摘要要:【目的】篩選延遲芥菜抽薹開花的外源褪黑素處理濃度,揭示其生理效應(yīng),解析褪黑素調(diào)節(jié)抽薹相關(guān)基因的表達(dá)特性,為芥菜抑制抽薹及新品種選育提供理論依據(jù)。【方法】以芥菜為研究對象,在苗期噴施不同濃度外源褪黑素,測定植株抽薹開花時間和不同時期生理指標(biāo),定量PCR分析抽薹相關(guān)基因的表達(dá)情況?!窘Y(jié)果】采用不同濃度外源褪黑素(0.02、0.2、0.5、1和2 mM)噴施芥菜,其中2 mM褪黑素可延遲抽薹23 d,抽薹時間顯著晚于對照(81.25 d)。褪黑素處理后,在芥菜生育時期為49 d、59 d未抽薹期以及109 d和114 d抽薹期植株中,過氧化物酶POD、超氧化物歧化酶SOD活性和可溶性蛋白含量均顯著增加,最高可分別比對照增加25.56%、26.51%和24.03%。過氧化氫酶CAT活性和可溶性糖含量在104 d和114 d抽薹期顯著增加;丙二醛MDA含量在抽薹期顯著降低。褪黑素處理后,芥菜生育時期為39 d、109 d和114 d植株中SOC1、AGL24和PAT2基因表達(dá)水平顯著降低,PAT15基因的表達(dá)顯著增加;PAT24基因表達(dá)在生育時期為49 d和59 d未抽薹期顯著增加,在抽薹期又顯著降低?!窘Y(jié)論】 高濃度外源褪黑素處理可顯著延遲芥菜抽薹,增加未抽薹和抽薹植株中POD、SOD和可溶性蛋白含量;褪黑素對SOC1、AGL24、PAT2、PAT15和PAT24基因的表達(dá)水平均有影響。
關(guān)鍵詞:芥菜;褪黑素;抽薹開花;生理變化;基因表達(dá)
中圖分類號:S637.3" " " " " " " " " " "文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A" " " " " " " " " " " " 文章編號:2095-5774(2024)05-0386-10
Analyses of Exogenous Melatonin on Physiological Effects and Gene Expression Associated
with Brassica juncea Bolting and Flowering
Liu Lian1,2,#,Li Jingfei1,#,Ma Guanpeng2,Wang Zhimin1,Wei Dayong1,Tang Qinglin1*
( 1 College of Horticulture and Landscape Architecture,Southwest University,Beibei,Chongqing 400715,China;
2 Horticulture Institute,Guizhou Academy of Agricultural Sciences,Guiyang,Guizhou 550009,China)
Abstract:【Objective】To screen the concentration of exogenous melatonin to delay bolting and flowering,reveal its physiological effects,analyze the expression characteristics of genes related to bolting,and provide theoretical basis for bolting tolerance production and new variety breeding in Brassica juncea.【Method】The bolting time" and many physiological indexes were determined after spraying different concentrations of melatonin at seedling stage,and the relative expression levels of bolting-related genes were analyzed via qRT-PCR in Brassica juncea. 【Result】Different concentrations of exogenous melatonin (0.02,0.2,0.5,1 and 2 mM) were used to treat mustard in this study. The bolting and flowering time of Brassica juncea was delayed 23 days by 2 mM exogenous melatonin,which was significantly later than that of the control. The activities of peroxidase (POD),superoxide dismutase (SOD) and the contents of soluble protein were remarkably increased at the 49 d and 59 d growth stages of non-bolting,and the 109 d and 114 d of bolting plants treated with melatonin,and their highest increments were 25.56%,26.51% and 24.03%,respectively. However,the contents of catalase (CAT) and soluble sugar increased significantly at the 104 d and 114 d stages of bolting plants. And the content of malondialdehyde (MDA) decreased significantly at the bolting stage. After melatonin treatment,the expression levels of SOC1,AGL24 and PAT2 genes decreased significantly but the expression of PAT15 gene increased significantly at the 39 d non-bolting stage as well as the 109 d and 114 d bolting stages. In contrast,the expression of PAT24 gene increased significantly at the 49 d and 59 d non-bolting stages but decreased obviously at the bolting stage. 【Conclusion】Treatment with high concentration of melatonin significantly delayed bolting,increased POD,SOD and soluble protein contents in the non-bolting and bolting plants. Furthermore,the expression levels of SOC1,AGL24,PAT2,PAT15 and PAT24 genes were affected by the exogenous melatonin at both pre-bolting and bolting stages in Brassica juncea.
Key words:Brassica juncea;Melatonin;Bolting and flowering;Physiology changes;Gene expression
芥菜(Brassica juncea)是十字花科蕓薹屬重要蔬菜,包括4大類(根用、莖用、葉用和薹用)16 個變種,既可鮮食亦有加工,在全國特別是西南地區(qū)栽培廣泛,形成了不少名特產(chǎn)品,例如重慶和浙江的榨菜,江蘇和云南的大頭菜,湖北和湖南的雪菜或梅干菜,四川和貴州的酸菜和鹽酸菜,四川冬菜及芽菜等。其中,“涪陵榨菜”被譽(yù)為世界三大名腌菜(涪陵榨菜、歐州酸菜、日本醬菜)之一[1]。據(jù)不完全統(tǒng)計,作為榨菜加工用的莖用類芥菜莖瘤芥,在全國范圍內(nèi)的種植面積達(dá)18.8萬ha,其中川渝地區(qū)的種植面積16.0萬ha,每年加工成品榨菜117.9萬t,是我國榨菜產(chǎn)業(yè)的主要區(qū)域[1]。抽薹開花是芥菜從營養(yǎng)生長向生殖生長轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵期,生產(chǎn)上如果芥菜品種選擇不適宜或栽培技術(shù)不當(dāng)?shù)龋苋菀壮霈F(xiàn)大面積“先期抽薹開花”現(xiàn)象,導(dǎo)致其產(chǎn)量和品質(zhì)下降,從而嚴(yán)重制約芥菜產(chǎn)業(yè)的持續(xù)穩(wěn)定和健康發(fā)展。
近年來,褪黑素在調(diào)控植物抽薹開花方面的作用受到了人們的重視。褪黑素(melatonin,MT)是一種含有吲哚雜環(huán)的激素。褪黑素在動物體內(nèi)主要參與調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律,具有延緩衰老、改善睡眠等作用;在植物體內(nèi)參與調(diào)節(jié)植物抗性、光周期、非生物脅迫、抽薹開花等[2]。外源褪黑素可增強(qiáng)番茄對干旱和高溫脅迫的耐受性,增加植株葉綠素和脯氨酸含量,提高果實數(shù)量、坐果率和產(chǎn)量,促進(jìn)番茄紅素、類胡蘿卜素等品質(zhì)形成[3]。褪黑素可以影響植株的光周期,用0.1 mM或0.5 mM的褪黑素處理,可顯著延遲短日照植物紅葉藜開花時間[4]。褪黑素還可以緩解脫落酸脅迫,保護(hù)擬南芥的光系統(tǒng)II并延緩葉片衰老[5]。另外,外源施用0.5 mM或1 mM褪黑素會使擬南芥FLC基因表達(dá)水平顯著升高,延遲植株的成花轉(zhuǎn)變[6]。此外,褪黑素和獨(dú)腳金內(nèi)酯(strigolactone,SL)也彼此相互影響,在擬南芥開花過程中,獨(dú)腳金內(nèi)酯會通過影響FLC基因的表達(dá)來抑制褪黑素的合成[7]。褪黑素能調(diào)控模式植物擬南芥的成花轉(zhuǎn)變,但調(diào)控機(jī)制研究還不夠深入[8-9]。
褪黑素在調(diào)控蔬菜抽薹開花方面的研究較晚,目前褪黑素對芥菜的抽薹調(diào)控機(jī)制還未見報道,生理機(jī)制還不清楚。前人研究發(fā)現(xiàn),洋蔥植株中可溶性糖、可溶性蛋白質(zhì)、活性氧清除系統(tǒng)的SOD和POD等酶活性與成花和抽薹存在相關(guān)性[10]。褪黑素在調(diào)節(jié)芥菜抽薹開花時,是否也會影響SOD、POD、CAT、糖和蛋白等生理效應(yīng),目前缺乏系統(tǒng)研究。另外,開花整合因子SOC1、AGL24是參與擬南芥開花調(diào)控的核心作用因子[11-12];蛋白質(zhì)S-?;D(zhuǎn)移酶PAT(Protein S-Acyl Transferase)能參與調(diào)節(jié)細(xì)胞擴(kuò)張、開花與受精等多種發(fā)育進(jìn)程[13-15]。褪黑素是否也調(diào)控芥菜開花整合子SOC1、AGL24以及PAT家族成員的表達(dá)值得深入探究。本研究通過對芥菜外源施用不同濃度褪黑素,篩選能顯著延遲抽薹開花的處理;測定可溶性蛋白、可溶性糖等多項生理指標(biāo),探討芥菜未抽薹期和抽薹期的生理效應(yīng);并進(jìn)一步分析抽薹開花整合子(SOC1和AGL24)和PAT家族成員(PAT2、PAT15和PAT24)等抽薹相關(guān)基因的表達(dá)特性。這為深入解析褪黑素調(diào)控芥菜抽薹開花分子機(jī)制、延遲抽薹芥菜新品種選育及栽培生產(chǎn)等提供借鑒。
1 材料與方法
1.1試驗材料
試驗材料芥菜為純合自交系,由重慶市蔬菜學(xué)重點實驗室提供。選取飽滿的芥菜種子,用9%的H2O2消毒2 min后,均勻放置含濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中,25℃恒溫箱催芽。待種子露白后,4℃冰箱春化4 d,轉(zhuǎn)入穴盤中育苗,在3片真葉期將幼苗移栽至直徑12 cm含營養(yǎng)土的育苗盆,人工氣候室(22℃ 16 h光照/ 20℃ 8 h黑暗)培養(yǎng)。
1.2褪黑素處理
在芥菜幼苗移栽定植后生長10 d(約5片真葉期),分別進(jìn)行不同濃度褪黑素(0.02、0.1、0.5、1、2 mM)處理,以清水為對照(CK)。在熄燈0.5 h后噴施于芥菜葉片正反兩面,以葉片滴水為度,每隔7~8 d噴施1次,連續(xù)噴施至有處理開始抽薹現(xiàn)蕾,停止所有處理的褪黑素噴施。統(tǒng)計抽薹開花時間,并分別在芥菜生育時期分別為39 d、49 d、59 d(未抽薹期)和104 d、109 d、114 d(抽薹期),選取靠近莖尖真葉,液氮預(yù)凍后-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>
1.3生理指標(biāo)測定與統(tǒng)計分析
選用效果最為顯著的褪黑素濃度處理芥菜后,檢測芥菜植株生育時期分別為39 d、49 d和59 d(未抽薹期)和104 d、109 d和114 d(抽薹期)的生理指標(biāo)。
采用蒽酮比色法測定可溶性糖、考馬斯亮藍(lán)G250染色法測定可溶性蛋白、愈創(chuàng)木酚法測定過氧化物酶(POD)活性、氮藍(lán)四唑(NBT)測定超氧化物歧化酶(SOD)活性、高錳酸鉀滴定法測定過氧化氫酶(CAT)、硫代巴比妥酸法測定丙二醛(MDA)含量[16-17]。每項生理指標(biāo)測定均重復(fù)3次。
用Excel辦公軟件和SPSS統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。利用方差分析比較不同處理的差異顯著性,多重比較采用鄧肯法,顯著性水平為0.05。
1.4 RNA提取和反轉(zhuǎn)錄cDNA
將上述1.2選取的褪黑素處理后不同時期的芥菜葉片,利用RNA提取試劑盒TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit提取總RNA。以試劑盒TaKaRa PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser去除基因組DNA,然后分別添加適量PrimeScript RT Enzyme Mix I、5 × PrimeScript Buffer 2、RT Primer Mix和RNase Free dH2O,混勻后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>
1.5 定量PCR檢測
利用NCBI在線比對SOC1、AGL24、PAT2、PAT15、PAT24基因序列,設(shè)計芥菜上述基因特異性定量PCR引物(表1)。以芥菜ACTIN2基因作為內(nèi)參基因。定量PCR反應(yīng)體系為20 μL:Supermix 10 μL,上游引物1 μL,下游引物1 μL,模板cDNA 1 μL,ddH2O 7 μL。反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性3 min;95 ℃變性10 s,57 ℃退火30 s;循環(huán)39次。每個試驗處理分別進(jìn)行3次生物重復(fù)和3次技術(shù)重復(fù),并以2-ΔΔCt方法分析基因的相對表達(dá)量。
2 結(jié)果與分析
2.1褪黑素對芥菜抽薹開花時間的影響
采用不同濃度(0.02、0.2、0.5、1和2 mM)外源褪黑素(MT)處理芥菜后,平均抽薹時間分別為81.25 d、85.25 d、93.50 d、97.50 d、104.25 d。方差分析表明:高濃度褪黑素對延遲植株抽薹開花的效應(yīng)明顯。統(tǒng)計分析表明,F(xiàn)值為30.14,顯著性概率小于0.05,說明差異達(dá)到顯著水平。而且高濃度褪黑素處理后,植株抽薹開花表型差異也非常明顯,高褪黑素處理后芥菜植株的抽薹開花延遲、花序短、花序分支少(圖1)。
多重比較結(jié)果表明:外源噴施2 mM的褪黑素,對延遲抽薹開花的效果顯著優(yōu)于其余濃度,與CK相比,晚抽薹23 d;外源噴施0.5 mM與1 mM之間的抽薹開花時間差異不顯著,但是顯著高于CK以及0.02、0.1 mM處理;0.02 mM和0.1 mM濃度處理雖然也略微延遲抽薹,但是與CK之間差異不顯著(圖2),表明采用2 mM高濃度褪黑素進(jìn)行外源噴施,能夠顯著延遲芥菜抽薹開花。
2.2褪黑素對芥菜POD和SOD酶活性的影響
如圖3所示,采用2 mM高濃度外源褪黑素處理芥菜后,不同發(fā)育時期植株的過氧化物酶POD活性整體上存在差異,其中在第59 d達(dá)到最高值。在第49 d、59 d、109 d和114 d,褪黑素處理組的POD活性均顯著高于CK,尤其在第109 d和114 d,POD活性分別比CK提高18.28%和25.56%(圖3)在第39 d和104 d,POD活性與CK差異不顯著。表明在未抽薹期和抽薹期,外源高濃度褪黑素處理能夠一定程度上提高抗氧化酶POD活性。
由圖4可知,噴施2 mM褪黑素處理芥菜后,不同發(fā)育時期植株的超氧化物歧化酶SOD活性整體上存在差異,其中SOD活性在第104 d時達(dá)到最大值,比CK增加26.51%;與CK相比,不同發(fā)育時期植株的超氧化物歧化酶SOD活性均顯著提高,表明在未抽薹期和抽薹期,高濃度褪黑素處理能夠顯著提高抗氧化酶SOD活性。
2.3褪黑素對芥菜CAT活性和MDA含量的影響
如圖5所示,褪黑素處理芥菜后,過氧化氫酶CAT活性在不同生長時期存在差異。褪黑素處理芥菜植株在第59 d時,CAT活性達(dá)到最大值,但是與CK之間差異不顯著;當(dāng)進(jìn)入抽薹期后CAT活性逐漸降低。在第104 d、109 d和114 d,褪黑素處理組的CAT活性均顯著高于CK,分別增加23.81%、18.70%和32.08%,表明褪黑素能顯著提高芥菜抽薹期植株中CAT活性。
如圖6所示,褪黑素處理芥菜后,丙二醛MDA含量在整個生長時期呈現(xiàn)逐漸增加趨勢。在第39 d、49 d和59 d,與CK相比MDA含量差異不顯著;但在第104 d、109 d和114 d,褪黑素處理的MDA含量顯著低于CK,分別降低10.80%、10.27%和12.70%,表明2 mM褪黑素處理顯著降低抽薹期的芥菜植株中MDA含量。
2.4褪黑素對芥菜可溶性糖和蛋白含量的影響
圖7可知,采用2 mM外源褪黑素處理芥菜后,植株中可溶性糖含量在不同生長時期整體上存在差異,其中在第59 d達(dá)到最大值。在第104 d和114 d抽薹期,褪黑素處理組中可溶性糖含量顯著高于CK,分別提高15.50%和27.04%。褪黑素處理在其余時期植株中的可溶性糖含量與CK之間差異不顯著。
由圖8可知,2 mM高濃度褪黑素處理芥菜后,在生育時期為59 d未抽薹期植株中可溶性蛋白含量達(dá)到最大值,比CK增加11.46%;但在抽薹期芥菜植株中可溶性蛋白含量逐漸降低。在生育時期分別為39 d、49 d和59 d未抽薹期,褪黑素處理組中可溶性蛋白含量均顯著高于CK;在104 d時兩者之間差異不顯著;但在109 d和114 d時,可溶性蛋白含量顯著高于CK。
2.5褪黑素對芥菜抽薹相關(guān)基因表達(dá)的影響
2.5.1 褪黑素對芥菜SOC1和AGL24基因表達(dá)的影響
為了探討褪黑素處理對芥菜抽薹開花相關(guān)基因表達(dá)的影響,利用qRT-PCR檢測了抽薹開花信號整合子SOC1、AGL24等基因的相對表達(dá)水平。
芥菜SOC1和AGL24基因在2 mM褪黑素處理后,其相對表達(dá)水平與CK之間存在明顯差異(圖9)。其中,褪黑素處理后,在第39 d、49 d未抽薹期,SOC1基因相對表達(dá)水平比CK分別降低20.18%和22.92%,而AGL24基因則分別降低55.98%和23.77%(圖9);在第104 d、109 d和114 d抽薹期,SOC1相對表達(dá)水平分別比CK降低9.39%、65.24%和26.68%,AGL24基因則分別降低16.96%、42.58%和57.31%(圖9)。
2.5.2 褪黑素對芥菜PAT2、PAT15和PAT24基因表達(dá)的影響
圖10所示,2 mM外源褪黑素處理對PAT家族成員PAT2、PAT15、PAT24基因表達(dá)的影響存在差異。與CK相比,在第49 d和59 d未抽薹期以及109 d和114 d抽薹期,褪黑素處理的PAT2表達(dá)水平顯著低于CK(圖10A);在第39 d和104 d,褪黑素處理的PAT2相對表達(dá)量高于CK。
褪黑素處理下,芥菜植株中PAT15基因的相對表達(dá)量,在6個生長發(fā)育時期均顯著高于CK,分別比CK提高1.14~18.52倍(圖10B)。
在第49 d和59 d,褪黑素處理芥菜植株中的PAT24基因相對表達(dá)量顯著高于CK,分別提高43.27%和74.45%;但在第104 d、109 d和114 d卻顯著低于CK,分別降低47.03%、54.77%和9.13%(圖10C)。
3 討論
芥菜“未熟抽薹”會嚴(yán)重影響產(chǎn)量和品質(zhì),抽薹調(diào)控成為人們關(guān)注的熱點。褪黑素在植物生長發(fā)育、抗逆性、抽薹調(diào)控等方面具有重要作用。前人研究發(fā)現(xiàn),0.01 mM褪黑素處理玉米幼苗,有利于有機(jī)物在韌皮部裝載運(yùn)輸,促進(jìn)幼苗生長;而1 mM褪黑素則會影響有機(jī)物的裝載運(yùn)輸,抑制植株生長[18],這說明褪黑素對植物的作用具有劑量依賴性。本研究發(fā)現(xiàn),不同濃度外源褪黑素處理芥菜后,0.02和0.1 mM濃度對芥菜抽薹效果與對照之間差異不顯著;但0.5、1和2 mM濃度褪黑素均可顯著延遲芥菜抽薹,并且2 mM濃度的效果最明顯。這也表明褪黑素對芥菜抽薹的調(diào)節(jié)作用具有劑量效應(yīng)。
外源褪黑素可減少辣椒幼苗的低溫傷害,增加葉面積和地上部質(zhì)量,改善水分關(guān)系、光合參數(shù)和抗氧化酶活性,降低丙二醛(MDA)和過氧化氫(H2O2)含量及膜透性[19]。另外,在洋蔥植株抽薹開花過程中,細(xì)胞代謝活動增強(qiáng),超氧自由基富集,SOD活性增高;植株體內(nèi)活性氧代謝加強(qiáng),CAT活性增加;POD酶活性也會隨著植株體內(nèi)代謝的加強(qiáng)而增強(qiáng);而且可溶性糖和蛋白也會發(fā)生明顯變化[10]。洋蔥未熟抽薹與其POD、SOD、糖和蛋白等內(nèi)在聯(lián)系,可以為洋蔥抽薹作出預(yù)警和預(yù)報,對降低洋蔥栽培損失具有借鑒意義[10]。前人報道,利用“烯效唑+褪黑素”復(fù)合處理蘿卜后,能夠增加糖和蛋白含量,延緩抽薹、提高品質(zhì)[20]。另外,RhTPPF基因在玫瑰愈傷組織中的過表達(dá)促進(jìn)了糖的積累,抑制了RhCO/FT的合成;在煙草中,RhTPPF的過表達(dá)延遲了營養(yǎng)生長向開花的轉(zhuǎn)變,而RhTPPF的沉默則加速了開花;玫瑰中RhTPPF的沉默提高了海藻糖-6-磷酸(Tre6P)含量,降低了海藻糖含量[21],這也說明糖和蛋白確實能參與開花調(diào)控。本研究發(fā)現(xiàn),外源褪黑素處理能夠影響芥菜植株中可溶性蛋白、可溶性糖、SOD、POD、CAT和MDA等生理指標(biāo)的含量,說明褪黑素可調(diào)節(jié)芥菜的抽薹開花,影響植株體內(nèi)一系列生化代謝。其中,POD、SOD活性和可溶性蛋白含量具有相似的規(guī)律,在49 d和59 d未抽薹期以及109 d、114 d抽薹期不同發(fā)育階段,均顯著高于對照。但是,CAT活性和可溶性糖含量主要在104 d和114 d抽薹期顯著增加,而MDA含量主要在抽薹期顯著降低,這可能與褪黑素調(diào)節(jié)芥菜抽薹開花進(jìn)程中不同生理指標(biāo)的應(yīng)答規(guī)律不完全相同有關(guān)。
褪黑素能夠影響MIKC、DHHC型等家族成員的表達(dá)。前人研究表明,褪黑素處理可以通過調(diào)節(jié)LsGRAS13等 GRAS家族成員的表達(dá)影響萵苣抽薹特性,將LsGRAS13基因沉默后可延遲萵苣抽薹[22]。此外,MYB15基因參與調(diào)節(jié)萵苣抽薹,將LsMYB15基因沉默會導(dǎo)致早抽薹[23]。本研究中,芥菜SOC1和AGL24是抽薹開花整合因子,屬于MIKC型;芥菜PAT2、PAT15和PAT24是DHHC型PAT家族成員。褪黑素處理能夠影響芥菜SOC1、AGL24、PAT2、PAT15和PAT24基因的表達(dá)特性。與對照相比,褪黑素處理后,芥菜SOC1、AGL24和PAT2基因在芥菜生育時期為39 d未抽薹期和109 d、114 d抽薹期植株中的表達(dá)均顯著降低,而芥菜PAT15基因的表達(dá)顯著增加;然而芥菜PAT24在49 d和59 d未抽薹的表達(dá)增強(qiáng),在抽薹期顯著下降。這也表明,褪黑素調(diào)控機(jī)制非常復(fù)雜,可能以多條途徑和多種分子機(jī)制調(diào)控芥菜抽薹,這還需要深入研究。
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(責(zé)任編輯:鐘海豐)
收稿日期:2024-08-10
基金項目:國家自然科學(xué)基金項目(32172547);重慶市農(nóng)業(yè)科技現(xiàn)代先行區(qū)縣涪陵區(qū)項目“芥菜(莖瘤芥)現(xiàn)代生物技術(shù)育種”;西南大學(xué)涪陵研究院共建項目(FLYJY202401)
作者簡介:#同等貢獻(xiàn)。*為通訊作者,湯青林(1976-),男,教授,博士,主要從事蔬菜遺傳育種與生物技術(shù)研究,E-mail:
swutql@163.com。劉煉(1988-),女,碩士,主要從事蔬菜遺傳育種研究,E-mail:898012919@qq.com