摘要：赤霉素受體（Gibberellin insensitive dwarf1）可感知赤霉素信號，參與調(diào)控植物的生長發(fā)育及逆境脅迫。高羊茅（Festuca arundinacea）是低養(yǎng)護(hù)成本的冷季型草坪草，面臨多種逆境脅迫，但其赤霉素受體在逆境和發(fā)育中的作用尚未明確。本研究從高羊茅的轉(zhuǎn)錄組中鑒定到12個(gè)赤霉素受體基因序列，它們含有高度保守的結(jié)構(gòu)域，可劃分為兩個(gè)進(jìn)化枝，Ⅰ類為GID1L2，Ⅱ類為GID1。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析短期低溫脅迫（0℃）、高溫脅迫（38℃）、鹽脅迫（120 mmol·L-1 NaCl）及干旱（15%聚乙二醇6000）逆境下高羊茅分蘗節(jié)和葉片中赤霉素受體基因的表達(dá)模式。結(jié)果表明，高羊茅赤霉素受體基因?qū)Ω黝惸婢趁{迫均有響應(yīng)，GID1L2s在分蘗節(jié)和葉片中表達(dá)模式不同，GID1s則相似。除冷脅迫下葉片中FaGID1d表達(dá)模式獨(dú)特，其余GID1s在不同逆境脅迫下表達(dá)模式一致。研究結(jié)果為進(jìn)一步開展赤霉素受體基因參與逆境脅迫的功能解析提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：赤霉素受體；生物信息學(xué)；逆境脅迫；表達(dá)模式

中圖分類號：S602.4""" 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A"""" 文章編號：1007-0435（2024）06-1719-10

Characterization and Analysis of Gibberellin Insensitive Dwarf1 Gene

Family and Response to Abiotic Stresses in Tall Fescue

QIAN Wan-qing， AN Cong， ZHUANG Li-li*

（1. College of agro-grassland and science， Nanjing Agricultural University， Nanjing， Jiangsu province 210095， China）

Abstract：Gibberellin receptor （Gibberellin insensitive dwarf1） can sense the signal of gibberellin and participate in the regulation of plant growth and development，as well as in plant abiotic stress resistance. Tall fescue （Festuca arundinacea） is a low-maintenance cool-season turfgrass and is exposed to various stresses，but the role of its gibberellin receptor family in stress and development has not been reported yet. In this study，12 gibberellin receptor gene sequences were identified in the transcriptome of tall fescue，which contained highly conserved domains and could be divided into two clades，GID1L2 （gibberellin receptor 1 like 2） for class Ⅰ and GID1 for class Ⅱ. The expression patterns of these genes in crown and leaf of tall fescue under low temperature stress （0℃），high temperature stress （38℃），salt stress （120 mmol·L-1 NaCl） and short-term drought （15% PEG 6000） were determined by quantitative real-time polymerase chain reaction. The results showed that these genes were responsive to various abiotic stresses. The expression patterns of FaGID1L2 genes were different in crown and leaf，but FaGID1s’ were similar. Except the expression pattern of FaGID1d in leaf under cold stress was unique，the expression pattern of the rest FaGID1s under cold stresses was consistent. These results provided a theoretical basis for further functional analysis of gibberellin receptor genes involved in stresses.

Key words：GID1；Bioinformatic analysis；Abiotic stress；Expression pattern

植物具有固著生長的特性，在整個(gè)生長過程中無法避免遭受干旱、高溫、冷害等非生物脅迫，這些脅迫直接或間接影響了植物的生產(chǎn)潛力及營養(yǎng)品質(zhì)［1-2］。隨著高溫干旱等極端天氣在全球范圍內(nèi)出現(xiàn)的頻率增高，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)力將會受到更為深遠(yuǎn)的負(fù)面影響［3-4］。因此，了解植物如何適應(yīng)并且抵抗逆境的機(jī)制至關(guān)重要。

赤霉素（Gibberellins，GAs）是一類普遍存在于植物體內(nèi)的重要激素，在促進(jìn)種子萌發(fā)、下胚軸的伸長、根的形態(tài)建成、花和果實(shí)的發(fā)育等方面都發(fā)揮不可或缺的作用［5-8］。近年來，隨著基因組、蛋白組學(xué)等實(shí)驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展，人們已經(jīng)鑒定了多個(gè)參與GA信號的調(diào)控因子，如GA受體GID1蛋白、DELLA蛋白、F-box蛋白［9-11］。其中，GID1蛋白的發(fā)現(xiàn)是GA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑領(lǐng)域取得的突破性進(jìn)展。在該轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，GID1作為受體與活性赤霉素結(jié)合，與DELLA蛋白形成GA-GID1-DELLA蛋白復(fù)合體后被SCFSLY1泛素連接酶識別并泛素化，隨后被26S蛋白酶降解，從而產(chǎn)生GA效應(yīng)［12-15］。

GID1最早在水稻（Oryza sativa）GA信號傳導(dǎo)中被鑒定出來，且在水稻中過表達(dá)OsGID1出現(xiàn)植株變高，分蘗減少的表型［10］，隨后擬南芥中（Arabidopsis thaliana）也找到了三個(gè)GID1：AtGID1a，AtGID1b，AtGID1c，其單突變體生長發(fā)育正常，但三突變體植株極度矮化，開花延遲，且花器官發(fā)育嚴(yán)重缺陷［16-17］。這些轉(zhuǎn)基因植株的表型都表明了GID1家族對于植物生長發(fā)育的重要性。此外，GID1家族也參與了植物對于逆境的響應(yīng)。例如低溫處理擬南芥的gid1突變體，處理后gid1b突變體的根長遠(yuǎn)低于野生型［18］；此外，對大白菜（Brassica rapa L）、茶樹（Camellia sinensis）中的GID1s啟動子片段進(jìn)行順式作用元件分析，發(fā)現(xiàn)含有響應(yīng)干旱、冷和厭氧脅迫的相關(guān)元件［19-20］。相對于GID1，關(guān)于GID1L2的研究則較少，有研究報(bào)道GID1與GID1L2均從激素敏感脂肪酶（Hormone Sensitive Lipase，HSL）進(jìn)化而來［21］。在水稻的sped1-D突變體中過表達(dá)GID1L2家族基因LOC_Os06g11130，能夠不同程度地恢復(fù)水稻的正常穗型，證明了該家族成員參與了水稻的次生分枝的伸長［22］；但關(guān)于GID1L2家族在逆境響應(yīng)方面的研究，目前仍然研究較少。

高羊茅（Festuca arundinacea）是應(yīng)用廣泛的冷季型禾本科草，因其綠期長、根系發(fā)達(dá)、抗逆性強(qiáng)和耐粗放管理的特點(diǎn)［23］，可作為優(yōu)良的草坪草和生態(tài)修復(fù)用草，相較于其他冷季型草坪草而言，高羊茅更耐高溫及干旱［24-25］。目前，高羊茅中赤霉素受體家族成員的研究尚未見報(bào)道。本研究基于高羊茅轉(zhuǎn)錄組序列，通過生物信息學(xué)方法對高羊茅中赤霉素受體家族成員的基因序列進(jìn)行鑒定，并在基因序列、蛋白結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)進(jìn)化等方面對其進(jìn)行分析。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測其在冷害、高溫、鹽害及干旱四種不同逆境條件下的表達(dá)模式，為深入研究高羊茅赤霉素受體家族成員的生物學(xué)功能提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料與生長條件

本研究采用高羊茅品種‘凌志’為試驗(yàn)材料。將‘凌志’種子放置在鋪有三層潤濕濾紙的培養(yǎng)皿中，加入適量水，置于4℃冰箱中春化3 d，隨后將其置于光照培養(yǎng)箱中萌發(fā)培養(yǎng)。將萌發(fā)16 d的小苗轉(zhuǎn)移到人工氣候室進(jìn)行水培培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為白天、夜晚各12 h，白天溫度25℃，夜晚溫度20℃，空氣濕度70%，光照強(qiáng)度為500 μmol·m-2·s-1。用剪好的海綿包裹小苗的分蘗節(jié)部位，置于水培板的小孔上，每板6孔，共18板。根系浸入霍格蘭營養(yǎng)液，每周更換一次營養(yǎng)液。

1.2 植物處理

對霍格蘭營養(yǎng)液中水培培養(yǎng)43 d的‘凌志’植株進(jìn)行短期低溫處理（0℃），高溫處理（38℃），鹽處理（120 mmol·L-1 NaCl）和干旱處理（15%聚乙二醇6000）。處理持續(xù)24 h，在0，6，12和24 h時(shí)進(jìn)行取樣，將分蘗節(jié)和葉片在液氮中速凍，隨后保存在-80℃冰箱中。每種處理分別處理3個(gè)水培板，取樣時(shí)均有三個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.3 高羊茅赤霉素受體家族成員鑒定

利用課題組前期篩選到的FaGID1L2a蛋白［26］，通過在線網(wǎng)站Phyzotome13（https：//phytozome-next.jgi.doe.gov/blast-search）的‘blast’程序，以水稻作為搜索物種，E-90為期望值，得到相應(yīng)的水稻序列；再以這些水稻序列作為請求序列，在配置好的高羊茅轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫的BioEdit軟件中采用‘tblastn’，以E-90為期望值，進(jìn)行搜索，得到相應(yīng)的12個(gè)高羊茅序列（相關(guān)信息已整理至表2）。AtGID1蛋白序列從TAIR網(wǎng)站（www.arabidopsis.org）獲得。

1.4 系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建及序列分析

采用MEGA 7.0軟件，用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。采用Compute pI / Mw在線工具預(yù)測12個(gè)高羊茅蛋白的等電點(diǎn)和分子量，采用Plant-mPLoc在線工具預(yù)測亞細(xì)胞定位，采用MEME Suite 5.4.1預(yù)測保守結(jié)構(gòu)域。

1.5 熒光定量PCR

采用植物RNA提取試劑盒提取樣品總RNA。取1 μg RNA進(jìn)行第一鏈cDNA的合成，所用試劑盒是MonScriptTM RTⅢ Super Mix with dsDNase（Two-step），反轉(zhuǎn)錄之前去除基因組DNA。所用定量PCR試劑為MonAmpTM ChemoHS qPCR Mix。定量PCR的條件設(shè)置為95℃預(yù)變性10 min，隨后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的PCR擴(kuò)增（95℃變性15 s，60℃退火15 s，72℃延伸20 s）。每個(gè)循環(huán)都設(shè)定在65℃采集數(shù)據(jù)。內(nèi)參基因?yàn)镕aTubblin ［27］，每個(gè)生物學(xué)樣品都進(jìn)行兩次技術(shù)重復(fù)，采用2－ΔΔCT法計(jì)算基因的相對表達(dá)水平。使用primer premier 5軟件對12個(gè)高羊茅序列設(shè)計(jì)定量引物。定量引物見表1。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS19.0軟件進(jìn)行方差分析并用TBtools繪圖，平均值采用最小顯著差異法（LSD）進(jìn)行多重比較，顯著水平為Pgt;0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 高羊茅赤霉素受體家族成員基因序列的獲得

由分析結(jié)果可知，12個(gè)高羊茅赤霉素受體蛋白序列長度在317（FaGID1L2h）～397（FaGID1L2a）個(gè)氨基酸之間，等電點(diǎn)最小為4.92（FaGID1L2h），最大為9.84（FaGID1L2b），分子質(zhì)量從34 264.82 Da（FaGID1L2f）到42 632.46 Da（FaGID1L2a）（表2）。亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果表明，這12個(gè)赤霉素受體家族成員大部分只定位在細(xì)胞核中，部分蛋白定位在細(xì)胞核與葉綠體（FaGID1L2a，F(xiàn)aGID1L2b，F(xiàn)aGID1L2g，F(xiàn)aGID1L2c）。

為分析高羊茅、水稻及擬南芥中赤霉素受體家族成員蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，對所得高羊茅的赤霉素受體家族蛋白序列與水稻及擬南芥中的同源蛋白共同構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，具體序列可根據(jù)登錄號在NCBI上查看。采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖1），植物赤霉素受體家族蛋白可以分為兩個(gè)亞家族，Ⅰ類亞家族包括8個(gè)FaGID1L2蛋白（FaGID1L2a，F(xiàn)aGID1L2b，F(xiàn)aGID1L2c，F(xiàn)aGID1 L2d，F(xiàn)aGID1L2e，F(xiàn)aGID1L2f，F(xiàn)aGID1L2g，F(xiàn)aGID1L2h）和8個(gè)OsGID1L2蛋白（Os09g28 690，Os08g37040，Os09g28740，Os08g37010，Os08 g37030，Os06g11130，Os09g28750，Os09g28720）；Ⅱ類亞家族包括4個(gè)FaGID1蛋白（FaGID1a，F(xiàn)aGID1b，F(xiàn)aGID1c，F(xiàn)aGID1d）、1個(gè)OsGID1蛋白（OsGID1）和3個(gè)AtGID1蛋白（AtGID1a，AtGID1b，AtGID1c）。

2.2 保守結(jié)構(gòu)域分析及氨基酸比對

采用MEME軟件預(yù)測高羊茅、水稻和擬南芥24個(gè)赤霉素受體蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，一共鑒定到6個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域（結(jié)構(gòu)域?qū)挾仍O(shè)置為6～100個(gè)氨基酸殘基，E值小于1.8×10-45），詳細(xì)信息見圖2。結(jié)果表明，結(jié)構(gòu)域1，2，3，6為高羊茅赤霉素受體蛋白家族12個(gè)成員所共有的保守結(jié)構(gòu)域，且1，2，3排布順序一致；結(jié)構(gòu)域6分布在Ⅰ類成員的N端，而在II類成員的C端。結(jié)構(gòu)域4和5在第Ⅱ亞類的4個(gè)成員（FaGID1a，F(xiàn)aGID1b，F(xiàn)aGID1c，F(xiàn)aGID1d）及OsGID1和AtGID1s中出現(xiàn)，為第Ⅱ亞類成員區(qū)別于第Ⅰ亞類成員的結(jié)構(gòu)域。

已有研究表明GID1與GID1L2都由HSL進(jìn)化而來，在一級結(jié)構(gòu)上相似，HSL家族含有HGGG和GXSXG保守基序［28］，氨基酸比對結(jié)果表明（圖3），Ⅰ類和Ⅱ類的成員均含有GXSXG保守序列，但僅有部分蛋白如FaGID1L2d，F(xiàn)aGID1L2e，F(xiàn)aGID1L2g，F(xiàn)aGID1L2h及四個(gè)水稻蛋白（Os08g37010，Os08g37030，Os09g28750，Os09 g28720）保留了HGGG基序，剩余的Ⅰ類蛋白中則是HGGA，Ⅱ類蛋白中則變?yōu)镠GGS。Ⅰ類蛋白保留了HSL家族的S-D-H催化三聯(lián)體結(jié)構(gòu)，在Ⅱ類蛋白中，結(jié)構(gòu)中的最后一個(gè)H被V或者I取代。

2.4 不同脅迫下高羊茅赤霉素受體基因的表達(dá)

2.4.1

0℃冷脅迫下高羊茅赤霉素受體基因的表達(dá)分析 冷脅迫24 h內(nèi)，12個(gè)高羊茅赤霉素受體基因在分蘗節(jié)中呈現(xiàn)多樣的表達(dá)模式（圖4A），在葉片中的表達(dá)模式則比較單一（圖4B）。冷脅迫6 h時(shí)，F(xiàn)aGID1L2b，F(xiàn)aGID1d和FaGID1L2c的表達(dá)水平在分蘗節(jié)中顯著增加且達(dá)到最高，隨后逐漸降低；冷脅迫處理下，F(xiàn)aGID1L2a，F(xiàn)aGID1L2h和FaGID1L2g在分蘗節(jié)中的表達(dá)量整體呈下降趨勢，在24 h時(shí)達(dá)到最低水平（圖4A）。在葉片中，F(xiàn)aGID1d的表達(dá)量呈先下降后上升的趨勢，在24 h時(shí)達(dá)到最高，其余基因則在脅迫6 h時(shí)的表達(dá)水平達(dá)到最高，隨后逐漸下降（圖4B）。

2.4.2 38℃熱脅迫下高羊茅赤霉素受體基因的表達(dá)分析 在熱脅迫下，12個(gè)高羊茅赤霉素受體基因在分蘗節(jié)中的表達(dá)模式總體分為三類，包括FaGID1L2a，F(xiàn)aGID1L2b，F(xiàn)aGID1L2c，F(xiàn)aGID1L2d，F(xiàn)aGID1L2h和FaGID1c在內(nèi)的6個(gè)基因的表達(dá)量在熱處理24 h后達(dá)到最高，且高于處理前的水平；FaGID1L2e和FaGID1L2g則呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，F(xiàn)aGID1a，F(xiàn)aGID1L2f和FaGID1b的表達(dá)水平在24 h時(shí)達(dá)到最低，這5個(gè)基因的表達(dá)模式為第二類；另外，F(xiàn)aGID1d在12 h時(shí)達(dá)到最低，隨后恢復(fù)到處理前水平（圖5A）。在葉片中，F(xiàn)aGID1L2b、FaGID1L2d、FaGID1L2g的表達(dá)模式與FaGID1L2a類似，在24 h時(shí)處于最高或較高水平；FaGID1d則在熱處理12 h時(shí)在葉片中表達(dá)量最高；其他相關(guān)基因在熱脅迫后表達(dá)量呈下降趨勢（圖5B）。

2.4.3 120 mM鹽脅迫下高羊茅赤霉素受體基因表達(dá)分析 在鹽脅迫24 h后，F(xiàn)aGID1L2h，F(xiàn)aGID1a，F(xiàn)aGID1c，F(xiàn)aGID1L2a和FaGID1b在分蘗節(jié)中的表達(dá)量呈現(xiàn)上升趨勢，且在24 h時(shí)的表達(dá)量最高（圖6A）；FaGID1L2b和FaGID1d呈現(xiàn)相似的表達(dá)模式；其余基因在分蘗節(jié)中隨著鹽脅迫處理時(shí)間表現(xiàn)出多樣的響應(yīng)。葉片中FaGID1L2a的表達(dá)量則在6 h時(shí)達(dá)到最高，而后下降，與此類似有FaGID1L2b，F(xiàn)aGID1L2c和FaGID1L2e；葉片中FaGID1L2h及FaGID1L2f基因在鹽脅迫12 h時(shí)降至最低水平，隨后基本恢復(fù)至脅迫前水平；FaGID1d在6 h時(shí)降至最低表達(dá)量水平，隨后恢復(fù)并升高；其他5個(gè)基因（FaGID1L2d，F(xiàn)aGID1c，F(xiàn)aGID1L2g，F(xiàn)aGID1a和FaGID1b）則在鹽脅迫24 h后達(dá)到其最高表達(dá)量（圖6B）。

2.4.4 15% PEG6000脅迫下高羊茅赤霉素受體基因的表達(dá)分析 短期干旱脅迫后，分蘗節(jié)中，F(xiàn)aGID1a，F(xiàn)aGID1b，F(xiàn)aGID1c和FaGID1L2f（圖7A）的表達(dá)量呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，在24 h達(dá)到最高；FaGID1d也表現(xiàn)出先降低后升高的表達(dá)模式，但24 h時(shí)的表達(dá)量低于起始水平；FaGID1L2a和FaGID1L2h在分蘗節(jié)中的表達(dá)水平在干旱脅迫6 h時(shí)達(dá)到了最低;FaGID1L2d，F(xiàn)aGID1L2g和FaGID1L2b在干旱處理12 h達(dá)到最高表達(dá)水平。在葉片中，F(xiàn)aGID1L2a，F(xiàn)aGID1L2b，F(xiàn)aGID1L2f和FaGID1L2h表現(xiàn)出下降的趨勢（圖7B），F(xiàn)aGID1L2c表現(xiàn)出先升高后降低的表達(dá)模式；而其他的6個(gè)基因（FaGID1L2d，F(xiàn)aGID1d，F(xiàn)aGID1a，F(xiàn)aGID1c，F(xiàn)aGID1L2g和FaGID1b）的表達(dá)水平則表現(xiàn)出先下降后上升的趨勢。

3 討論

3.1 高羊茅赤霉素受體家族成員生物信息學(xué)分析

本研究基于高羊茅轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫信息，結(jié)合序列搜索、比對分析等步驟，快速地獲得12個(gè)高羊茅赤霉素受體家族成員基因編碼區(qū)全長序列，并對其進(jìn)行了分析研究。GID1s為GA受體蛋白，其基因家族成員已在多種植物中被克隆研究，在水稻、葡萄、柑橘等作物中，GID1均定位于細(xì)胞核［10，29-30］。本研究中FaGID1s的分子量、等電點(diǎn)與編碼區(qū)長度均與擬南芥及水稻中的GID1s蛋白相似，且FaGID1蛋白也被預(yù)測定位于細(xì)胞核。此外，除FaGID1L2a，F(xiàn)aGID1L2b，F(xiàn)aGID1L2c和FaGID1L2 g還被預(yù)測定位于細(xì)胞核和葉綠體，其他FaGID1L2蛋白均被預(yù)測定位于細(xì)胞核。

基于系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，鑒定出的12個(gè)高羊茅赤霉素受體家族基因被分為兩個(gè)亞族，Ⅰ類為FaGID1L2s，Ⅱ類為FaGID1s。GID1與GID1L由HSL進(jìn)化而來［28］，本研究中，氨基酸序列比對結(jié)果也支持這個(gè)觀點(diǎn)，即FaGID1及FaGID1L2中均存在HSL家族的GXSXG保守結(jié)構(gòu)域和催化三聯(lián)體（Ser-Asp-His，S-D-H）。然而，在FaGID1中，原本在HSL中形成氧陰離子空穴的HGGG結(jié)構(gòu)域被替換為HGGS，這與水稻和擬南芥中GID1一致［21］。但在FaGID1L2中，盡管部分蛋白仍然保留HGGG結(jié)構(gòu)，另一部分蛋白（FaGID1L2a，F(xiàn)aGID1L2b，F(xiàn)aGID1L2c和FaGID1L2f）中則變?yōu)镠GGA，我們猜測這也許是HSL另外的進(jìn)化方向。此外，在FaGID1s蛋白中，HSL的催化三聯(lián)體（Ser-Asp-His，S-D-H）中的H被V（Val）或者I（Ile）取代，這和水稻和擬南芥中的GID1一致，這種變化導(dǎo)致了其脂肪酶活性的喪失，而能夠識別GA［21］。在先前的研究中，小立碗蘚（Physcomitrella patens）中PpGI1DL蛋白也含有S-D-H催化三聯(lián)體，且被證明與GA4和DELLA沒有結(jié)合能力，證明GA誘導(dǎo)的GID1-DELLA相互作用在苔蘚植物分化之后［31］。而在FaGID1L2蛋白中，S-D-H催化三聯(lián)體結(jié)構(gòu)被保留了下來。研究發(fā)現(xiàn)，同屬GID1L2家族的成員LOC_Os06g11130被證明參與調(diào)控了水稻次級分枝的伸長［22］，但目前并沒有LOC_Os06g11130與GA結(jié)合的研究。因此，GID1L2家族成員是否擁有區(qū)別于經(jīng)典的GA-GID1-DELLA復(fù)合體途徑從而參與調(diào)控植物生長的機(jī)制，還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究證明。高羊茅中的GID1L2蛋白是否與小立碗蘚中的GID1L蛋白一樣，不具備識別結(jié)合GA的能力，這有待進(jìn)一步研究。

本研究通過MEME軟件分析12個(gè)高羊茅赤霉素受體蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，共發(fā)現(xiàn) 6個(gè)結(jié)構(gòu)域（圖2）。結(jié)構(gòu)域1，2，3，6高度保守，為所有蛋白所共有，且在FaGID1L2s類蛋白中排列順序一致。結(jié)構(gòu)域4和5只存在于FaGID1s類蛋白（FaGID1a，F(xiàn)aGID1b，F(xiàn)aGID1c，F(xiàn)aGID1d）中，且結(jié)構(gòu)域6在結(jié)構(gòu)域3之后，與FaGID1L2s類蛋白（FaGID1L2a，F(xiàn)aGID1L2b，F(xiàn)aGID1L2c，F(xiàn)aGID1L2d，F(xiàn)aGID1L2e，F(xiàn)aGID1L2f，F(xiàn)aGID1L2g，F(xiàn)aGID1L2h）中結(jié)構(gòu)域6的排列位置不同。結(jié)構(gòu)決定功能，由此我們可以推斷，F(xiàn)aGID1s在生長發(fā)育中及逆境脅迫等方面也許和水稻及擬南芥中的GID1s起類似的作用，這也側(cè)面說明了GID1L2s與GID1s的功能上存在一定的差異，需進(jìn)一步的研究來證明。

3.2 非生物脅迫下高羊茅赤霉素受體家族成員的表達(dá)

高溫、低溫、鹽害、干旱是最常見的非生物脅迫，對植物的生長發(fā)育有重要影響。赤霉素受體作為赤霉素調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的重要元件，在感受GA信號的同時(shí)結(jié)合DELLA蛋白來激活下游GA反應(yīng)以便植物應(yīng)對各種非生物脅迫。干旱脅迫下，水稻gid1突變體氣孔導(dǎo)度增加；而淹水條件下，gid1突變體中葉綠素和碳水化合物增加，并且具有較強(qiáng)的清除活性氧的能力，表現(xiàn)出更好的耐淹性［32］。另外，有研究表明低溫影響擬南芥gid1b突變體根系的伸長［18］。GID1參與了逆境的調(diào)控，而關(guān)于GID1L是否參與逆境調(diào)控的研究還未見文獻(xiàn)報(bào)道。

本研究對逆境脅迫下高羊茅12個(gè)赤霉素受體基因進(jìn)行定量表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)赤霉素受體家族成員響應(yīng)多種脅迫，同時(shí)，在4種逆境脅迫下，大部分FaGID1L2s在分蘗節(jié)與葉片中呈現(xiàn)不同的表達(dá)模式。例如PEG脅迫下分蘗節(jié)中FaGID1L2a，F(xiàn)aGID1L2b，F(xiàn)aGID1L2d和FaGID1L2h呈現(xiàn)先下降后上升的表達(dá)趨勢，然而在葉中，F(xiàn)aGID1L2a，F(xiàn)aGID1L2b和FaGID1L2h都呈現(xiàn)下降的趨勢，F(xiàn)aGID1L2d呈現(xiàn)上升的趨勢。反觀FaGID1s，無論在分蘗節(jié)還是葉片中，PEG脅迫下都呈先下降后上升的表達(dá)趨勢，且最終表達(dá)量高于處理前，前人對水稻進(jìn)行PEG處理后也發(fā)現(xiàn)GID1轉(zhuǎn)錄水平顯著增加［32］，這與我們的定量結(jié)果一致（圖7）。不僅如此，其他脅迫下也能發(fā)現(xiàn)一些在分蘗節(jié)中和葉中表達(dá)模式不同甚至相反的基因，例如在高溫脅迫下，F(xiàn)aGID1L2c和FaGID1L2h在分蘗節(jié)中呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，而在葉片中呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢（圖5），且這些基因大多是FaGID1L2s（圖4～圖7），意味著FaGID1L2s可能在不同的組織部位中發(fā)揮不同的作用。由圖4可知，冷脅迫下葉中僅有FaGID1d與其他所有的基因表達(dá)模式不一致，其他基因均在脅迫后6 h達(dá)到最高的表達(dá)量，而FaGID1d在24 h時(shí)表達(dá)量最高，先前有研究報(bào)道水稻gid1突變體對冷脅迫有更高的耐受性［33］，以及冷脅迫下柑橘葉片中涉及GA代謝的基因減少［34］，也許能一定程度解釋FaGID1d與其他基因表達(dá)模式不同的原因，但具體的分子機(jī)制還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。擬南芥三個(gè)GID1基因之間存在功能冗余［35］，而本研究中FaGID1s與水稻和擬南芥GID1的親緣關(guān)系較近，且FaGID1s在不同脅迫及不同部位中的表達(dá)模式幾乎一致，我們猜測FaGID1s功能相似甚至可能出現(xiàn)功能冗余。高羊茅赤霉素受體家族很有可能參與調(diào)控逆境，且不同亞族的基因調(diào)控可能有組織特異性。本研究揭示了高羊茅GID1及GID1L2家族在不同逆境脅迫下的動態(tài)性及復(fù)雜性，然而對于其響應(yīng)逆境的機(jī)制，還需要進(jìn)一步的研究證明。

4 結(jié)論

本文利用生物信息學(xué)方法鑒定了12個(gè)赤霉素受體家族成員，對其序列和功能進(jìn)行了分析和預(yù)測。亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果顯示其定位于細(xì)胞核和葉綠體，系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明其存在兩個(gè)進(jìn)化枝，MEME結(jié)構(gòu)域分析揭示了高羊茅不同亞族間在保守結(jié)構(gòu)域的數(shù)目及排布方式基本一致，與系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果相吻合。氨基酸比對結(jié)果中GID1L2與GID1之間存在的差異，是否決定了GID1L2與GID1之間的功能進(jìn)化方向，這需要進(jìn)一步對兩者功能進(jìn)行研究確定，同時(shí)也為后續(xù)實(shí)驗(yàn)開展提供理論基礎(chǔ)。在生信分析的基礎(chǔ)上，本研究還分析了高羊茅赤霉素受體基因在4種短期逆境下的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，結(jié)果表明12個(gè)基因?qū)Σ煌哪婢趁{迫均有響應(yīng)，GID1L2s的調(diào)控方式可能具有組織特異性，GID1s之間則功能更相似。本研究為深入研究高羊茅赤霉素受體家族基因功能提供了理論依據(jù)，進(jìn)一步推動了赤霉素受體基因的研究與發(fā)展。

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（責(zé)任編輯 彭露茜）