摘要：開展北極茴魚（Thymallus arcticus）探明北極茴魚與同屬近緣種間的系統(tǒng)進化關系，明確其分類學地位，為制定資源保護管理方案及開展增殖放流工作提供參考資料。對采自新疆額爾齊斯河93尾北極茴魚樣本31個形態(tài)性狀和純重進行通徑分析，采用PCR技術擴增了線粒體DNA COI基因序列，結(jié)合GenBank數(shù)據(jù)庫中下載的茴魚屬魚類進行系統(tǒng)發(fā)育探討。結(jié)果表明，全長（X1）、枕骨后末端至腹鰭起點距離（X14）、臀鰭起點至背鰭基部末端距離（X21）3個指標對魚體純重影響最大，可以作為輔助選育的最優(yōu)表型；COI基因序列分析共得到26種單倍型，單倍型基因多樣性（Hd）為0.984，核苷酸多樣性（Pi）為0.0386，平均核苷酸差異（k）為20.7718，顯示出較高的遺傳多樣性水平；系統(tǒng)發(fā)育樹顯示黑龍江茴魚、歐洲茴魚和北美茴魚各自形成完整的進化枝，北極茴魚可能存在不同的進化單元，新疆分布的北極茴魚與短頭茴魚和蒙古茴魚親緣關系較近。

關鍵詞：北極茴魚；形態(tài)特征；通徑分析；COI基因；系統(tǒng)發(fā)育；額爾齊斯河

中圖分類號：S917.4 " " " "文獻標志碼：A nbsp; " " "文章編號：1674-3075（2024）06-0152-09

北極茴魚（Thymallus arcticus）隸屬于鮭形目（Salmoniformes）、鮭科（Salmonidae）、茴魚屬（Thymallus），喜棲息在清澈寒冷的中型或大型河流湖泊的開放水域中，在世界范圍內(nèi)具有極高的漁業(yè)價值（Allendorf amp; Thorgaard，1984；Reynolds，1994）。北極茴魚野生資源分布于俄羅斯、阿拉斯加、加拿大等地的環(huán)北冰洋流域中，以及美國蒙大拿州的密蘇里河上游流域，我國境內(nèi)主要分布于新疆額爾齊斯河和黑龍江流域（中國科學院動物研究所，1979；任慕蓮，2002；郭焱等，2012；Sepulveda et al，2013）。北極茴魚對生活環(huán)境要求苛刻，每年春秋兩季的產(chǎn)卵洄游和越冬洄游（向偉等，2009），使其容易受到生境碎片化及水文變化的影響，因此北極茴魚可作為研究水域生態(tài)環(huán)境的重點物種（Northcote，1995；Ellenor et al，2022）。由于人類活動和環(huán)境污染，全球范圍內(nèi)北極茴魚資源量一直處于下降趨勢，如曾在美國境內(nèi)五大湖流域分布的北極茴魚已經(jīng)消失，而密蘇里河上游分布的種群也面臨著威脅（Northcote，1995）。多年來的漁業(yè)資源調(diào)查發(fā)現(xiàn)，我國新疆額爾齊斯河流域北極茴魚的生存空間和繁殖產(chǎn)卵場也在不斷縮小，野生資源衰退，目前已被列入國家二級保護野生動物和新疆重點保護水生野生動物名錄。

近年來，在科研院所和水產(chǎn)企業(yè)的聯(lián)合技術攻關下，北極茴魚已突破人工繁育瓶頸并開展了增殖放流活動，但可供選擇的野生親魚資源數(shù)量較少、易形成近交衰退，且新疆北極茴魚形態(tài)特征多樣化，僅根據(jù)傳統(tǒng)形態(tài)學難以明確其分類地位。因此，本文通過北極茴魚形態(tài)性狀和純重間的通徑分析，利用表型數(shù)據(jù)篩選輔助選育的最優(yōu)策略，并利用線粒體DNA COI基因序列查明我國新疆地區(qū)分布的北極茴魚與同屬近緣種間的系統(tǒng)進化關系，以期為明確其分類學地位、制定資源保護管理方案以及開展增殖放流工作提供參考資料。

1 " 材料與方法

1.1 " 實驗材料

本研究測定的93尾北極茴魚于2019年11月-12月采自新疆額爾齊斯河，新鮮樣本剔除內(nèi)臟后冷凍運回實驗室，在室溫下解凍后進行形態(tài)學測量，體長和純重（去內(nèi)臟體重）信息見表1。剪取每尾魚側(cè)線上方肌肉組織置于1.5 mL離心管中，加入95%乙醇溶液固定并置于-20℃冰箱中冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 " 實驗方法

1.2.1 " 形態(tài)學測量 " 本研究采用了傳統(tǒng)的外部形態(tài)特征度量法對樣品進行可量性狀的測定，包括全長（TL）、體長（BL）、頭長（HL）、眼徑（EL）、吻長（SL）、體高（BD）、尾柄長（CPL）、尾柄高（CPD）共8個傳統(tǒng)指標（圖1）。同時，還測定了由11個解剖學坐標點組成的魚體框架圖的23個特征值，記為K1-2，K1-3等（圖2）。以上數(shù)據(jù)由游標卡尺測量獲得，數(shù)值精確至0.01 cm；所有樣品的魚體重量由電子天平稱量獲得，數(shù)值精確至0.01 g。

1.2.2 " DNA提取、PCR擴增與測序 " 取適量北極茴魚肌肉樣品晾干酒精后剪碎，使用酚-氯仿法提取樣品DNA（Mamiatis et al，1982）。擴增線粒體COI基因的引物序列分別為FishF1：5’-TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3’和FishR1：5’-TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA-3’（Ward et al，2005）。PCR反應總體積50 μL，其中10×buffer 5.0 μL，Mg2+終濃度為2.0 mmol/L，dNTP（2.5 mmol/L）4 μL，Taq聚合酶2 units，引物（10 μmol/L）各2 μL，模板DNA 2 μL（1 μg），加滅菌水至終體積為50 μL。反應過程如下：95℃預變性5 min，后接35個循環(huán)，每個循環(huán)包括94℃變性45 s，54℃退火45 s，72℃延伸1 min，最后72℃再延伸10 min。PCR擴增產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測合格后于4℃環(huán)境中保存，挑選條帶清晰的PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司進行純化回收及雙向測序。

1.3 " 數(shù)據(jù)處理

1.3.1 " 形態(tài)學數(shù)據(jù) " 使用SPSS 26.0軟件對魚體純重數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗（George amp; Malley，1999），分析8個傳統(tǒng)形態(tài)指標和框架法測定的23個特征值與純重的相關性，結(jié)合共線性分析結(jié)果選擇合適的形態(tài)參數(shù)為自變量，與因變量純重建立多元回歸方程進行通徑分析，得到形態(tài)性狀對純重的決定系數(shù)。

1.3.2 " 遺傳學數(shù)據(jù) " 從GenBank數(shù)據(jù)庫下載32尾茴魚屬魚類的COI序列（表2），結(jié)合本研究得到的序列進行系統(tǒng)發(fā)育分析。使用DNAStar軟件包中的SeqMan程序進行序列比對和人工校正后，用EditSeq程序進行剪切和保存（Burland，2000）。采用Mega軟件對序列的核苷酸組成、氨基酸組成、變異位點和簡約信息位點進行統(tǒng)計，以真白鮭Coregonus lavaretus（GenBank登錄號：MG951552）和長頜北鮭Stenodus leucichthys（GenBank登錄號：MG951553）做外群，基于Kimura雙因子模型構(gòu)建鄰接（neighbor-joining，NJ）系統(tǒng)發(fā)育樹，并經(jīng)自展分支1 000次循環(huán)檢驗節(jié)點支持度（Kumar et al，1994）。

2 " 結(jié)果與分析

2.1 " 形態(tài)性狀的通徑分析

2.1.1 " 形態(tài)參數(shù)描述性統(tǒng)計和相關性分析 " 通過夏皮羅-威爾克（S-W）檢驗法對魚體純重數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗，所得P=0.192（gt;0.05），表明魚體純重數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布，可進一步結(jié)合形態(tài)參數(shù)推導線性回歸。將北極茴魚的8個基本形態(tài)參數(shù)和23個框架數(shù)據(jù)進行描述性統(tǒng)計，結(jié)果如表3所示。通過變異系數(shù)可以看出離散程度最大的3組數(shù)據(jù)為純重、K9-11、K4-7，離散程度最小的3組數(shù)據(jù)為K1-3、K2-4、眼徑。

進一步分析北極茴魚表型數(shù)據(jù)與純重的相關性，前10個表型參數(shù)如表4所示。所測的31組表型數(shù)據(jù)與純重的相關系數(shù)為0.278～0.945，共有23個表型與魚體純重存在極顯著相關性，2個表型與魚體純重存在顯著相關性，其中相關系數(shù)最大的3個表型分別為全長（0.945）、體長（0.943）和K5-6（0.921），相關系數(shù)最小的3個表型分別為K8-10（0.278）、眼徑（0.295）和K7-9（0.370）。各形態(tài)參數(shù)間相關性最大的為全長與體長（0.974），體長與K3-4（0.956）次之，相關性系數(shù)最小的為K4-7與K7-9（-0.170）。

2.1.2 " 形態(tài)性狀與純重的多元線性回歸 " 與魚體純重相關性顯著的表型設置為自變量、純重設置為因變量，在SPSS軟件中使用“步進”方法進行多元線性回歸方程的構(gòu)建。此方法剔除了共線性不顯著的變量，并進行模型優(yōu)化，結(jié)果如表5所示。在自變量個數(shù)從1增加到3的過程中，多元回歸方程的相關系數(shù)從0.945增加到了0.983，與此同時估計標準誤差也從1.622減小到了0.969，模型的優(yōu)化使所得方程更加具有準確性。

進一步對此回歸方程進行方差分析，結(jié)果如表6所示，組間均方與組內(nèi)均方比值F=177.701顯著大于Fa（3，19）=3.13（明道緒，2002），P=0.000lt;0.01，均表明回歸方程達到極顯著水平。同時，殘差的均方較?。?.890），也說明回歸方程具有較好的預測檢驗效果。自變量的回歸系數(shù)結(jié)果如表7所示，優(yōu)化后的方程保留了3個自變量，即X1（全長）、X14（K3-4）和X21（K6-7）。這3個自變量的回歸系數(shù)對模型的擬合均達到了極顯著水平（Plt;0.01），且方差膨脹因子（VIF）均小于10，表明變量間不存在多重共線性。由此建立三元回歸方程為：

Y=-39.395+3.561X1+5.563X14-7.698X21 " " " "①

上式可通過全長、枕骨后末端至腹鰭起點距離、臀鰭起點至背鰭基部末端距離來推算魚體純重。

2.1.3 " 形態(tài)性狀對純重的通徑分析 " 經(jīng)通徑分析，可將3個性狀對北極茴魚純重的影響劃分為直接作用和間接作用。由表8可知，在這3個性狀中，全長對魚體純重的直接作用最大（0.874），且均大于其間接作用，即全長對北極茴魚純重的直接作用最明顯。從間接通徑系數(shù)來看，最大值為K3-4通過全長對魚體純重產(chǎn)生的間接作用（0.822），其次是K6-7通過全長對魚體純重產(chǎn)生的間接作用（0.735）。其中K6-7對魚體純重的直接作用雖為負值（-0.497），但其通過全長、K3-4對魚體純重產(chǎn)生的間接作用之和為1.178，因此認為K6-7對北極茴魚純重也起到正向作用。

將直接作用和間接作用整合分析，即推算各形態(tài)性狀對北極茴魚純重的決定系數(shù)，結(jié)果如表9所示。3個性狀中，單獨決定系數(shù)最大的為全長（0.764），K3-4（0.270）和K6-7（0.247）次之。全長和K3-4的共同決定系數(shù)最大（0.853），這表明全長和K3-4的共同作用對魚體純重的決定程度最大。除此之外，K6-7分別和全長、K3-4的共同決定系數(shù)均為負值，表明其對魚體純重的共同作用均為負效應。全長、K3-4和K6-7對魚體純重的總決定系數(shù)為0.966，由此得出剩余決定系數(shù)為0.034，剩余因子為0.184。剩余因子表明，除以上3個性狀外，其他因子對北極茴魚純重的影響均較小。

2.2 " 系統(tǒng)發(fā)育

2.2.1 " 茴魚屬魚類線粒體COI基因序列 " 將測定得到的93尾北極茴魚COI序列中占比最高的2種單倍型（BJH-COI1、BJH-COI2），與下載的32尾茴魚屬魚類同源序列比對和剪切后，得到長度為538 bp的34條COI基因序列。4種核苷酸的平均含量分別為T（31.7%）、C（27.6%）、A（22.2%）、G（18.5%），且A+T含量（53.9%）高于C+G含量（46.1%）。本研究中北極茴魚2條單倍型序列，密碼子第1位點T含量低G含量高，第2位點T含量高G含量低，第3位點各堿基含量差別較小。編碼的氨基酸平均含量最高為亮氨酸Leu（15.64%）、其次為丙氨酸Ala（10.60%），賴氨酸Lys（0.56%）含量最低，未檢測到編碼半胱氨酸Cys的密碼子。

34條茴魚屬魚類COI基因序列中發(fā)現(xiàn)85個變異位點，如圖3所示，占總數(shù)的15.80%，其中有64個為簡約信息位點。從中得到26種單倍型，單倍型多樣性（Hd）為0.984，核苷酸多樣性（Pi）為0.0386，平均核苷酸差異（k）為20.7718，顯示出較高的遺傳多樣性水平。

2.2.2 " 北極茴魚系統(tǒng)發(fā)育分析 " 在NJ系統(tǒng)發(fā)育樹中，北美茴魚（Clade I）、歐洲茴魚（Clade II）、黑龍江茴魚（Clade III）都各自形成了完整的進化枝（圖4）。歐洲地區(qū)與亞洲東北部的茴魚類群得到有效區(qū)分，歐洲茴魚與艾利安茴魚以及盧瓦爾茴魚形成一個進化枝，北美地區(qū)的茴魚也能單獨聚到一起。北極茴魚形成2種不同分支（Clade A和Clade B），一部分與短頭茴魚、蒙古茴魚相聚，另一部分與貝加爾茴魚、暗茴魚相聚。而黑龍江流域的茴魚（T. grubii、T. tugarinae、T. yaluensis、T. grubii flavomaculatus）則與其他茴魚屬魚類明顯分隔開，聚到了系統(tǒng)樹的最外層，其中鴨綠江茴魚與黃斑茴魚構(gòu)成一支，而下游黑龍江茴魚與黑龍江茴魚聚成另一支。

3 " 討論

體重為評估魚類生長狀況的重要指標之一，但在實際測量過程中易受到其他因素干擾，因此，去除內(nèi)臟組織后的純重更能真實反映評估結(jié)果的準確性。本研究測定了31個形態(tài)性狀特征值，分析了它們與純重之間的通徑關系，優(yōu)化了對北極茴魚生長狀況的評估。研究結(jié)果顯示，與北極茴魚純重相關性最高的5個形態(tài)性狀依次為：全長、體長、K5-6、K3-4、K4-6。許多魚類的形態(tài)性狀與體重的相關性研究中，全長和體長往往能得到與體重最高的相關性系數(shù)，在這一點上，北極茴魚的研究結(jié)果與大菱鲆（王新安等，2008）、牙鲆（王等，2008）以及小黃魚（劉峰等，2016）相似。與以往研究的不同之處在于，本研究引入了形態(tài)框架數(shù)據(jù)的分析，共計31個變量的數(shù)據(jù)支撐使得形態(tài)性狀的分析更為全面，但也導致北極茴魚其余的傳統(tǒng)形態(tài)性狀與純重的相關性并不高。此外，本研究中還有6個形態(tài)性狀與純重的相關性不顯著，推測由分析的樣本數(shù)量略少及魚體生長狀況不均勻所致。

在形態(tài)性狀與魚體純重相關性分析的基礎上，當自變量的總決定系數(shù)大于0.850時，才具有進一步通徑分析的意義（王新安等，2013）。本研究剔除了與魚體純重存在極高相關性的體長、頭長、體高等數(shù)據(jù)，因這3者與全長存在極顯著的共線關系，故以全長取代之。全長、枕骨后末端至腹鰭起點距離、臀鰭起點至背鰭基部末端距離對魚體純重的總決定系數(shù)達到0.966，即這3個形態(tài)性狀決定了對北極茴魚純重貢獻度的96.6%。而在這3個形態(tài)性狀中，全長對魚體純重的直接作用和決定系數(shù)之和均最大，且遠超其他2個性狀之和，表明全長是3個形態(tài)性狀中的主要決定因子，應作為評估北極茴魚純重的重要生長指標，與佟廣香等（2011）對于同屬鮭科魚類哲羅鮭的研究結(jié)果相似。從谷偉等（2013）對不同性別虹鱒形態(tài)性狀對體重的影響效果分析可知，鮭科魚類的雌雄差異在通徑分析過程中有一定影響。由于本研究中魚類樣本尚未性成熟，故難以區(qū)分個體性別，使得結(jié)論存在相應的局限性，有待于今后在繁殖季節(jié)采集性成熟樣本進一步研究探討。

本研究中涉及的34條茴魚屬魚類線粒體COI基因序列堿基組成體現(xiàn)出高A+T含量、低C+G含量的特點，且編碼氨基酸中亮氨酸（Leu）含量最高、賴氨酸（Lys）含量最低，不含半胱氨酸（Cys），符合大多數(shù)鮭科魚類COI基因中堿基和氨基酸的組成特點（孟瑋等，2010）。遺傳多樣性是生物多樣性的基礎，而評估遺傳多樣性最重要的指標包括單倍型多樣性和核苷酸多樣性（沈浩和劉登義，2001）。本研究中，19種茴魚屬魚類COI序列單倍型多樣性和核苷酸多樣性分別為0.984和0.0386，相較于其他淡水魚類，如黃鱔Monopterus albus（Hd=0.907，Pi=0.0172）（胡玉婷等，2016）、花?Hemibarbus maculatus（Hd=0.982，Pi=0.0087）（鮑戰(zhàn)猛，2014）、細鱗鲴Xenocypris microlepis（Hd=0.129～0.500，Pi=0.0002～0.0019）（曲憲成等，2011）、大刺鰍Mastacembelus armatus（Hd=0.768，Pi=0.0058）（江小璐，2018）等，都表現(xiàn)出較高的遺傳多樣性水平。

從NJ系統(tǒng)發(fā)育樹的拓撲結(jié)構(gòu)來看，歐洲地區(qū)與亞洲東北部的茴魚類群按照地域分布得到有效區(qū)分；而黑龍江流域的茴魚（Clade III）與其他所有茴魚屬魚類分隔開，位于進化樹的根部，是最早進化出來的類群，支持茴魚屬魚類可能起源于黑龍江流域的猜想（Weiss et al，2020a）。短頭茴魚與北極茴魚首先相聚，再與蒙古茴魚聚類，體現(xiàn)出前兩者較近的親緣關系，與Weiss等（2020b）的研究中短頭茴魚與蒙古茴魚互為姐妹群的結(jié)論不符，可能與所選擇的基因片段不同有關。有研究表明，分布于同一水系的茴魚屬魚類，因支流眾多導致地理隔離，即使是同一個種或亞種，群體間也會產(chǎn)生較大的遺傳分化（張艷珍等，2020）。本研究中，來自不同水域的北極茴魚形成了不同的進化枝，暗示該魚類或許存在2個獨立的進化單元。此外，北美茴魚雖然構(gòu)成完整的進化枝，但作為北極茴魚的一個亞種，北美茴魚與新疆北極茴魚的聚類關系較遠，與傳統(tǒng)分類地位相沖突。

4 " 結(jié)論

本研究采用傳統(tǒng)形態(tài)學和框架度量學數(shù)據(jù)相結(jié)合的方式，對分布于我國新疆額爾齊斯河流域的北極茴魚31個表型性狀間的相關系數(shù)，采用通徑分析篩選出顯著影響魚體純重的形態(tài)性狀，并通過多元回歸分析構(gòu)建形態(tài)性狀與純重間的多元回歸方程，探討形態(tài)性狀對純重的影響。結(jié)果顯示，全長對魚體純重的直接作用最大，可作為輔助選育的首選目標性狀?；诰€粒體COI基因序列的系統(tǒng)進化關系顯示北極茴魚存在不同的進化單元，新疆北極茴魚與短頭茴魚和蒙古茴魚親緣關系較近。研究結(jié)果為進一步查明該魚類系統(tǒng)進化地位和與近緣種間的遺傳關系提供了參考。

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（責任編輯 " 熊美華）

Path Analysis of Morphometry and Net Body Weight of Thymallus arcticus

in Erqis River in Xinjiang and Its Phylogenetic Relationships

MAO Qin1， ZHONG Xin2， SHAN Yang2， WANG Si‐ge1， ZHU Zi‐yan1， GUO Yan3， YANG Tian‐yan1

（1. Fishery College Zhejiang Ocean University， Zhoushan " 316022， P.R. China;

2. Xinjiang Erqis River Basin Development Construction Management Bureau， Urumqi " 830099， P.R. China;

3. Xinjing Fisheries Research Institute， Urumqi " 830000， P.R. China）

Abstract： Thymallus arcticus， belonging to Thymallus， Salmonidae， and Salmoniforme， prefers the cold， clean open waters of medium to large lakes and rivers， and serves as an important target species for research on the water ecological environment. In China， T. arcticus primarily inhabits the Erqis River and Heilongjiang River basins. In this study， T. arcticus from Erqis River was selected for study， and a total of 93 T. arcticus specimens were obtained from Erqis River in Xinjiang during November and December of 2019. First， we characterized the relationship of 31 morphological parameters of T. arcticus （8 traditional morphological parameters and 23 frame structure measurements） with its net body weight in Erqis River by path coefficient analysis. Then， the mitochondrial DNA COI gene sequences of the samples were amplified by PCR technology and the phylogenic relationship of T. arcticus with closely related species within the same genus was explored based on related COI gene sequences downloaded from the GenBank database. The aim of the study was to provide a reference for clarifying the taxonomic status， formulating conservation and management plans for resources， as well as carrying out stock enhancement programs of T. arcticus in Xinjiang. Results show that the correlation coefficients of 31 phenotypic traits with the net body weight of T. arcticus were in the range of 0.278-0.945， and 23 phenotypic traits showed extremely significant correlation with the net body weight. Among the 23 phenotypic traits， the total length （X1）， the distance from the posterior end of the occipital bone to the origin of the pelvic fin （X14）， and the distance from the origin of the anal fin to the base end of the dorsal fin （X21）， had the greatest impacts on the net body weight of T. arcticus， and could be used as the optimal phenotypes for assisted breeding. A total of 26 haplotypes were obtained from 34 COI gene sequences of Thymallus species with the length of 538 bp. The haplotype diversity （Hd） was 0.984， the nucleotide diversity （Pi） was 0.0386， and the average nucleotide difference （k） was 20.7718， indicating a high level of genetic diversity. The phylogenetic tree constructed based on the COI gene sequences of genus Thymallus and by neighbor-joining method showed that T. grubii， T. thymallus and T. arcticus arcticus formed separated clades， and there could be different evolutionary units for T. arcticus. The T. arcticus in Xinjiang was closely related to the T. brevicephalus and T. brevirostris.

Key words：Thymallus arcticus; morphometric characteristics; path coefficient analysis; COI gene; phylogenetics; Erqis "River