摘要要：【目的】克隆金線蘭NPR1基因家族成員，分析其在根、莖、葉及不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑處理下的表達(dá)模式。【方法】采用RT-PCR法克隆金線蘭NPR1基因，進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析其在不同組織及不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑處理下的表達(dá)?！窘Y(jié)果】克隆得到兩條長(zhǎng)度分別為1 803 bp和1 401 bp的NPR1基因序列，分別命名為ArNPR1-1和ArNPR1-2。ArNPR1基因在金線蘭不同部位表達(dá)具有組織特異性，其在莖中表達(dá)較低，在根、葉表達(dá)較高。ArNPR1基因?qū)Σ煌参锷L(zhǎng)調(diào)節(jié)劑SA、MeJA處理的響應(yīng)模式存在差異；SA處理后12 h和24 h，ArNPR1基因的表達(dá)量均上調(diào)；MeJA處理后12 h，ArNPR1基因的表達(dá)量上調(diào)，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，表達(dá)量下調(diào)?！窘Y(jié)論】成功克隆2個(gè)金線蘭NPR1基因，明晰了其在不同組織及SA、MeJA處理下的表達(dá)特征，為后續(xù)基因功能驗(yàn)證與應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：金線蘭；NPR1；生物信息學(xué)分析；表達(dá)分析

中圖分類號(hào)：S567.239" " " " " " " " " " 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A" " " " " " " " " " " 文章編號(hào)：2095-5774（2024）05-0403-08

Cloning of NPR1 Gene and Expression Analysis of Resistance Response in

Anoectochilus Roxburghii

Liu Bingqi1，Yan Peipei2，Wang Peiyu2，Li Zunwen2，Wu Mingjun3，Li Hansheng4，

Lin Minshui5，Jiang Jinlan2，Ye Wei2*

（1College of Horticulture，Nanjing Agricultural University，Nanjing，Jiangsu 210095，China;

2 Sanming Academy of Agricultural Sciences/ Fujian Key Laboratory of Crop Genetic Improvement and Innovative Utilization for Mountainous Areas，Sanming，F(xiàn)ujian 365509，China;

3 Shaxian Agriculture and Rural Bureau， Sanming，F(xiàn)ujian 365509，China;

4 Sanming University， Sanming，F(xiàn)ujian 365500，China;

5 Yongan Forestry Bureau， Sanming， Fujian 366038， China ）

Abstract：【Objective】Cloning members of the NPR1 gene family in Anoectochilus roxburghii and analyzing their expression patterns in roots，stems，and leaves，and under different plant growth regulator treatments. 【Method】The NPR1 gene of Anoectochilus roxburghii was cloned using RT-PCR，and bioinformatics analysis was performed. Real time fluorescence quantitative PCR was used to analyze its expression in different tissues and under different plant growth regulator treatments.【Result】Two NPR1 gene sequences with lengths of 1 803 bp and 1 401 bp were cloned and named ArNPR1-1 and ArNPR1-2，respectively. The expression of ArNPR1 gene in different parts of Anoectochilus roxburghii had tissue specificity，with lower expression in the stem and higher expression in the roots and leaves. The response patterns of ArNPR1 gene to different plant growth regulators SA and MeJA treatments varied；The expression level of ArNPR1 gene was upregulated at 12 and 24 hours after SA treatment；After 12 hours of MeJA treatment，the expression level of ArNPR1 gene was upregulated，and with the prolongation of treatment time，the expression level was downregulated.【Conclusion】This experiment successfully cloned two NPR1 genes from Anoectochilus roxburghii and analyzed their expression in different tissues and under SA and MeJA treatments，providing a basis for gene function validation and utility in the future.

Key words：Anoectochilus roxburghii；NPR1；Bioinformatics analysis；Expression analysis

金線蘭（Anoectochilus roxburghii）是蘭科（Orchidaceae）開唇蘭屬植物，富含金線蓮苷［1］，具有抗炎、降血糖、保護(hù)肝臟的功效［2］，在廣東，福建等地區(qū)用藥歷史悠久，是閩臺(tái)特色中草藥，備受青睞，稱為“藥王”［3］。

植物擁有復(fù)雜的免疫系統(tǒng)，是否成功免疫取決于非特異性預(yù)先形成和誘導(dǎo)的防御機(jī)制以及特異性誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)。非表達(dá)病程相關(guān)蛋白（Non-expresser of pathogenesis related genes 1，NPR1）在免疫反應(yīng)功效中起著不可或缺的作用，廣泛參與免疫防御反應(yīng)，是植物防御信號(hào)中的一個(gè)重要調(diào)節(jié)因子［4］。已有研究表明NPR1 是水楊酸（SA，Salicylic acid）和茉莉酸/乙烯（JA/ET，Jasmonates/Ethylene）反應(yīng)之間串?dāng)_的關(guān)鍵要素［5］，其在建立系統(tǒng)獲得性抗性（systemic acquired resistance，SAR）中起著重要作用［6］。NPR1是SAR的正調(diào)節(jié)因子，是參與SAR建立的關(guān)鍵基因。NPR1編碼一個(gè)錨蛋白重復(fù)序列（ankyrin-repeat sequence）的蛋白，屬轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白，主要調(diào)控TGA轉(zhuǎn)錄因子（TF，TGACG motif-binding factor），從而激活病程相關(guān)蛋白基因（Pathogenesis-related gene，PR基因）的表達(dá)。

NPR1基因首次在擬南芥中被克隆，目前共鑒定出6個(gè)AtNPR1s基因［7］，NPR1基因也存在于其他植物，如水稻（Oryza sataval）［8］、小麥（Triticum aestivum）［9］、煙草（Nicotiana tabacum）［10］等，在雙子葉植物和單子葉植物中過表達(dá)擬南芥（Arabidopsis thaliana）NPR1或其同源物可以增強(qiáng)其對(duì)多種病原體的抗病性［11］。水稻OsNPR1/NH1在擬南芥中過表達(dá)時(shí)，顯著增加對(duì)病原體的抗性，也導(dǎo)致植株對(duì)昆蟲的敏感增加；小麥NPR1直系同源物的過表達(dá)增強(qiáng)了抗病性［12］；已有報(bào)道均表明NPR1基因在植物免疫方面起著重要作用。

目前已在各種物種中鑒定出NPR1基因，如黃瓜（Cucumis sativus）［13］，胡蘿卜（Daucus carota）［14］，煙草［10］等。已知蘭科植物僅見蝴蝶蘭（Phalaenopsis amabilis）［15］、文心蘭（Oncidium Gower Ramsey）［16］NPR1基因的克隆分析報(bào)道，而金線蘭NPR1基因克隆尚未見報(bào)道。然而，隨著更多物種NPR1蛋白被發(fā)現(xiàn)，其功能的復(fù)雜性和可變性也在增加。因此，本研究對(duì)金線蘭NPR1基因家族成員進(jìn)行克隆，分析其在不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑處理與不同組織部位的表達(dá)情況，對(duì)探究金線蘭抗性機(jī)制及培育金線蘭抗性品種具有重要意義。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

供試的金線蘭無菌苗為 ‘紅霞’，保存于三明市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院藥用植物研究所，培養(yǎng)與繼代參照羅慶國等［17］的方法。

1.2樣品采集處理

將金線蘭幼苗植株清洗消毒處理后移栽至基質(zhì)土，置于12 h/12 h人工氣候箱，晝夜交替培養(yǎng)3 d。對(duì)金線蘭分別噴施100 μmol/L SA、50 μmol/L茉莉酸甲酯（Methyl Jasmonate，MeJA），并于處理0 h、12 h、24 h時(shí)收集葉片，用液氮速凍處理；采集根、莖、葉組織分別液氮處理；每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10株；液氮速凍后保存于-80℃超低溫冰箱備用。

1.3引物設(shè)計(jì)

DNAMAN 9.0設(shè)計(jì)金線蘭Actin內(nèi)參基因（ArACT）及ArNPR1基因家族成員的引物序列，如表 1所示。以下引物均由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。

1.4" 金線蘭NPR1基因全長(zhǎng)克隆

在蛋白質(zhì)家族pfam數(shù)據(jù)庫（pfam.xfam.org）下載 NPR1基因家族的種子文件（PF12313），于轉(zhuǎn)錄組（編號(hào)SRX25007209）組裝的cDNA推導(dǎo)的蛋白序列進(jìn)行隱馬克夫模型（Hidden Markov models，HMMs）搜索，利用所得的候選NPR1序列片段設(shè)計(jì)特異性引物，擴(kuò)增得到ArNPR1基因家族成員，提交至NCBI（ncbi.nlm.nih.gov），獲取登錄號(hào)。使用MEME工具（http：//meme-suite.org/tools/meme）和NCBI CDD（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）在線分析金線蘭NPR1蛋白的保守基序和保守結(jié)構(gòu)域。

1.5" 金線蘭NPR1進(jìn)化樹分析

利用MEGA 11，將所獲得的ArNPR1基因家族成員的蛋白序列與不同物種蛋白序列采用鄰接法（Neighbor-Joining，NJ；Bootstrap=500）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，使用Evolview完善進(jìn)化樹。擬南芥AtNPR1、AtNPR2、AtNPR3、AtNPR4、AtBOP1、AtBOP下載于TAIR（arabidopsis.org），其他近似物種序列包括大豆（Glycine max）GmNPR1-1、GmNPR1-2、葡萄（Vitis vinifera）VvNPR1.2、湖北海棠（Malus hupehensis）MhNPR1、白毛果楊（Populus trichocarpa）PtNPR1、PtNPR2、PtNPR4、PtBOP1、PtBOP2、高粱（Sorghum bicolor）SbNPR1、SbNPR2、SbNPR3、SbBOP1、SbBOP2、甜菜（Beta vulgaris）BvNIM1、煙草NtNPR1、可可（Theobroma cacao）TcNPR1、文心蘭OgNPR1-1、OgNPR1-2、臺(tái)灣蝴蝶蘭PaNPR1、小蘭嶼蝴蝶蘭（Phalaenopsis equestris）PeNPR1、小果野蕉（Musa acuminata AAA Group）MaNPR1-A、MaNPR1-B、粳稻（Oryza sativae Japonica Group）OsNPR1、OsBOP2秈稻（Oryzae sativa Indica Group）OsNPR1/NH1下載于NCBI數(shù)據(jù)庫。

1.6" 金線蘭NPR1基因表達(dá)分析

利用TRIzol法提取金線蘭組織RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Hieff qPCR SYBR Green Master Mix）將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。利用ABI QuantStudio 3熒光定量 PCR 儀進(jìn)行熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)。反應(yīng)體系（20.0 μL）：cDNA 1.0 μL，上下引物各1.0 μL，SYBRⅡ 10 μL，ddH2O補(bǔ)足至20.0 μL。擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變形 3 min，94℃變性 30 s，56℃退火30 s，72℃延長(zhǎng)1 min，40 個(gè)循環(huán)72℃反應(yīng)10 min。以Actin為內(nèi)參，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。不同處理的相對(duì)表達(dá)量采用2-△△Ct計(jì)算，利用SPSS軟件進(jìn)行分析，用單因素ANOVA計(jì)算樣品的差異顯著性，用Origin 2021繪制多因子柱狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1" 金線蘭NPR1基因全長(zhǎng)克隆

克隆得到兩條長(zhǎng)度分別為1 803 bp和1 401 bp的核酸序列，分別編碼600個(gè)和466個(gè)氨基酸。開放閱讀框分別為1 686 bp和1 392 bp，分別編碼561個(gè)和463個(gè)氨基酸。NCBI的 blastn比對(duì)結(jié)果顯示，2條核酸序列與鐵皮石斛、蝴蝶蘭NPR1序列具有較高一致性（表 2）。將2條序列命名為ArNPR1-1和ArNPR1-2，提交NCBI，獲得登錄號(hào)PQ148128和PQ189702。利用MEME和NCBI CDD進(jìn)行保守基序與保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示ArNPR1-1、ArNPR1-2蛋白均有6個(gè)保守基序（motif 1-6）（圖1 A）。保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)ArNPR1-1、ArNPR1-2均有NPR1-like-C、BTB-POZ、ANKYR結(jié)構(gòu)域（圖1 B），是典型的NPR1家族蛋白。

2.2" 金線蘭NPR1進(jìn)化樹分析

為探究ArNPR1基因家族成員與其他物種NPR1基因家族成員的進(jìn)化關(guān)系，利用MEGA對(duì)不同物種NPR1蛋白序列與ArNPR1-1、ArNPR1-2共同構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，如圖 2所示。結(jié)果表明2個(gè)ArNPR1蛋白與文心蘭、蝴蝶蘭、高粱的親緣關(guān)系較為接近，且聚類在NPR1支，表明所克隆ArNPR1基因?yàn)镹PR1類型。

2.3 金線蘭NPR1基因表達(dá)分析

利用qRT-PCR檢測(cè)ArNPR1-1、ArNPR1-2基因在金線蘭不同組織及植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑SA、MeJA處理下的表達(dá)模式，結(jié)果如圖 3所示。在不同的組織部位，ArNPR1-1、ArNPR1-2基因在莖的相對(duì)表達(dá)量較低，而在根、葉較高（圖3 A）。ArNPR1-1、ArNPR1-2基因在不同處理中均有響應(yīng)表達(dá)。噴施SA處理，ArNPR1-1、ArNPR1-2基因在處理后12 h、24 h的相對(duì)表達(dá)量上升，說明ArNPR1基因受到SA的誘導(dǎo)表達(dá)（圖3 B）。噴施MeJA，ArNPR1-1、ArNPR1-2基因的相對(duì)表達(dá)量均在12 h顯著上升，分別為0 h的8倍、2.8倍，至24 h下降（圖3 C）。

3 討論

NPR1是植物防御系統(tǒng)的重要調(diào)控因子［18］，處于植物抗病反應(yīng)信號(hào)途徑的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，常作為轉(zhuǎn)錄激活子發(fā)揮作用從而提高植物抗病性。本試驗(yàn)通過克隆得到兩條金線蘭ArNPR1-1、ArNPR1-2基因序列，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，NPR1蛋白包含BTB/POZ結(jié)構(gòu)域、ANK錨蛋白重復(fù)序列以及NPR1-like-C 3個(gè)結(jié)構(gòu)域［19-21］，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ArNPR1-1 、ArNPR1-2蛋白均有NPR1-like-C、BTB-POZ、ANKYR結(jié)構(gòu)域，這3個(gè)結(jié)構(gòu)域在金線蘭中較為保守，ArNPR1-2蛋白還有DUF3420結(jié)構(gòu)域，也說明ArNPR1-1與ArNPR1-2蛋白結(jié)構(gòu)存在差異。BTB、ANKYR結(jié)構(gòu)域與TGA蛋白互作相關(guān)［10］，因此NPR1基因?qū)μ嵘参锟剐钥赡芫哂兄匾饬x，多重序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)其呈現(xiàn)較高的保守性，預(yù)示著功能的相似。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示ArNPR1蛋白與文心蘭、蝴蝶蘭、高粱親緣關(guān)系較接近。其中ArNPR1-1與OgNPR1-1、OgNPR1-2、PaNPR1、PeNPR1聚為一支，有研究發(fā)現(xiàn)，SAR誘導(dǎo)后，文心蘭OgNPR1-1、OgNPR1-2會(huì)產(chǎn)生與擬南芥相同的系統(tǒng)性抗性［16］，推測(cè)ArNPR1-1可能參與SAR的負(fù)調(diào)控［22］；而ArNPR1-2與SbNPR3聚為一支，可能是因?yàn)镹PR1基因的保守性。

有研究表明，NPR1基因還參與器官發(fā)育，而擬南芥AtNPR5基因具有調(diào)控葉片生長(zhǎng)發(fā)育功能［23］，這與本試驗(yàn)中金線蘭根莖葉部位qRT-PCR分析結(jié)果：ArNPR1-1、ArNPR1-2基因相對(duì)表達(dá)量在不同組織存在明顯差異，且在莖的相對(duì)表達(dá)量較低，而在根、葉較高結(jié)果相吻合，也與NPR1基因在玉米中表達(dá)具有相似性［24］，而擬南芥AtNPR1無組織表達(dá)特異性，這可能是因?yàn)镹PR1基因家族成員發(fā)生了進(jìn)化，且在不同物種中的組織表達(dá)具有差異。

植物的抗病性主要受2種激素（SA、JA）的調(diào)控，且植物中研究最多的誘導(dǎo)防御反應(yīng)之一是SAR，SAR在局部感染病原體后觸發(fā)，引起過敏性壞死，并且對(duì)廣泛的植物病原體有效。SA誘導(dǎo)的SAR不僅促使編碼發(fā)病機(jī)制相關(guān)PR蛋白的基因在內(nèi)的大量基因的上調(diào)，其也在植物防御起重要作用，病原體則通過攻擊NPR1及其輔助調(diào)節(jié)因子去抑制SAR有效防御途徑，從而削弱植物抗病性［25］。SAR的激活可以抑制植物中的JA信號(hào)傳導(dǎo)，這與SA存在拮抗關(guān)系［5］，而NPR1基因、SA、抗性三者關(guān)系緊密。NPR1在SA下游信號(hào)傳遞具關(guān)鍵作用，由此通過SAR途徑來提高植物抗性［26］。本試驗(yàn)的基因表達(dá)分析表明，SA處理能誘導(dǎo)ArNPR1基因的上調(diào)表達(dá)。有研究表明，外源施加MeJA后可誘導(dǎo)野生型擬南芥對(duì)灰霉菌（B.cinerea）的抗性。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ArNPR1基因在MeJA誘導(dǎo)下，相對(duì)表達(dá)量隨著時(shí)間延長(zhǎng)先上升而后下降，這與在文心蘭中NPR1基因均能響應(yīng)SA、MeJA表達(dá)的試驗(yàn)結(jié)論一致［16］，但是否SA、MeJA處理提高了金線蘭的抗逆性還需進(jìn)一步分析。

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（責(zé)任編輯：馮" "新）

收稿日期：2024-09-06

基金項(xiàng)目：福建省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2023S0018、2023N0047、2024N5008）；福建省省級(jí)財(cái)政林業(yè)專項(xiàng)資金（閩財(cái)資環(huán)指［2020］10號(hào)）；三明市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2023-N-6、2023-N-19）

作者簡(jiǎn)介：*為通訊作者，葉煒（1980-），男，副研究員，博士，主要從事園藝植物生物技術(shù)研究，E-mail：yewei922@qq.com。

劉冰琪（2002-），女，碩士研究生，主要從事園藝植物生物技術(shù)研究，E-mail：2098134008@qq.com