王 軒,楊 星,楊秀玉,周天慧,彭文繡,趙富華,葉能勝,張秀英,*,韓寧寧,*

(1. 中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所,北京 100081;2. 北京市疾病預(yù)防控制中心 食物中毒診斷溯源技術(shù)北京市重點(diǎn)實驗室,北京 100013;3. 首都師范大學(xué)化學(xué)系,北京 100048)

國家獸藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是規(guī)范獸藥質(zhì)量的一把尺子,是獸藥質(zhì)量檢驗中的實物標(biāo)準(zhǔn)[1]。為了確保獸用化學(xué)藥品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的賦值準(zhǔn)確性,其定值方式一般采用質(zhì)量平衡法,該方法是通過將水分、揮發(fā)性物質(zhì)、灰分、成鹽離子等雜質(zhì)扣除,再根據(jù)主成分在有機(jī)成分中的百分比來確定標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)含量[2-3]。這其中,成鹽離子的含量測定,直接影響了獸藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的純度準(zhǔn)確性。因此,如何對獸藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中的成鹽離子進(jìn)行準(zhǔn)確定值尤為重要。

多種獸用原料藥是以成鹽的形式存在,以提升獸藥的溶解度和生物利用度。目前,成鹽離子的賦值方式通常采用液相色譜—蒸發(fā)光散射檢測器法[4-5]、原子吸收光譜法[6]、離子色譜法[7-9]等。液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器是一種通用型檢測方法,也可用于成鹽離子的測定。但由于其檢測窗口較小,線性范圍一般較窄,不利于新方法的開發(fā)。電感耦合等離子質(zhì)譜法擁有出色的檢測靈敏度,但伴隨著更加復(fù)雜的前處理過程和更高的檢測成本。對于獸藥原料藥,成鹽離子含量較高,離子色譜法即可滿足其需求,更加經(jīng)濟(jì)適用。綜上分析,在方法建立初期,本研究選擇離子色譜法作為分析手段開展研究工作。近年來,離子色譜法因其高效準(zhǔn)確、價格低廉、能夠有效對多種離子進(jìn)行同時檢測等特點(diǎn),受到越來越多的關(guān)注[10],并且已經(jīng)廣泛應(yīng)用于各類檢驗檢測工作中,包括環(huán)境分析[11-13]、食品分析[14-17]、考古研究[18-20]和藥物分析[21-23]等領(lǐng)域。張才煜等[9]建立了測定化學(xué)對照品中鹽酸鹽含量的離子色譜法,對維生素BT、鹽酸克侖特羅等對照品中的氯離子含量進(jìn)行檢測定,并深入討論了原料成鹽情況對化學(xué)對照品的賦值造成的影響,同時結(jié)合核磁定量法對其結(jié)果進(jìn)行確證。潘忠全等[21]建立了一種同時測定藥品中巴比妥酸和硝酸鹽的離子色譜法,實現(xiàn)了巴比妥等樣品中微量巴比妥酸和硝酸鹽的定量分析。在藥物分析領(lǐng)域,離子色譜法已逐漸成為成鹽離子定量分析的首選方法。

為探索一種普適性獸藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中鈉含量的測定方法,本文選擇安乃近對照品原料以及青霉素、磺胺氯達(dá)嗪鈉、磺胺氯吡嗪鈉、莫能菌素對照品作為分析對象,以離子色譜法作為測定手段,建立一種能夠準(zhǔn)確定值獸藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中鈉含量的方法。本方法靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng),可作為國家獸藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中鈉離子檢測的通用方法,為國家獸藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的準(zhǔn)確賦值提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 Dionex Integrion離子色譜儀,配有CSRS 300(4 mm)抑制器、電導(dǎo)檢測器和甲烷磺酸(MSA)在線淋洗液發(fā)生器(Thermo公司,Chromeleon 7色譜工作站);Milli-Q去離子水發(fā)生系統(tǒng)(Millipore公司);METTLER XSR205DU型分析天平(Mettler公司)。

安乃近原料來自某獸藥生產(chǎn)企業(yè)(批號2204088),青霉素對照品(批號:K0251509)、磺胺氯吡嗪鈉對照品(批號:H0981912)、磺胺氯達(dá)嗪鈉對照品(批號:H0221704)、莫能菌素對照品(批號K0281911)來自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所,其原料均來源于獸藥生產(chǎn)企業(yè)。鈉元素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)[GBW(E)080127,含量1000 μg/mL]來自中國計量科學(xué)院,水中鋰鈉鉀鈣鎂銨根成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(含Li+50 mg/L、Na+200 mg/L、NH4+400 mg/L、K+200 mg/L、Mg2+200 mg/L、Ca2+1000 mg/L)(SGB-YYA01039H)和甲烷磺酸淋洗液發(fā)生罐(Dionex EGC III)購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司,甲醇為色譜純,水為超純水。

1.2 色譜條件 采用DIONEX IonPac CX12A(250 mm×4 mm)陽離子交換色譜柱,DIONEX IonPac CG12A(50 mm×4 mm)保護(hù)柱,以淋洗液發(fā)生器產(chǎn)生的23 mmol/L甲烷磺酸溶液為流動相,流速1.0 mL/min,檢測方式為電導(dǎo)檢測器,進(jìn)樣體積25 μL,檢測池溫度35 ℃,柱溫35 ℃,采用Chromeleon 7色譜工作站對數(shù)據(jù)進(jìn)行采集和處理。

1.3 溶液的制備

1.3.1 混合陽離子溶液 精密量取陽離子混合標(biāo)準(zhǔn)溶液5 mL,置100 mL量瓶中,用去離子水稀釋至刻度,搖勻,作為混合陽離子溶液。

1.3.2 對照品溶液 精密量取鈉單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液(含Na+1000 μg/mL)1 mL,置100 mL量瓶中,用去離子水稀釋至刻度,搖勻,作為對照品溶液。

1.3.3 供試品溶液 取安乃近原料、青霉素、磺胺氯吡嗪鈉、磺胺氯達(dá)嗪鈉對照品適量,加去離子水溶解并稀釋至每毫升約含10 μg鈉離子的溶液,作為供試品溶液。對于水溶性較差的原料或?qū)φ掌?如莫能菌素),可在溶解時加入適量有機(jī)溶劑助溶,并用去離子水稀釋至每毫升約含10 μg鈉離子的溶液。

1.3.4 空白溶液 對于水溶性好的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),以去離子水作為空白溶液。對于水溶性較差的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),配制與供試品溶液相同的溶劑空白溶液。

1.4 計算公式 本方法測量結(jié)果的計算公式為:鈉含量=(供試品溶液峰面積×對照品體積×對照品含量×供試品稀釋倍數(shù))×100%/(對照品溶液峰面積×供試品質(zhì)量×對照品稀釋倍數(shù))

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 專屬性考察 取1.3.1項下混合陽離子溶液,照1.2項下色譜條件測定。結(jié)果顯示,在該色譜條件下,Na+與其他陽離子間分離效果良好,相鄰色譜峰間分離度均大于2.0,在含量測定的過程中不受其他陽離子的干擾,方法專屬性良好。專屬性色譜圖見圖1。

圖1 專屬性離子色譜圖。其中:1為Li+、2為Na+、3為K+、4為NH4+、5為Mg2+、6為Ca2+

2.1.2 線性關(guān)系考察 取鈉元素標(biāo)準(zhǔn)溶液適量,用去離子水稀釋制成濃度為50、20、10、5、1、0.5、0.2、0.1 μg/mL的溶液。以線性曲線溶液色譜圖中峰面積對鈉離子濃度進(jìn)行線性回歸,得到回歸方程為:y=0.253x+0.0258(r2=0.9999)。本方法在鈉離子濃度為0.1～50 μg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。對照品色譜圖見圖2。其中,銨根離子存在于實驗用去離子水中。

圖2 鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液(10 μg/mL)離子色譜圖。其中:1為Na+、2為NH4+

2.1.3 精密度試驗 取濃度為10 μg/mL的對照品溶液,照1.2項下色譜條件,在同一天內(nèi)連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次,計算保留時間和峰面積的精密度。Na+峰面積的精密度按保留時間計為0.05%,按峰面積計為0.44%。結(jié)果表明本方法精密度良好。

2.1.4 重復(fù)性試驗 平行配制安乃近供試品溶液6份,照2.1項下色譜條件進(jìn)行測定。Na+含量分別為6.49%、6.47%、6.35%、6.56%、6.41%、6.40%,平均值為6.45%,RSD為1.06%(n=6)。平行配制青霉素供試品溶液6份,照2.1項下色譜條件進(jìn)行測定。Na+含量分別為6.37%、6.48%、6.39%、6.42%、6.51%、6.49%,平均值為6.44%,RSD為0.82%(n=6)。實驗結(jié)果表明本方法重復(fù)性良好。

2.1.5 回收率試驗 采用在安乃近原料和青霉素對照品中標(biāo)準(zhǔn)加入鈉離子的方法測定本方法的回收率。取安乃近原料約387 mg,置于50 mL量瓶中,加水溶解并稀釋至刻度,搖勻,作為回收率試驗儲備溶液。精密量取9份上述溶液,每份1 mL,分別置于9個100 mL量瓶中,再精密加入鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL,用水稀釋至刻度,搖勻,制成低、中、高3個水平的溶液各三份。照2.1項下色譜條件,采用外標(biāo)法測定回收率。取青霉素對照品適量,同法測定,結(jié)果見表1。安乃近中鈉離子平均回收率為102.7%(n=9),RSD為0.59%。青霉素中鈉離子平均回收率為99.4%(n=9),RSD為0.42%。結(jié)果表明,本方法回收率良好。

表1 鈉離子在安乃近原料和青霉素對照品中的回收率

2.1.6 檢測限與定量限 取鈉離子線性試驗溶液適量,用水逐級稀釋至一定濃度,以信噪比大于3作為檢測限,以信噪比大于10作為定量限。方法檢測限為0.02 μg/mL,定量限為0.05 μg/mL。

2.1.7 耐用性試驗 采用1.3.1項下混合陽離子溶液,使用不同淋洗液濃度、柱溫、流速對方法耐用性進(jìn)行考察。結(jié)果如表2所示。在不同淋洗液濃度、柱溫、流速條件下,Na+與其他陽離子間的分離度均大于2.0,理論塔板數(shù)大于5000,表明方法耐用性良好。

表2 方法耐用性考察

2.2 樣品測定 取1.3.3項下供試品溶液,照1.2項下色譜條件測定,采用外標(biāo)法以峰面積計算,結(jié)果見表3。典型離子色譜圖和溶劑空白圖見圖3、圖4所示。其中,理論含量為根據(jù)分子量,按100%成鹽率計算結(jié)果。

表3 供試品中鈉含量測定結(jié)果

圖3 供試品典型離子色譜圖。其中:1為Na+、2為K+、3為NH4+

圖4 溶劑空白圖。其中:1為Na+、2為K+、3為NH4+

3 討論與結(jié)論

3.1 方法可靠性 為了考察方法的專屬性,防止其他陽離子干擾鈉離子的測定,采用陽離子混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,用去離子水稀釋制成約含Na+10 μg/mL的系統(tǒng)適用性溶液。結(jié)果表明,在建立的色譜條件下,鈉離子峰與相鄰離子峰間的分離度大于2.0,理論塔板數(shù)大于5000,能夠有效避免其他陽離子對測定鈉離子含量的干擾。同時,為了考察本方法的耐用性,使用陽離子混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,將建立的方法在改變淋洗液濃度(±10%)、柱溫(±5 ℃)和流速(±10%)后進(jìn)行試驗。結(jié)果表明,鈉離子峰與相鄰離子峰間的分離度均大于2.0,均能夠?qū)崿F(xiàn)基線分離,理論塔板數(shù)均大于5000 plate/m,證明方法具有較高的可靠性和良好的耐用性。

3.2 供試品制備方法的選擇 通過將安乃近、青霉素、磺胺氯達(dá)嗪鈉和磺胺氯吡嗪鈉的測定值和理論值進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn),本方法對上述水溶性較好的原料及對照品能夠?qū)崿F(xiàn)良好的測定,對于一些水溶性較差的對照品(如鹽霉素鈉、莫能菌素鈉等),需在供試品配制的過程中加入適量有機(jī)溶劑(如乙醇、甲醇等)助溶,使得鈉離子能夠更好的溶解于供試品溶液中,并增加溶劑空白試驗,扣去溶劑中的鈉含量,從而實現(xiàn)準(zhǔn)確測定。

以水溶性較差的莫能菌素對照品為例,取莫能菌素對照品適量,加水溶解并稀釋制成約10 μg/mL的溶液,使用1.2項色譜條件進(jìn)行測定,結(jié)果鈉含量為2.01%,遠(yuǎn)低于理論數(shù)值。改變供試品溶液配制過程為:取莫能菌素對照品適量,置100 mL量瓶中,加入10 mL甲醇使溶解,用水稀釋制成約10 μg/mL的溶液,使用1.2項色譜條件進(jìn)行測定,并配制相同溶劑空白,扣除溶劑中的鈉含量,結(jié)果表明該批莫能菌素對照品中鈉含量為3.21%,與理論數(shù)值一致。

3.3 方法的拓展應(yīng)用 本方法建立了獸藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中鈉含量的測定方法。通過專屬性試驗結(jié)果可知,在本方法條件下,鋰、鈉、鉀、銨根、鎂、鈣之間均能實現(xiàn)基線分離(Rs>2.0)。因此,對于獸藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中常見的其他陽離子,本方法能夠應(yīng)用于獸藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中其他常見陽離子的測定。在測定時需根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的溶解性對供試品的配制方法進(jìn)行優(yōu)化,并進(jìn)行必要的方法學(xué)考察驗證。

3.4 方法的選擇與比較 將本方法與已發(fā)表的其他鈉含量測定方法進(jìn)行比較,結(jié)果見表4。結(jié)果表明,本方法在較寬的線性范圍內(nèi),重復(fù)性良好,并擁有良好的回收率,檢測限較低。

表4 與其他鈉含量測定方法進(jìn)行比較

建立了一種測定獸用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中鈉離子含量的離子色譜法。本方法在較寬的線性范圍內(nèi)擁有良好的精密度和重現(xiàn)性,通過對獸用原料和對照品的加標(biāo)回收試驗,證明了本方法的準(zhǔn)確度。本方法簡單、高效、準(zhǔn)確,可以作為通用方法測定獸用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中的鈉離子,并可以拓展應(yīng)用于其他常見陽離子的測定中。