個生物學(xué)進展配合,如炎癥、重塑、收縮、再上皮化和凝血等,其中再上皮化是影響創(chuàng)面愈合的重要環(huán)節(jié)[6]。再上皮化的核心靶點是角化細(xì)胞的遷移和增殖,是促進糖尿病病足創(chuàng)面愈合的核心靶點。本次研究結(jié)果顯示,角質(zhì)細(xì)胞經(jīng)高糖處理后出現(xiàn)折光性降低,胞體變大,細(xì)胞胞體中出現(xiàn)空洞的表現(xiàn),提示高糖環(huán)境可破壞角質(zhì)細(xì)胞功能,表明改善高糖環(huán)境下角質(zhì)細(xì)胞功能可能為糖尿病足的創(chuàng)面愈合提供新靶點。

近來,microRNAs(MiRNAs)已逐漸成為多種疾病研究中的核心靶點,如在惡性腫瘤、心腦血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病的調(diào)控中發(fā)揮著尤為重要的作用[7]。miRNAs是一種非編碼的小RNA,由大約22個核苷酸組成,通過靶向3’-非翻譯區(qū)(UTR)調(diào)節(jié)基因表達(dá)[8]。新近研究證實,miRNAs在創(chuàng)面愈合的調(diào)控機制中扮演著重要角色,其中有研究證實,miRNA可通過影響角質(zhì)細(xì)胞功能從而影響創(chuàng)面愈合[9]。miR-96-5p是miRNAs家族中的一員,被證實與創(chuàng)面愈合相關(guān)。Zhu等[10]研究證實,miR-96-5p的表達(dá)抑制有助于促進傷口愈合。角質(zhì)細(xì)胞的遷移、增殖和侵襲能力降低是影響創(chuàng)面愈合的核心靶點。本次研究結(jié)果顯示,靶向下調(diào)miR-96-5p的表達(dá)可改善因高糖引起的角質(zhì)細(xì)胞遷移能力、增殖能力和侵襲能力降低,提示miR-96-5p可作為調(diào)節(jié)角質(zhì)細(xì)胞遷移能力的新靶點。Bcl-2/adenovirus E1B19-kDa interacting protein (BNIP3)是調(diào)控機體細(xì)胞功能的重要因子[11]。既往研究證實,BNIP3可通過調(diào)控相關(guān)信號通路的表達(dá)從而促進心臟疾病、肝臟損傷和惡性腫瘤病情發(fā)生發(fā)展[12]。近來研究發(fā)現(xiàn),低氧環(huán)境角質(zhì)細(xì)胞中BNIP3的表達(dá)上調(diào)有利于促進角質(zhì)細(xì)胞的遷移和侵襲能力增強,從而加強傷口愈合[13]。FAK是一種相對分子質(zhì)量為125 kD的酪氨酸激酶,在細(xì)胞通訊尤其是細(xì)胞信號系統(tǒng)中起著至關(guān)重要的作用[14]。既往研究證實,FAK在多種惡性腫瘤細(xì)胞的侵襲、遷移和增殖過程中發(fā)揮著重要作用[15]。Wang等[16]研究顯示,FAK是一種非受體酪氨酸激酶,FAK的表達(dá)可有效促進胃腸道腸道黏膜愈合。Wang等[17]研究顯示,胃腸道黏膜愈合需要上皮片遷移,激活FAK的表達(dá)可有效加速黏膜傷口愈合。Wang等[18]研究顯示,靶向激活FAK的表達(dá)可有效促進傷口愈合。本次研究結(jié)果顯示,高糖處理后BNIP3、FAK、p-FAK蛋白的表達(dá)被抑制,靶向下調(diào)miR-96-5p的表達(dá)后BNIP3、FAK、p-FAK蛋白的表達(dá)水平升高,提示miR-96-5p對角質(zhì)細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響可能通過靶向調(diào)控BNIP3、FAK、p-FAK的表達(dá)實現(xiàn)。考慮高糖環(huán)境下角質(zhì)細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力受到負(fù)面影響并影響糖尿病病足的創(chuàng)面愈合,靶向下調(diào)miR-96-5p的表達(dá)可激活BNIP3/FAK信號通路的表達(dá),BNIP3/FAK信號通路的表達(dá)上調(diào)可促進角質(zhì)細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力,提示臨床可針對角質(zhì)細(xì)胞功能調(diào)控的上游靶點開發(fā)靶向干預(yù)措施從而為糖尿病足患者的臨床治療提供新思路。

綜上所述,miR-96-5p可通過靶向調(diào)控BNIP3/FAK信號通路的表達(dá)從而影響角質(zhì)細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力,進而發(fā)揮影響糖尿病足創(chuàng)面愈合的作用。然后本次實驗仍存在不足,即本次實驗未進一步構(gòu)建糖尿病活體模型以進一步驗證miR-96-5p靶向調(diào)控BNIP3/FAK信號通路后對糖尿病足創(chuàng)面的愈合能力改變情況,故今后仍需進一步開展相關(guān)實驗予以驗證。