崔學進, 馬世綿, 沈 盼, 時洪偉, 傅仕敏, 賀 俊,鄒修平, 周常勇, 王雪峰

(國家柑桔工程技術研究中心，西南大學柑桔研究所，重慶 400712)

柑橘在中國有4 000余年的悠久栽培史,2021年我國柑橘栽培面積289萬hm2、產(chǎn)量5 569萬t,產(chǎn)量和面積均居世界首位,是我國南方鄉(xiāng)村振興的重要抓手產(chǎn)業(yè)。柑橘黃龍病(citrus Huanglongbing, HLB)是由韌皮部桿菌屬CandidatusLiberibacter細菌引起的全球性柑橘重大病害,在田間主要由柑橘木虱Diaphorinacitri傳播。目前該病在我國部分優(yōu)勢柑橘產(chǎn)區(qū)流行風險加劇,非疫區(qū)亦面臨威脅,使我國由柑橘生產(chǎn)大國向強國轉(zhuǎn)型面臨嚴峻挑戰(zhàn)[1]。由于目前尚無有效方法根治黃龍病,生產(chǎn)上采取“三項基本措施”,即使用無病苗木、及時挖除病樹和大面積聯(lián)防聯(lián)控柑橘木虱防控黃龍病,總體上仍呈“可防可控不可治”的態(tài)勢。

當前對黃龍病菌致病機制的研究已主要形成以下結(jié)論:1)病菌與韌皮部細胞膜互作,在韌皮部細胞間運輸聚集,引起胼胝體沉積和篩孔堵塞;此外病菌代謝產(chǎn)物通過改變滲透壓來破壞韌皮部功能[2-3]。2)在寄主細胞表面定位的模式識別受體識別黃龍病菌的鞭毛蛋白、脂多糖等病原相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMPs),引起耐、感病寄主中胼胝體聚集、活性氧(reactive oxygen species,ROS)產(chǎn)生等防御響應[4-5]。3)黃龍病是一種病原觸發(fā)的免疫病害,侵染后導致活性氧在韌皮部組織積累,可通過抗氧化劑或赤霉素減輕黃龍病危害[6]。4)病菌通過分泌系統(tǒng)分泌效應蛋白或其他毒力因子影響寄主靶標的功能,誘導寄主產(chǎn)生病癥[7]。本文重點就柑橘黃龍病菌分泌系統(tǒng)特征、效應蛋白與寄主互作機制及抗病種質(zhì)創(chuàng)制等方面進行綜述。

1 韌皮部桿菌屬細菌及其分泌系統(tǒng)特征

韌皮部桿菌屬的確立與柑橘黃龍病的病原命名相關。韌皮部桿菌屬的大部分成員未實現(xiàn)離體培養(yǎng),但通過田間癥狀觀察、嫁接診斷、病原電子顯微鏡觀察、分子生物學等方法,證明了韌皮部桿菌是柑橘黃龍病、馬鈴薯斑馬病及其他一些作物病害的病原。根據(jù)16S rRNA序列差異和病原所分布的地區(qū),黃龍病菌可分為3個亞種:亞洲種“CandidatusLiberibacter asiaticus”(CLas)、非洲種“Ca.Liberibacter africanus”(CLaf)及美洲種 “Ca.Liberibacter americanus”(CLam)[8]。其中亞洲種分布最廣,危害最嚴重,是我國發(fā)生的黃龍病病原。韌皮部桿菌屬細菌基因組高度簡化,缺少核心代謝途徑,需依賴寄主植物提供營養(yǎng),這可能是體外純培養(yǎng)至今未能取得突破的主要原因[9]。韌皮部是許多胞內(nèi)寄生菌的天然庇護所,寄生菌寄居于此能夠躲避天敵、環(huán)境脅迫和農(nóng)藥等的侵襲,同時又能從中吸取糖類、微量元素等營養(yǎng)物質(zhì)。由于韌皮部的天然屏障和韌皮部寄生菌的獨特習性,多數(shù)韌皮部寄生菌需靠昆蟲介體傳播。細菌可依賴韌皮部進行長距離擴散[10]。研究表明,黃龍病菌可借助汁液流動或通過菌毛滑行,在韌皮部中以約3 cm/d的速度遷移,僅為韌皮部營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運速率的0.25%,并能向上和向下運輸?shù)匠墒烊~片和根中[3,11]。柑橘黃龍病菌至今無法離體培養(yǎng),難以進行傳統(tǒng)的分子和遺傳操作,極大制約了對黃龍病菌毒力機制的認知。

細菌能利用分泌系統(tǒng)將胞內(nèi)合成的毒蛋白轉(zhuǎn)運、分泌至胞外,從而調(diào)控寄主靶標,抑制寄主免疫反應,完成入侵增殖。目前細菌中發(fā)現(xiàn)至少9種分泌系統(tǒng)(T1SS～T9SS),按作用機制的不同,又分為一步法分泌系統(tǒng)(T1SS、T3SS、T4SS、T6SS和T7SS)和兩步法分泌系統(tǒng)(T2SS、T5SS、T8SS和T9SS)[12-14]。一步法分泌系統(tǒng)能直接將底物轉(zhuǎn)運到胞外,兩步法分泌系統(tǒng)則先依賴內(nèi)膜跨越轉(zhuǎn)運體,通過一般分泌途徑(general secretion pathway, Sec)或雙精氨酸轉(zhuǎn)運途徑(twin-arginine translocation pathway,Tat)將底物轉(zhuǎn)運至細胞周質(zhì),再通過相應分泌系統(tǒng)運送到胞外環(huán)境[15-16]。Sec途徑通常轉(zhuǎn)運未折疊形式的蛋白,而Tat途徑轉(zhuǎn)運折疊形式的蛋白,T2SS、T5SS、T8SS是Sec依賴的分泌路徑[16]。

效應蛋白又稱效應子、分泌蛋白等,是一類在病原細胞內(nèi)合成,分泌到胞外,繼而進入寄主體內(nèi)發(fā)生效應的蛋白,是病原發(fā)揮毒力的重要因子。黃龍病菌為柑橘韌皮部胞內(nèi)寄生菌,可能也具有將效應蛋白分泌到寄主細胞內(nèi)干擾寄主防御的功能。Duan等[17]從單頭帶病柑橘木虱中,利用宏基因組測序首次獲得了高度精簡、大小為1.23 Mb的黃龍病菌完整基因組序列,全基因組分析發(fā)現(xiàn),黃龍病菌中雖沒有革蘭氏陰性細菌常見的T3SS和T4SS,但有T1SS和Sec分泌途徑。

T1SS分泌系統(tǒng)分泌過程中不需要信號肽的剪切,分泌的蛋白又稱為非經(jīng)典分泌蛋白。有關黃龍病菌非經(jīng)典分泌蛋白的報道較少,Cong等[18]發(fā)現(xiàn)在T1SS基因簇旁邊存在一個金屬蛋白酶(Serralysin蛋白)基因,該蛋白廣泛存在于細菌中且往往由T1SS分泌系統(tǒng)分泌,可以通過降解寄主免疫相關蛋白抑制寄主免疫,因此,推測該蛋白可能是黃龍病菌的毒力因子。

Sec分泌途徑可以轉(zhuǎn)運毒力因子、侵襲素和蛋白酶等。典型的Sec識別信號序列是長約18～30個氨基酸的信號肽[17]。韌皮部寄生的植原體主要通過Sec途徑完成SAP54、SAP11和Tengu等重要毒力因子的分泌[19-21]。運用生物信息學軟件,如SignalP、Phobius等可對Sec分泌蛋白進行預測,為進一步篩選鑒定黃龍病菌效應蛋白奠定基礎。Prasad等[22]對柑橘黃龍病菌基因組進行生物信息學分析,預測到166個蛋白具有信號肽序列,進一步通過堿性磷酸酶(PhoA)試驗確認了其中的86個蛋白具有胞外分泌能力,推測這些分泌蛋白可能在黃龍病菌和寄主互作過程中發(fā)揮作用。

2 柑橘黃龍病菌效應蛋白與寄主互作機制

2.1 黃龍病菌效應蛋白對寄主細胞壞死的影響

對黃龍病菌效應蛋白誘導/抑制細胞壞死功能分析表明,多數(shù)效應蛋白具有抑制壞死功能,只有少數(shù)幾個效應蛋白能觸發(fā)細胞壞死。Pitino等[23]發(fā)現(xiàn)效應蛋白SDE1(CLIBASIA_05315)能誘導本氏煙Nicotianabenthamiana細胞壞死和胼胝質(zhì)沉積。Liu等[24]報道了一個溫度依賴型效應蛋白m460(CLIBASIA_00460),常溫(25℃)時,m460定位于細胞核和細胞質(zhì),瞬時表達m460只引起本氏煙葉片出現(xiàn)微小壞死斑,高溫(32℃)減少m460在細胞核中的積累,而在m460的N端加入SV40核定位序列后可促進m460入核并引起本氏煙葉片嚴重褪綠和壞死;Oh等[25]發(fā)現(xiàn)m460還會抑制丁香假單胞菌Pseudomonassyringaepv.tomato(Pst)免疫激發(fā)子PrfD1416V觸發(fā)的過敏性壞死反應(hypersensitive response, HR)。Li等[26]證實本氏煙中瞬時過表達m03915(CLIBASIA_03915)和m04250(CLIBASIA_04250)可引起衰老葉片韌皮部壞死。Du等[27]發(fā)現(xiàn)黃龍病菌原噬菌體區(qū)域一個可引起本氏煙過敏性壞死作用的效應子AGH17470,其通過上調(diào)病程相關基因(pathogenesis-related genes,PR)和水楊酸(salicylic acid,SA)信號通路基因的表達來激活植物免疫,在柑橘上瞬時過表達AGH17470提高了其對柑橘潰瘍病菌Xanthomonascitrisubsp.citri(Xcc)的抗性。

Zhang等[28-29]于2019和2020年先后發(fā)現(xiàn)m3875(CLIBASIA_03875)和m4405(CLIBASIA_04405)能抑制小鼠凋亡蛋白(pro-apoptotic mouse protein)Bax和馬鈴薯晚疫病菌激發(fā)素INF1(PhytophthorainfestansINF1)引起的本氏煙過敏性細胞壞死。Pang等[30]發(fā)現(xiàn)效應蛋白SDE15(CLIBASIA_04025)能同時抑制柑橘潰瘍病菌Xanthomonascitrissp.citri(Xcc)和辣椒瘡痂病菌X.vesicatoria效應蛋白AvrBsT誘導的HR反應,表明其是一個廣譜免疫抑制子。Du等[31]通過非經(jīng)典分泌蛋白預測軟件SecretomeP鑒定到27個非經(jīng)典分泌蛋白,其中10個可抑制Bax和INF1引起的細胞壞死和H2O2積累,它們可以通過協(xié)同誘導PR基因的表達,抑制寄主早期免疫反應并促進病原菌定殖。Shen等[32]從黃龍病菌中鑒定到一個能抑制免疫激發(fā)子Bax和INF1誘導的過敏性壞死、活性氧暴發(fā)和胼胝質(zhì)沉積的效應蛋白SECP8(CLIBASIA_05330),轉(zhuǎn)mSECP8基因能促進黃龍病菌在柑橘中的早期定殖、葉片斑駁黃化和植株矮化。

2.2 黃龍病菌效應蛋白與寄主因子互作抑制免疫反應

Clark等[33]發(fā)現(xiàn)SDE1(CLIBASIA_05315)與柑橘木瓜蛋白酶樣半胱氨酸蛋白酶(citrus papain-like cysteine proteases, PLCPs)互作,且SDE1通過干擾PLCPs活性抑制寄主免疫。進一步發(fā)現(xiàn),將SDE1在擬南芥中超量表達后,葉片出現(xiàn)類似柑橘感染黃龍病的嚴重黃化癥狀;與野生型柑橘相比,轉(zhuǎn)SDE1基因柑橘更易感黃龍病菌,衰老相關基因SAGs(senescence-associated genes)在轉(zhuǎn)基因株系中上調(diào)表達,推測SDE1可能與促早熟和衰老相關[34]。Zhou等[35]驗證到SDE1與本氏煙DDX3(DEAD-box ATP-dependent RNA helicase 3)蛋白互作,瞬時過表達SDE1和瞬時沉默NbDDX3均能引起本氏煙葉片褪綠,且SDE1能降低NbDDX3轉(zhuǎn)錄水平,表明SDE1引起的褪綠癥狀與NbDDX3下調(diào)表達有關。

轉(zhuǎn)SDE15基因葡萄柚Citrusparadisi在接種Xcc Aw菌株后PTI (pattern-triggered immunity)標記基因和PR基因下調(diào)表達,且SDE15通過與柑橘感病因子CsACD2(accelerated cell death 2)互作發(fā)揮免疫抑制子功能[30]。Li等[36]發(fā)現(xiàn)效應因子CLIBASIA_00255編碼水楊酸羥化酶(SahA),能夠通過降解水楊酸抑制植物防御,純化的SahA蛋白可降解SA及其衍生物,在轉(zhuǎn)基因煙草中過表達SahA可以消除SA積累和寄主的過敏性壞死反應。

當植物遭遇生物和非生物(干旱、鹽堿、澇害、冷害等)脅迫時,細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生和清除機制無法平衡,導致活性氧的過度積累,進一步造成脂質(zhì)過氧化、蛋白質(zhì)變性、堿基突變和DNA鏈斷裂等氧化損傷,甚至造成植株的死亡[37]。因此,及時清除過多的活性氧以維持活性氧穩(wěn)態(tài),對于植物生理功能的正常運行至關重要。感染黃龍病菌的柑橘葉片ROS水平提高,使用抗氧化劑抑制ROS水平可減輕黃龍病癥狀[6]。Jain等[38]報道了黃龍病菌UF506株系的SC2原噬菌體上一個非經(jīng)典分泌蛋白SC2_gp095,該蛋白是一個過氧化物酶,通過下調(diào)RbohB的轉(zhuǎn)錄來抵御H2O2積累,從而抑制寄主免疫。此外,UF506染色體區(qū)域的兩個分泌蛋白Lasprx5(CLIBASIA_RS00940)和Lasbcp(CLIBASIA_RS00445)也發(fā)揮著過氧化物酶的功能,參與抗活性氧脅迫[39]。Du等[40]發(fā)現(xiàn)黃龍病菌原噬菌體區(qū)域效應蛋白AGH17488靶向寄主抗壞血酸過氧化物酶6(APX6),促進APX6活性從而抑制ROS積累來提高寄主的感病性。

2.3 黃龍病菌效應蛋白調(diào)控寄主細胞自噬

細胞自噬是真核生物內(nèi)普遍存在的保守的物質(zhì)降解過程,在植物生長發(fā)育、衰老、細胞穩(wěn)態(tài)以及響應生物和非生物脅迫等過程中發(fā)揮重要作用[41]。植物細胞自噬的發(fā)生過程主要包括:自噬的誘導、自噬體的形成、與液泡的融合。目前已有超過40個自噬相關基因(AuTophaGy-related genes, ATGs)被鑒定,這些基因編碼的蛋白在細胞自噬的各個階段發(fā)揮不同作用[42]。在植物與病原互作過程中,植物通過自噬降解限制病原侵染是其重要的防御手段,但病原物也進化出逃逸自噬的機制,調(diào)控自噬促進其在寄主內(nèi)的定殖與增殖[43]。

近年來,植物病原物調(diào)控寄主自噬的相關研究取得系列重要進展,但韌皮部寄生菌如何操控寄主細胞自噬的研究甚少。Shi等[44]發(fā)現(xiàn)黃龍病菌效應蛋白SDE4405 與柑橘ATG8家族蛋白相互作用,激活本氏煙細胞自噬;通過電鏡觀察發(fā)現(xiàn),在SDE4405轉(zhuǎn)基因柑橘中,細胞自噬也顯著增強;ATG8s響應SDE4405介導的植物免疫抑制,瞬時過表達CsATG8c和SDE4405促進了柑橘潰瘍病菌在柑橘葉片的增殖,表明SDE4405誘導的細胞自噬具有促進細菌侵染的功能。Shi等[45]發(fā)現(xiàn)黃龍病菌效應蛋白SDE3(CLIBASIA_00420)的表達不僅增強病毒和疫霉侵染煙草和擬南芥的能力,而且顯著地增強了柑橘對潰瘍病和黃龍病的易感性。進一步研究表明SDE3與柑橘胞質(zhì)中3-磷酸甘油醛脫氫酶(CsGAPC1/2)互作,CsGAPC1/2可以與柑橘自噬相關蛋白家族CsATG8s (CsATG8A/C/D/F/G/I)直接互作,并特異性地降解CsATG8s;SDE3與CsGAPC1/2的互作進一步增強了CsGAPC1/2對CsATG8s的降解,從而抑制植物的細胞自噬。對該領域的深入研究將進一步闡明黃龍病菌調(diào)控自噬的機制并為建立柑橘黃龍病新型防控策略提供理論依據(jù)。

3 抗耐病黃龍病種質(zhì)創(chuàng)制

由于缺乏抗黃龍病的天然柑橘種質(zhì)資源,利用轉(zhuǎn)基因或基因編輯技術創(chuàng)制抗(耐)黃龍病柑橘種質(zhì)具有重要的應用前景。將擬南芥抗病基因NPR1(non-expressor of pathogenesis related genes 1)在甜橙Citrussinensis‘Hamlin’和‘Valencia’中分別進行系統(tǒng)超量和韌皮部特異表達,AtNPR1轉(zhuǎn)基因甜橙對黃龍病抗性大幅提高,且病原相關分子模式(PAMPs)、富含亮氨酸受體激酶(leucine-rich receptor kinase,LRR-RKs)等防御相關基因在轉(zhuǎn)基因植物中顯著上調(diào)表達,此外采用非轉(zhuǎn)基因接穗和轉(zhuǎn)AtNPR1基因砧木組合,可提高植株抗(耐)病性[46-47]。在墨西哥來檬Citrus×aurantifolia中單獨或同時表達lysozyme和β-defensin可以顯著降低植株中的黃龍病菌的滴度,緩解黃龍病癥狀[48]。Hao等[49]將柑橘內(nèi)源Thionins基因在卡里佐枳橙Citrussinensis×P.trifoliata中超量表達,嫁接傳菌 1年后,與對照植株相比,轉(zhuǎn)基因植株根和接穗中的病菌濃度顯著降低,提高了卡里佐枳橙對黃龍病的抗性。

自2013年CRISPR/Cas9基因編輯技術在植物中成功應用以來,基因編輯技術在柑橘中的研究就受到了廣泛的關注。西南大學柑桔研究所團隊成功構建了CRISPR/Cas9介導的柑橘基因組編輯技術,并首次成功獲得了抗?jié)儾〉腃sLOB1突變體[50]。利用構建的柑橘基因組編輯等技術,團隊開展了柑橘黃龍病抗性編輯等分子育種研究,創(chuàng)制了CsPP2B15、CsWRKY22等一批抗病相關突變體和轉(zhuǎn)基因材料[50-53],其中,抗菌肽轉(zhuǎn)基因和CsLOB1突變體抗病材料已獲得農(nóng)業(yè)農(nóng)村部轉(zhuǎn)基因中間試驗許可,目前正在開展田間抗性評價。利用轉(zhuǎn)基因技術創(chuàng)制非轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品一直是人們關注的焦點問題。CRISPR/Cas9技術誕生后,攻克該技術瓶頸已成為基因組編輯領域和分子育種的熱點,并在不同的物種中被成功解決。由于柑橘基因組高度雜合、珠心胚起源、生長周期長、遺傳轉(zhuǎn)化效率低,嚴重阻礙了CRISPR/Cas9技術在創(chuàng)制不含轉(zhuǎn)基因成分的優(yōu)良突變體中的有效利用[54],已成為柑橘分子育種從研究走向應用的技術瓶頸。最近,美國佛羅里達大學團隊利用Cas12a/crRNA編輯系統(tǒng)成功構建了柑橘非轉(zhuǎn)基因基因組編輯技術,獲得了抗?jié)儾〉姆寝D(zhuǎn)基因突變體[55]。該突變體已獲得了美國農(nóng)業(yè)部動植物衛(wèi)生檢疫局(USDA-APHIS)的監(jiān)管批準和環(huán)境保護署(EPA)的豁免監(jiān)管,大力推動了柑橘基因組編輯育種的商業(yè)化進程。

4 展望

近年來在黃龍病菌重要基因功能,特別是效應蛋白的寄主互作因子鑒定與功能研究方面取得了顯著進展,為柑橘抗黃龍病定向遺傳改良提供了重要靶標。黃龍病菌主要是通過柑橘木虱取食傳播到柑橘韌皮部組織,但當前在黃龍病菌-木虱-柑橘三者間互作的研究還有待深入,特別是在韌皮部場景中的相互博弈尚不清晰,如木虱和病菌的效應蛋白如何與柑橘韌皮部組織蛋白相互作用,二者的效應蛋白是否存在協(xié)同作用機制?因此深入解析黃龍病菌-木虱-柑橘互作機制,挖掘寄主響應木虱和病菌的關鍵基因,有望創(chuàng)制抗病種質(zhì)材料,從根本上解決黃龍病防控難題,保障柑橘產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。