洛桑塔杰,張建峰,薛萍,華小懿,馮江江,杜立永

(1.西藏藏醫(yī)藥大學,西藏 拉薩 850000;2.無錫市藥品安全檢驗檢測中心,江蘇 無錫 214122;3.江南大學,江蘇 無錫 214122)

白芥(學名:SinapisalbaL.)是十字花科、白芥屬植物。一年生草本,高達75(-100)cm;莖直立,有分枝。下部葉大頭羽裂;葉柄長1～1.5 cm;上部葉卵形或長圓卵形?？偁罨ㄐ蛴卸鄶?shù)花,果期長達30 cm;花淡黃色,直徑約1 cm;花梗開展或稍外折;花瓣倒卵形,長8～10 mm。長角果近圓柱形,長2～4 cm,寬3～4 mm,直立或彎曲;種子每室1～4個,球形,直徑約2 mm,黃棕色,有細窩穴,花果期6～8月[1-2],如圖1所示。

圖1 白芥圖片

白芥作為一種中草藥植物,被發(fā)掘研究的歷史悠久。然而,現(xiàn)有對白芥的研究報道集中在白芥的種子,即白芥子。白芥以種子入藥,含白芥子甙、芥子酶、芥子堿、4-羥基苯甲酰膽堿、4-羥基苯甲胺等成分,有溫肺豁疾利氣、散結(jié)通絡(luò)止痛功能,用于寒疾喘咳、胸脅脹痛、痰滯、經(jīng)絡(luò)關(guān)節(jié)麻木、痰濕流注、陰疽腫毒等癥[3-6]。

中草藥提取物具有穩(wěn)定、溫和、安全、有效等特點。2023年2月28日,國務院辦公廳發(fā)布中醫(yī)藥振興發(fā)展重大工程實施方案。如何更加高效地利用具有藥效的草本植物,挖掘其隱藏功能與價值成為研究熱點。同樣在化妝品領(lǐng)域,利用中醫(yī)藥特色,研發(fā)出針對性強、性能明顯的活性天然植物原料,進而開發(fā)出美容護膚保養(yǎng)的天然護膚化妝品,正悄然引領(lǐng)全球化妝品潮流。以植物的不同部位入藥,研究其功能,是中藥領(lǐng)域常用手段。相同植物在不同環(huán)境下生長,其各部位成分有所差異,導致其藥效亦有所不同。少數(shù)民族醫(yī)藥因地理位置,獨特的民族文化等因素有其專屬的特色。其中,藏植物藥更是中華民族中醫(yī)藥不可或缺的組成部分,位于中國四大少數(shù)民族——藏、蒙、維、傣族醫(yī)藥之首。相比于普通的草本植物,藏植物藥具備活性高、營養(yǎng)成分高、低污染以及藥力充沛等特點,在抗氧化、抗衰老、防腐及抗炎等諸多方面的功效突出[7]。

此外,黃酮類與酚類物質(zhì)廣泛存在于天然植物中。眾多研究表明,這兩類物質(zhì)具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗腫瘤等生物活性[8-9]。此外,植物源多糖廣泛存在于植物的根、莖、葉、花、果實等器官中,其主要生理功能包括保濕、抗氧化、抗衰老、增強免疫、防曬、皮膚組織修復、促進皮膚血液循環(huán)、抗痤瘡等作用,可用于化妝品中起到改善皮膚環(huán)境、美膚護膚的效果[10]。

綜上,本工作選取藏區(qū)白芥作為研究媒介,首次對白芥葉子部位進行提取分析研究,以充分發(fā)掘白芥的應用價值。通過水與75%乙醇提取對比,對白芥葉子提取物中多糖、黃酮、酚類成分進行含量測定與質(zhì)譜分析,并最終對提取物進行功效評價測試,以初步確認白芥葉子提取物應用于化妝品的潛力。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

乙醇、硫酸(95.0%～98.0%)、苯酚(≥99.0%)、無水亞硫酸鈉(≥97.0%)、九水硝酸鋁(≥99.0%)、亞硝酸鈉(≥99.0%)、氫氧化鈉(≥96.0%)、福林酚試劑(1 mol/L)均購自國藥集團,葡萄糖(≥97.0%)購自上海浩鴻生物醫(yī)藥科技有限公司,沒食子酸(99%)購自北京伊諾凱科技有限公司,維生素C(99.0%)、地塞米松(≥99%)購自源葉生物,透明質(zhì)酸酶、透明質(zhì)酸、十六烷三甲基溴化銨(CTAB)均購自麥克林,醋酸鈉緩沖溶液(廣州化學試劑廠)、高效液相色譜-四級桿靜電軌道肼質(zhì)譜聯(lián)用儀(Thermo,UHPLC-MS-Q Exactive) 色譜柱為:ZORBAX SB-Aq Rapid Resolution HD 2.1×100 mm,1.8 μm。

1.2 方法

1.2.1 去離子水/75%乙醇提取

取藏區(qū)白芥葉子曬干并研磨成粉[0.300 mm(50目)],選用去離子水以及75%乙醇分別作為提取溶劑,料液比(g∶mL,下同)1∶10,1∶20,1∶30的條件下對其進行回流提取4 h,過濾后在45 ℃烘箱烘干。

1.2.2 總黃酮、多糖、酚含量的測定

參照GB/T 20574—2006進行白芥葉子提取物總黃酮含量的測定;參照DB45/T 2143—2020 進行多糖含量測定;參照T/GZCX 020—2022進行總酚含量的測定。

1.2.3 提取物成分分析

0.1 g提取物溶于100 mL去離子水中,超聲60 min,然后在室溫下以10 000 r/min離心10 min,取上清液注入HPLC-MS系統(tǒng)。

采用梯度洗脫法進行液相分析,流動相為超純水與甲醇,梯度設(shè)置如表1所示。

表1 高效液相梯度參數(shù)

1.2.4 體外保濕功效評價

吸取500 μL樣品,加入500 μL超純水,混勻,配制成體積分數(shù)為50%的樣品溶液,隨后進行1∶1稀釋,混勻,共五個濃度。稱取維生素C(對照組)0.100 0 g,加入醋酸鈉緩沖溶液1 mL,配制成質(zhì)量濃度為100 mg/mL,隨后1∶1逐級進行稀釋,共5個濃度。

采用CALT/TM/SOP282-01體外透明質(zhì)酸酶抑制試驗標準操作規(guī)程,進行保濕功效評估。

空白組:1.5 mL EP管中依次加入透明質(zhì)酸50 μL,醋酸鈉緩沖溶液300 μL;

反應組:1.5 mL EP管中依次加入透明質(zhì)酸50 μL,醋酸鈉緩沖溶液150 μL,透明質(zhì)酸酶200 μL;

陽性對照組:1.5 mL EP管中依次加入透明質(zhì)酸50 μL,醋酸鈉緩沖溶液50 μL,透明質(zhì)酸酶200 μL,維生素C 100 μL;

樣品組:1.5 mL EP管中依次加入透明質(zhì)酸50 μL,醋酸鈉緩沖溶液50 μL,透明質(zhì)酸酶200 μL,測試樣品100 μL;

各組在(37±1) ℃下反應150 min,反應結(jié)束后,加入CTAB溶液500 μL,在(37±1) ℃下孵育3 min,取200 μL至96孔板,使用酶標儀(CALT/2017E004)在400 nm波長下測定吸光度值。

按下面公式計算抑制率:

使用GraphPrism進行擬合,計算IC50,即抑制率為50%時測試樣品的濃度。

1.2.5 體外舒緩功效評價[11-13]

將0.5 mL FBS(胎牛血清)加入49.5 mL MEM培養(yǎng)基中,配制成含1%FBS的MEM培養(yǎng)基,作為空白組(NC)。稱取樣品0.200 mL,加入0.800 mL 1% FBSMEM培養(yǎng)基,配成體積分數(shù)為20%的儲備液,再依次稀釋至體積分數(shù)0.20%,0.10%,0.05%,共3個濃度。稱取一定量的地塞米松(陽性對照組PC),加入甲醇溶解,配制成地塞米松儲備液,再使用維持培養(yǎng)液稀釋為工作濃度。試驗分組見表2。

表2 試驗分組

采用CALT/TM/SOP270-01角質(zhì)細胞抗刺激試驗標準操作規(guī)程進行體外舒緩功效評價。

細胞系:人角質(zhì)細胞(HaCaT),來源于上海晶抗生物工程有限公司,代數(shù):32;完全培養(yǎng)液:含10%胎牛血清(FBS)的MEM培養(yǎng)基(FBS,Lot:2500251P);維持培養(yǎng)液:含1% 胎牛血清的MEM培養(yǎng)基(FBS,Lot:2500251P);測試條件:培養(yǎng)箱溫度(37±1) ℃,濕度90%±5%,CO25%±1%;MTT溶液:用PBS將MTT配制成質(zhì)量濃度為5 mg/mL的MTT儲備液,使用0.22 μm的針頭濾器過濾除菌,-20 ℃保存(Lot:20230209)。

1)細胞毒性篩查:將培養(yǎng)的細胞接種于96孔板中,置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h至細胞80%融合。去除原培養(yǎng)液,每孔加入一定量不同濃度樣品稀釋液,在培養(yǎng)箱中暴露(72±1) h。取出培養(yǎng)板,棄去孔中原液體,每孔加入100 μL 1%FBS的MEM培養(yǎng)基。每孔中加入20 μL MTT溶液,在37 ℃下孵育(3±0.5) h。然后去除MTT溶液,各孔中加入100 μL DMSO,避光振蕩10～15 min后在570 nm波長下測定吸光度值。

2)角質(zhì)細胞抗SDS刺激測試:制備一定密度的細胞懸液,將細胞懸液接種于96孔細胞培養(yǎng)板,培養(yǎng)18～24 h。取出培養(yǎng)板,棄去孔中原培養(yǎng)液,除空白對照組外,每孔加入一定量含SDS的維持培養(yǎng)液,空白對照組加入一定量維持培養(yǎng)液,返回培養(yǎng)箱孵育30 min。取出培養(yǎng)板,棄去孔中原培養(yǎng)液,每孔加入一定量PBS清洗1次,然后,空白對照組、模型組每孔加入一定量維持培養(yǎng)液,其余各組加入含樣本或陽性對照的維持培養(yǎng)液,返回培養(yǎng)箱孵育(24±1) h。然后每孔加入一定量含MTT的維持培養(yǎng)液,培養(yǎng)箱孵育3～4 h。去除孔中液體,每孔加入100 μL DMSO,置于振蕩器振蕩10～15 min后,在酶標儀570 nm波長處測定吸光度。

數(shù)據(jù)采用SPSS進行分析,并以均值±標準差表示,如果p<0.05考慮差異具有統(tǒng)計學意義。

細胞活性以空白對照組(Control)細胞活性為100%,計算各組相對細胞活性(Viability),計算公式如下:

2 結(jié)果與討論

如前文所述,現(xiàn)有關(guān)于白芥植物的研究,主要集中在其種子(白芥子),而白芥葉子大多作為廢棄物處置。為了充分拓寬白芥的應用潛能,使其價值最大化,本論文對白芥葉子進行了提取,并對提取物進行了黃酮、多糖、酚類物質(zhì)總量的分析。如圖2以及表3所示,白芥葉子中含有大量的多糖,同時含有一定的黃酮以及酚類物質(zhì),這些物質(zhì)初步說明了其作為化妝品天然植物原料的可能。具體地,相對于75%乙醇作為提取溶劑,以水作為溶劑的白芥葉子提取物中總黃酮含量較高(最高可達48.45 mg/g,料液比1∶30),但是多糖和酚類物質(zhì)的含量較低。醇提物中,多糖和酚類物質(zhì)的含量相對較高,分別可高達654 mg/g(料液比1∶30)與64.7 mg/g(料液比1∶10)。

表3 白芥葉子提取物成分含量表

圖2 組方1水/75%乙醇提取物的黃酮、多糖、酚含量分析

此外,現(xiàn)有報道顯示白芥子的主要的活性物為芥子堿、芥子苷以及部分油脂等。同種植物不同部位包含的主要活性物質(zhì)可能不盡相同。為了進一步分析白芥葉子中所含物質(zhì)的種類,利用采用UHPLC-MS-Q Exactive法對1∶30料液比提取物成分進行分析,結(jié)果如圖3與圖4所示。

注:(1～22)為白芥葉子水提與75%醇提共同含有的物質(zhì),醇提圖中不再重復列出。

圖4 白芥葉子75%乙醇提取物的質(zhì)譜分析

在白芥葉子水提取物(圖3)中,主要存在的黃酮類物質(zhì)有根皮素、桑黃素、槲皮素;主要存在的酚類物質(zhì)可能為L-酪氨酸、對羥基苯甲醛、4-羥基-3-甲氧桂皮醛、4-羥基肉桂酸甲酯、7-羥基香豆素以及肉豆蔻木素。相對地,在白芥葉子醇提物(圖4)中,黃酮類物質(zhì)除了根皮素、桑黃素、槲皮素外種類有所增加,還包含三葉苷、圣草酚、染料木黃酮、柚皮素查爾酮;酚類物質(zhì)種類也有所增加,包含大麥芽堿、7,8-二羥基-6-甲氧基香豆素、4-甲氧基水楊酸、3-羥基-4-甲氧基苯甲酸、2,4-二羥基-6-甲基苯甲酸、綠原酸、隱綠原酸、3-羥基-4-甲氧基肉桂酸。

需要說明的是,質(zhì)譜測試幾乎沒有檢測出糖類物質(zhì),這可能是因為多糖類物質(zhì)在本文采取的測試條件下比較難進行分辨。此外,除了本文關(guān)注的黃酮、酚類物質(zhì)外,白芥葉子中還存在多種苷、生物堿、氨基酸類物質(zhì),這些天然成分也會賦予天然提取物更多的功效與應用性,可以作為后續(xù)進一步研究。

為了進一步考察白芥葉子提取物在化妝品中的應用潛力,本文進一步對1∶30料液比下白潔葉子水提取物進行體外保濕與舒緩的功效測試。

參與皮膚保濕的關(guān)鍵成分之一是透明質(zhì)酸,其與天然保濕因子(NMF)、皮膚的天然脂質(zhì)雙分子層一起作用,促進和維持表皮和底層的保濕[11-14]。當皮膚障礙受損,會產(chǎn)生透明質(zhì)酸酶,進一步使透明質(zhì)酸分解。本文主要考察白芥葉子提取物對透明質(zhì)酸酶的抑制作用。透明質(zhì)酸與CTAB陽離子表面活性劑可發(fā)生絡(luò)合反應,產(chǎn)生混濁現(xiàn)象,進而可以利用比色法檢測樣品對透明質(zhì)酸酶的抑制結(jié)果,來評價其功效。如表4所示,白芥葉子水提取物在體積分數(shù)為50%時,對透明質(zhì)酸酶的抑制率高達76%左右,隨著濃度的降低,抑制效果降低。除此之外,經(jīng)計算,陽性對照組IC50為54.44 mg/mL(95%Cl:51.96～57.04 mg/mL),而白芥葉子提取物IC50液均無法計算(極低)。而受試物IC50越小,受試物抑制透明質(zhì)酸酶能力越強。這些結(jié)果均說明白芥葉子水提取物對透明質(zhì)酸酶均有抑制作用,進而表明其具有一定保濕效果。

表4 白芥葉子水提取物的透明質(zhì)酸酶抑制率

本文先采用SDS刺激 HaCaT角質(zhì)細胞,然后將樣品作用于刺激后的角質(zhì)細胞,通過檢測角質(zhì)細胞的細胞活力的變化,評價樣品的舒緩功效[15-17]。如表5與圖5所示,在本文選取的方法下,模型組(M)與空白對照組(NC)相比,細胞活力明顯降低(p<0.05);陽性對照組與模型組相比,細胞活力明顯升高(p<0.05),表明造模成功。與模型組相比,白芥葉子水提取物(1∶30 提取液)在體積分數(shù)0.20%,0.10%,0.05%測試下細胞活力分別顯著升高了19.51%,15.89%,6.05%。

表5 不同組別細胞活力差異比較(Mean±SD)

綜上所述,白芥葉子提取物在本文實驗條件下,具有較好的保濕與舒緩功效,具備作為保濕、舒緩功效天然化妝品原料的潛力。

3 結(jié)論

利用水與75%乙醇為溶劑對藏區(qū)白芥葉子進行了提取,并對其提取物中的黃酮、多糖以及酚類物質(zhì)進行了測定,同時選取質(zhì)譜測試對各提取物成分進行了分析。與現(xiàn)有白芥子的成分報道不同,本文中白芥葉子中富含黃酮、多糖以及酚類物質(zhì)。采用1∶30料液比的水提物進行了保濕以及舒緩體外功效測試,結(jié)果表明白芥葉子水提取物(1∶30提取液)在體積分數(shù)為50%時,對透明質(zhì)酸酶的抑制率高達76%左右;同時,在體積分數(shù)0.20%測試下HaCaT角質(zhì)細胞活力可顯著升高19.51%。這些結(jié)果表明,白芥葉子提取物具有作為保濕舒緩類天然化妝品原料的潛力。同時,本工作首次選取藏區(qū)白芥葉子作為研究對象,變廢為寶,有利于藏藥價值的最大化。