丘建媚,劉付薇,陳星梅,莊遠(yuǎn)杯,張聲源,吳俊標(biāo)

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院,廣州 510006;2.梅州市中醫(yī)醫(yī)院藥學(xué)部,梅州 514071;3.嘉應(yīng)學(xué)院廣東省山區(qū)特色農(nóng)業(yè)資源保護(hù)與精準(zhǔn)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,梅州 514015;4.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥學(xué)部,廣州 510120)

2021年全球成年糖尿病患者達(dá)5.37億例,造成醫(yī)療衛(wèi)生支出超過9 660億美元[1-2]。餐后高血糖是2型糖尿病發(fā)病歷程之一,是引起血管并發(fā)癥的重要因素[3]。α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶是延緩餐后血糖升高的關(guān)鍵靶點(diǎn)[4-5]?，F(xiàn)用于臨床的α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制劑具有一定的胃腸道副作用和肝毒性,胃腸和肝功能不全者并不適用[6]。我國中草藥植物資源豐富,很多中草藥療效確切、副作用小,是挖掘新藥先導(dǎo)化合物的重要源泉,已從中研發(fā)創(chuàng)新藥物40余種[7]?？图胰搜匾u了中原醫(yī)藥習(xí)慣,且在遷徙過程中形成獨(dú)具客家特色的用藥習(xí)慣。梅州市是“世界客都”,所轄蕉嶺縣是世界第七個(gè)、全國第四個(gè)“長壽之鄉(xiāng)”,其長壽與崇尚“寓醫(yī)于食”關(guān)系密切,形成的獨(dú)具地域特色的客家菜系是廣東三大菜系之一[8]。梅州客家習(xí)用藥膳,梅州民間常用中草藥有193種,常將中草藥配以龍骨、雞、鴨等煲湯,有餐前喝湯的飲食習(xí)慣,這與阿卡波糖等降低餐后血糖的藥物在餐前服用一致[9-10],筆者前期研究發(fā)現(xiàn)梅州客家常用藥膳湯料牛奶樹根等具有良好的體外α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶抑制活性[11]。傳統(tǒng)用藥經(jīng)驗(yàn)是創(chuàng)新藥物挖掘的線索和依據(jù),筆者從梅州客家常用藥膳、涼茶中選取使用頻數(shù)較高41種中草藥,探究其對α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶活性的影響,并對活性最強(qiáng)的品種通過酶促動(dòng)力學(xué)方法與Lineweaver-Burk曲線探究其對酶的抑制作用類型,為α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制劑的研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1藥物 41種供試中草藥樣品采自梅州市梅江區(qū),經(jīng)嘉應(yīng)學(xué)院醫(yī)學(xué)院客家藥用生物資源研究所張聲源副教授鑒定為所屬品種,藥用植物詳細(xì)信息見表1,樣品標(biāo)本留存于嘉應(yīng)學(xué)院醫(yī)學(xué)院天然藥物標(biāo)本館(編號:202206001-202206041)。

表1 供試中草藥樣品信息Tab.1 Information of Chinese herbal medicine sample for testing

1.2試劑 α-葡萄糖苷酶(批號:079M4145V)、牛血清蛋白(BSA,批號:WXBC2903V)、α-淀粉酶(批號:SLCG0041)均購自Sigma有限公司,對-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(4-Nitrophenyl-α-D-mannopyranoside,pNPG,上海源葉科技有限公司,批號:K04F8B28175),阿卡波糖(德國拜耳有限公司,批號:BJ50338,規(guī)格:每片50 mg),3,5二硝基水楊酸(3,5-Dinitrosalicylic acid,DNS,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,批號:20170904),葡萄糖(西隴科學(xué)股份有限公司,批號:1611021),可溶性淀粉(天津市大茂化學(xué)試劑廠,批號:20180501),無水碳酸鈉(批號:C10900552)、磷酸氫二鉀(批號:C11105355)、磷酸二氫鉀(批號:C11083450)、對硝基苯酚(批號:C10631132)均購自上海麥克林生化科技有限公司。

1.3儀器與設(shè)備 WJX-A1000型高速多功能粉碎機(jī)(浙江省永康市紅太陽機(jī)電有限公司),KQ-700DV數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司),BT125D型電子分析天平(德國賽多利斯有限公司,感量:0.1 mg),BS110s型電子分析天平(德國賽多利斯有限公司),N-1100V型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛朗儀器有限公司),DHG-9246A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司),數(shù)顯HH-4系列電熱恒溫水浴鍋(安慶潔佳儀器設(shè)備有限公司),PHS-3C酸度計(jì)(上海錦幻儀器儀表有限公司),MING-CHE 24UV超純水機(jī)(法國Merck Millipore公司),Spark型多功能酶標(biāo)儀[帝肯(上海)貿(mào)易有限公司]。

1.4提取物的制備 41種中草藥經(jīng)50 ℃烘干,粉碎,過篩[80目,篩孔內(nèi)徑為(180±7.6) μm],稱取中草藥粉末各2.0 kg,95%乙醇超聲提取3次(45 ℃,700 W,40 kHz,30 min),四層紗布過濾,合并濾液,濃縮得浸膏,真空干燥,備用。樣品使用前用蒸餾水溶解,8 000 r·min-1(r=100 mm)離心10 min,4 ℃冷藏備用[12]。

1.5對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用 于96孔板上依次加入磷酸鹽緩沖溶液(PBS,pH值6.8)110 μL,樣品溶液10 μL,0.1 U·mL-1α-葡萄糖苷酶溶液20 μL,混勻,37 ℃恒溫孵育15 min后,加入4 mmol·L-1pNPG溶液20 μL,混勻,37 ℃恒溫反應(yīng)15 min,加入0.2 mol·L-1碳酸鈉溶液80 μL,于波長405 nm處測定吸光度,即為樣品組(C),實(shí)驗(yàn)以阿卡波糖為陽性對照,同時(shí)設(shè)空白組(A),空白對照組(B),背景對照組(D),各實(shí)驗(yàn)組體系見表2[13]。α-葡萄糖苷酶抑制率(%)=[1-(C-D)/(A-B)]×100%。

表2 α-葡萄糖苷酶抑制實(shí)驗(yàn)各試劑加入量Tab.2 Dosage of each reagent in α-glucosidase inhibition experiment μL

1.6對α-淀粉酶活性的抑制作用 于5 mL試管依次加入樣品溶液120 μL,α-淀粉酶溶液120 μL,混勻,37 ℃孵育5 min,加入1%可溶性淀粉溶液120 μL,混勻,37 ℃反應(yīng)15 min,立即加入DNS 200 μL顯色并置于沸水中煮沸5 min終止反應(yīng),隨后放置于冰水中靜置5 min,加入PBS溶液1 040 μL,于540 nm下測定吸光度,即為樣品組(C),實(shí)驗(yàn)以阿卡波糖為陽性對照,同時(shí)設(shè)空白組(A),空白對照組(B),背景對照組(D),各實(shí)驗(yàn)組體系見表3[14]。α-淀粉酶抑制率(%)=[1-(C-D)/(A-B)]×100%。

表3 α-淀粉酶抑制實(shí)驗(yàn)各試劑加入量Tab.3 Dosage of each reagent in α-amylase inhibition experiment μL

1.7對α-葡萄糖苷酶抑制作用動(dòng)力學(xué) 在pNPG濃度為4 mmol·L-1條件下,分別測定3組不同濃度樣品在不同α-葡萄糖苷酶活力(0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1、0.12、0.14 U·mL-1)時(shí)的酶促反應(yīng)初速度,以α-葡萄糖苷酶活力(U·mL-1)對酶促反應(yīng)初速度(mmol·L-1·min-1)作圖,判斷其對α-葡萄糖苷酶的可逆或不可逆抑制類型。在α-葡萄糖苷酶活力為0.1 U·mL-1,分別測定3組不同濃度樣品在不同pNPG濃度(0.5、1、2、4、8、16 mmol·L-1)時(shí)的酶促反應(yīng)初速度,以pNPG濃度的倒數(shù)對酶促反應(yīng)初速度的倒數(shù)繪制Lineweaver-burk雙倒數(shù)曲線,計(jì)算得出動(dòng)力學(xué)參數(shù)Vmax和Km,判斷其對α-葡萄糖苷酶的競爭、非競爭或反競爭抑制類型[15]。

1.8對α-淀粉酶抑制作用動(dòng)力學(xué) 固定淀粉濃度為10 mg·mL-1,分別測定3組不同濃度樣品在不同α-淀粉酶活力(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg·mL-1)下的酶促反應(yīng)初速率,以酶活力為橫坐標(biāo),反應(yīng)初速率為縱坐標(biāo)作圖,判斷其可逆或不可逆抑制類型。在α-淀粉酶活力為0.3 mg·mL-1條件下,測定3組不同濃度樣品在不同淀粉濃度(0.75、1.25、2.5、5、10 mg·mL-1)的反應(yīng)初速率,以淀粉濃度的倒數(shù)為橫坐標(biāo),反應(yīng)初速率的倒數(shù)為縱坐標(biāo)繪制Lineweaver-Burk 曲線,計(jì)算得出動(dòng)力學(xué)參數(shù)Vmax和Km,判斷其對α-淀粉酶的競爭、非競爭或反競爭抑制類型[16]。

2 結(jié)果

2.1對α-葡萄糖苷酶的抑制作用 見表4,41種梅州客家常用中草藥中,40種具有一定的α-葡萄糖苷酶抑制活性,IC50值低于10 mg·mL-1有15種,分別為九節(jié)、馬尾松、地棯、絞股藍(lán)、姜薯、桑白皮、桑葉、金線吊烏龜、了哥王、艾根、艾葉、枸杞葉、溪黃草、土茯苓、野山楂,其中九節(jié)、馬尾松、土茯苓3種中草藥抑制活性強(qiáng)于陽性對照阿卡波糖,抑制活性最強(qiáng)的為九節(jié)[IC50=(0.170±0.001) mg·mL-1]。

表4 樣品對α-葡萄糖苷酶的抑制活性Tab.4 The inhibitory activity of samples on α-glucosidase

2.2對α-淀粉酶的抑制作用 見表5,41種梅州客家常用中草藥中,23種具有一定的α-淀粉酶抑制活性,IC50值低于10 mg·mL-1的有4種,分別為九節(jié)、馬尾松、地棯、紅冬蛇菰,但抑制活性均低于陽性對照阿卡波糖,其中九節(jié)在41種梅州客家常用中草藥中抑制活性最強(qiáng)(IC50=0.090±0.001 mg·mL-1),抑制活性接近于阿卡波糖[IC50=(0.068±0.001) mg·mL-1]。

表5 樣品對α-淀粉酶的抑制活性Tab.5 The inhibitory activity of samples on α-amylase

結(jié)合表4、表5可知,41種梅州客家常用中草藥中九節(jié)具有最強(qiáng)的α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶抑制活性,故進(jìn)一步探討其酶抑制類型。

2.3對α-葡萄糖苷酶的抑制作用動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)

2.3.1阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶抑制類型 由圖1可知,以酶活力為橫坐標(biāo),酶促反應(yīng)初速度為縱坐標(biāo),阿卡波糖濃度為0、1、2 mg·mL-1的3組擬合直線相交于原點(diǎn),且隨質(zhì)量濃度的增大,直線斜率越小,即反應(yīng)初速率越小,為可逆性抑制類型。圖2可知,以pNPG濃度的倒數(shù)(1/S)為橫坐標(biāo),酶促反應(yīng)初速率的倒數(shù)(1/V0)為縱坐標(biāo),阿卡波糖質(zhì)量濃度為0、1、2 mg·mL-1的3組擬合直線相交于Y軸正半軸的同一點(diǎn),即Vmax不變,值為16.13 mmol·L-1·min-1,且隨著質(zhì)量濃度的增大,Km值增大,為競爭性抑制類型。由此可知阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶的抑制類型為可逆競爭性抑制。

圖1 阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶酶促反應(yīng)初速率的影響Fig.1 Effect of acarbose on the enzymatic reaction initial rate of α-glucosidase

圖2 阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶作用的Lineweaver-Burk曲線Fig.2 Lineweaver-Burk curves of acarbose on α-glucosidase

2.3.2九節(jié)對α-葡萄糖苷酶抑制類型 由圖3可知,九節(jié)提取物質(zhì)量濃度為0、0.045、0.09 mg·mL-1的3組擬合直線相交于原點(diǎn),且隨濃度的增大,直線斜率越小,即反應(yīng)初速率越小,為可逆性抑制類型。九節(jié)提取物對α-葡萄糖苷酶抑制作用的Lineweaver-Burk 雙倒數(shù)曲線結(jié)果見圖4,3組直線相交于Y軸正半軸的同一點(diǎn),且隨著質(zhì)量濃度的增大,Km值增大,為競爭性抑制類型。由此可知九節(jié)對α-葡萄糖苷酶的抑制類型為可逆競爭性抑制。

圖3 九節(jié)對α-葡萄糖苷酶酶促反應(yīng)初速率的影響Fig.3 Effect of Psychotria rubra on the enzymatic reaction initial rate of α-glucosidase

圖4 九節(jié)對α-葡萄糖苷酶抑制作用的Lineweaver-Burk曲線Fig.4 Lineweaver-Burk curves of Psychotria rubra on α-glucosidase

2.4對α-淀粉酶的抑制作用動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)

2.4.1阿卡波糖對α-淀粉酶抑制類型 由圖5可知,以酶活力為橫坐標(biāo),酶促反應(yīng)初速度為縱坐標(biāo),阿卡波糖質(zhì)量濃度為0、0.03 4、0.068 mg·mL-1的3組擬合直線相交于原點(diǎn),且隨質(zhì)量濃度的增大,直線斜率越小,即反應(yīng)初速率越小,為可逆性抑制類型。圖6可知,以淀粉濃度的倒數(shù)(1/S)為橫坐標(biāo),酶促反應(yīng)初速率的倒數(shù)(1/V0)為縱坐標(biāo),阿卡波糖濃度為0、0.034、0.068 mg·mL-1的3組擬合直線相交于第二象限,為競爭性與非競爭性混合型。由此可知,阿卡波糖對α-淀粉酶為可逆的競爭性與非競爭性混合型抑制類型。

圖5 阿卡波糖對α-淀粉酶酶促反應(yīng)初速率的影響Fig.5 Effect of acarbose on the enzymatic reaction initial rate of α-amylase

圖6 阿卡波糖對α-淀粉酶抑制作用的Lineweaver-Burk曲線Fig.6 Lineweaver-Burk curves of acarbose on α-amylase

2.4.2九節(jié)對α-淀粉酶抑制類型 由圖7可知,九節(jié)提取物濃度為0、0.022 5、0.09 mg·mL-1的3組擬合直線相交于原點(diǎn),且隨質(zhì)量濃度的增大,直線斜率越小,即反應(yīng)初速率越小,為可逆性抑制類型。九節(jié)提取物對α-淀粉酶抑制作用的Lineweaver-Burk 雙倒數(shù)曲線結(jié)果見圖8,三組直線交于X負(fù)軸同一點(diǎn),即抑制常數(shù)Ki不變,為1.05 mg·mL-1;斜率隨著濃度的增大而增大,反應(yīng)速率Vmax隨抑制劑濃度增大而變小,為典型的非競爭性類型。由此可知,九節(jié)提取物對α-淀粉酶抑制作用為可逆非競爭性抑制。

圖7 九節(jié)對α-淀粉酶酶促反應(yīng)初速率的影響Fig.7 Effect of Psychotria rubra on the enzymatic reaction initial rate of α-amylase

圖8 九節(jié)對α-淀粉酶抑制作用的Lineweaver-Burk曲線Fig.8 Lineweaver-Burk curves of Psychotria rubra on α-amylase

3 討論

筆者在本實(shí)驗(yàn)采用pNPG法、DNS法研究發(fā)現(xiàn),41種梅州客家常用中草藥中40種具α-葡萄糖苷酶抑制活性、23種具α-淀粉酶抑制活性,對α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶均具抑制活性的有22種,其中九節(jié)對α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶抑制活性最強(qiáng),IC50分別為(0.17±0.001)、(0.09±0.001) mg·mL-1。阿卡波糖導(dǎo)致的胃腸脹氣副作用與其對α-淀粉酶的過度抑制有關(guān)[17],與陽性對照阿卡波糖比較,梅州客家常用涼茶九節(jié)(Psychotriaasiatica)對α-葡萄糖苷酶抑制活性強(qiáng)于阿卡波糖[IC50=(2.060±0.001) mg·mL-1],對α-淀粉酶抑制活性低于阿卡波糖[IC50=(0.068±0.001) mg·mL-1],提示九節(jié)可能具有更強(qiáng)的降血糖活性和更高的安全性。進(jìn)一步采用酶促動(dòng)力學(xué)方法與Lineweaver-Burk曲線分析顯示,九節(jié)對α-葡萄糖苷酶為可逆競爭性抑制類型,這與阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶抑制類型一致;而九節(jié)對α-淀粉酶為可逆非競爭性抑制,表明九節(jié)是通過作用于酶活性中心之外的基團(tuán)影響底物的分解[18],這與阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶抑制類型不同,提示九節(jié)極有可能是一種新型的糖苷酶抑制劑,后續(xù)可采用活性靶向分離技術(shù)和波譜技術(shù)獲得活性先導(dǎo)化合物,采用細(xì)胞、動(dòng)物水平探究降血糖作用機(jī)制。本研究通過高通量篩選梅州客家41種常用中草藥對α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶的抑制活性,明確了九節(jié)具有良好的抑制活性,后續(xù)可對九節(jié)開展系統(tǒng)的降血糖活性成分及其作用機(jī)制,進(jìn)一步明確其食用和藥用的科學(xué)內(nèi)涵。