摘 要：目的 利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測(cè)L-茶氨酸調(diào)節(jié)細(xì)胞因子分泌的可能機(jī)制。方法 Swiss Target Prediction和TargetNet數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)L-茶氨酸的作用靶點(diǎn)，GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)、TTD數(shù)據(jù)庫(kù)和OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)免疫細(xì)胞因子分泌相關(guān)靶點(diǎn)，在線工具Venny 2.1求兩者的交集靶點(diǎn)，對(duì)交集靶點(diǎn)進(jìn)行PPI分析以及GO富集分析和KEGG富集分析。結(jié)果 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果顯示，L-茶氨酸和免疫細(xì)胞因子分泌之間的共同靶點(diǎn)81個(gè)。其中，IL-1B、TLR4、NFκB1、MMP9、EGFR、JUN等核心靶點(diǎn)可能參與了L-茶氨酸的作用。KEGG富集分析進(jìn)一步表明，L-茶氨酸的作用可能與雌激素信號(hào)通路、松弛素信號(hào)通路、cAMP信號(hào)通路和cGMP-PKG信號(hào)通路有關(guān)。結(jié)論 L-茶氨酸調(diào)節(jié)細(xì)胞因子分泌的機(jī)制可能與L-茶氨酸作用于IL-1B、TLR4、NFκB1、MMP9、EGFR、JUN等靶點(diǎn)進(jìn)而調(diào)節(jié)雌激素信號(hào)通路、松弛素信號(hào)通路、cAMP信號(hào)通路和cGMP-PKG信號(hào)通路有關(guān)。

關(guān)鍵詞：L-茶氨酸；細(xì)胞因子分泌；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；免疫調(diào)節(jié)；信號(hào)通路

中圖分類號(hào)：R392.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

收稿日期：2024-01-07

基金項(xiàng)目：湖南省自然科學(xué)基金（2022JJ50026）

作者簡(jiǎn)介：李成艦，男，教授，博士，主要從事藥用植物功能成分研究；E-mail：413874272@qq.com

通信作者：于旭東，男，講師，博士研究生，主要從事藥用植物功能成分研究；E-mail：yxd_neuro@163.com

Research on the mechanism of L-theanine regulating lymphocyte cytokine secretion based on network pharmacology

LI Chengjian1，2， OUYANG Xiang2， HUANG Chunhua2， ZHAO Jincheng1，2， YU Xudong2

（1. School of Pharmacy， Shaoyang University， Shaoyang 422000， China; 2. Hunan Engineering Research Center of Development and Utilization of Traditional Chinese Medicine in Southwest Hunan， Shaoyang 422000， China）

Abstract： Objective The potential mechanism of L-theanine in regulating cytokine secretion was predicted using network pharmacology methods. Methods The Swiss Target Prediction and TargetNet databases were utilized to predict the targets of L-theanine， while the GeneCards， TTD， and OMIM databases were used to predict targets related to immune cytokine secretion. Finally， the online tool Venny 2.1 was employed to identify their intersection， which was then subjected to PPI analysis， GO enrichment analysis， and KEGG enrichment analysis. Results The network pharmacology results revealed 81 common targets of L-theanine and immune cytokine secretion. Among these， core targets such as IL-1B， TLR4， NFκB1， MMP9， EGFR， and JUN may be involved in the action of L-theanine. KEGG enrichment analysis further suggested that the effects of L-theanine may be associated with the estrogen signaling pathway， relaxin signaling pathway， cAMP signaling pathway， and cGMP-PKG signaling pathway. Conclusion The mechanism by which L-theanine regulates cytokine secretion may be related to its action on targets such as IL-1B， TLR4， NFκB1， MMP9， EGFR， and JUN， thereby modulating the estrogen， relaxin， cAMP， and cGMP-PKG signaling pathways.

Key words： L-theanine; cytokine secretion; network pharmacology; immune regulation; signaling pathway

李成艦，歐陽(yáng)香，黃春花，趙金誠(chéng)，于旭東：基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的L-茶氨酸調(diào)節(jié)細(xì)胞因子分泌機(jī)制研究

L-茶氨酸是茶葉特征性功能成分， 作為一種非蛋白衍生氨基酸可通過(guò)血液循環(huán)作用于各種組織和器官，并穿透血腦屏障作用于大腦，從而調(diào)節(jié)身體功能。據(jù)報(bào)道，L-茶氨酸具有多種健康益處，如抗氧化［1］、抗炎［2］、神經(jīng)保護(hù)［3］、抗焦慮［4］、抗癌［5］、抗肥胖［6］、代謝調(diào)節(jié)［7］、心血管保護(hù)［8］、肝臟和腎臟保護(hù)［9］、免疫調(diào)節(jié)［10-11］等。

研究表明，L-茶氨酸具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力的功能，但其分子機(jī)制尚未完全清楚［10］。因此，本研究旨在利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法進(jìn)一步探討L-茶氨酸影響細(xì)胞因子分泌發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的機(jī)制。

1 材料方法

1.1 L-茶氨酸和免疫細(xì)胞因子分泌的靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

使用PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）搜索L-theanine的規(guī)范SMILES字符串的結(jié)構(gòu)，將這些字符串導(dǎo)入Swiss Target Prediction 平臺(tái)（http：//www.swisstarget prediction.ch/index.php）BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/index.php）Super-PRED數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//prediction.charite.de/）和TargetNet數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//targetnet. scbdd.com /calcnet/index/）以預(yù)測(cè)其靶點(diǎn)。輸入關(guān)鍵詞“Immune cytokine secretion”，進(jìn)入GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.genecards.org/）（relevance score gt;1）TTD數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//db.idrblab.org/ttd/）和OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//omim.org/）對(duì)免疫細(xì)胞因子分泌相關(guān)基因（“Homo sapiens”）進(jìn)行篩選。

1.2 韋恩圖與蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)圖

通過(guò)在線工具Venny 2.1 （https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）確定并可視化 L-theanine和immune cytokine secretion之間的共同靶點(diǎn)。隨后，將共同靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape軟件（版本3.7.2，https：//cytoscape.org/）中構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖。

1.3 GO富集分析與KEGG富集分析

將共同靶點(diǎn)導(dǎo)入R Studio軟件（https：//www.rstudio.com/）和“clusterProfiler”R軟件（https：//bioconductor.org/packages/release/bioc/html/clusterProfiler.html）中，以注釋GO富集和KEGG富集。通過(guò)GO和KEGG富集分析確定相關(guān)的生物學(xué)過(guò)程和信號(hào)通路。以Plt;0.05為富集分析的篩選閾值。將生物過(guò)程、功能和細(xì)胞成分中的前10個(gè)GO富集條目和前20個(gè)KEGG信號(hào)通路導(dǎo)入R Studio軟件并進(jìn)行可視化處理。

2 結(jié)果

2.1 預(yù)測(cè)L-茶氨酸和免疫細(xì)胞因子分泌的靶點(diǎn)

當(dāng)前結(jié)果預(yù)測(cè)了L-茶氨酸和免疫細(xì)胞因子分泌的靶點(diǎn)，其中L-茶氨酸在Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得32個(gè)靶點(diǎn)，在BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得386個(gè)靶點(diǎn)，在Super-PRED數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得72個(gè)靶點(diǎn)，在TargetNet數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得126個(gè)靶點(diǎn)。去除重復(fù)靶點(diǎn)后，最終L-茶氨酸靶點(diǎn)數(shù)量為576個(gè)。此外，在GenecCards數(shù)據(jù)庫(kù)和OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)中分別獲得免疫細(xì)胞因子分泌的靶點(diǎn)1 202個(gè)和481個(gè)，去除重復(fù)靶點(diǎn)后，最終免疫細(xì)胞因子分泌靶點(diǎn)數(shù)量為1 629個(gè)。

2.2 韋恩圖與蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

如圖1A所示，韋恩圖顯示了L-茶氨酸和免疫細(xì)胞因子分泌之間的81個(gè)共同靶點(diǎn)。如圖1B所示， PPI圖顯示了78個(gè)節(jié)點(diǎn)及其交互作用。在此網(wǎng)絡(luò)中，節(jié)點(diǎn)代表相關(guān)基因，節(jié)點(diǎn)的大小和顏色代表Degree的值。選擇Degree值≥40的蛋白作為重要靶點(diǎn)，包括白細(xì)胞介素-1B（IL-1B）、Toll 樣受體 4（TLR4）、核因子 kappa B（NFκB1）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP9）、表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）和Jun 原癌基因（JUN），這些靶點(diǎn)可能在L-茶氨酸影響免疫細(xì)胞因子分泌中發(fā)揮重要作用。

2.3 GO富集分析

GO富集共獲得1 503項(xiàng)，其中生物過(guò)程1 316項(xiàng)，細(xì)胞組分65項(xiàng)，分子功能122項(xiàng)。BP、CC、MF的前10項(xiàng)可視化后見(jiàn)圖2。結(jié)果顯示，L-茶氨酸對(duì)細(xì)胞因子分泌的調(diào)節(jié)作用主要與肽鏈內(nèi)切酶活性、絲氨酸型肽酶活性、絲氨酸水解酶活性和絲氨酸型內(nèi)肽酶活性等分子功能有關(guān)，并且與膜筏、膜微區(qū)、質(zhì)膜的外側(cè)以及囊腔等細(xì)胞組分有關(guān)。此外，L-茶氨酸對(duì)細(xì)胞因子分泌的調(diào)節(jié)作用還與對(duì)肽激素的反應(yīng)、對(duì)肽的反應(yīng)、對(duì)脂多糖的反應(yīng)、對(duì)細(xì)菌分子的反應(yīng)以及對(duì)缺氧的反應(yīng)等生物過(guò)程有關(guān)。這些富集項(xiàng)與細(xì)胞因子分泌和炎癥反應(yīng)過(guò)程密切相關(guān)，可能參與L-茶氨酸對(duì)細(xì)胞因子分泌的調(diào)節(jié)作用。

2.4 KEGG富集分析

KEGG富集共獲得信號(hào)通路1 503項(xiàng)，其中前20項(xiàng)可視化后見(jiàn)圖3。在這些信號(hào)通路中，雌激素信號(hào)通路、松弛素信號(hào)通路、cAMP信號(hào)通路和cGMP-PKG信號(hào)通路與炎癥密切相關(guān)并參與細(xì)胞因子分泌的調(diào)節(jié)，可能參與L-茶氨酸對(duì)細(xì)胞因子分泌的調(diào)節(jié)作用。

3 討論

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法預(yù)測(cè)了L-茶氨酸處理調(diào)節(jié)細(xì)胞因子分泌的機(jī)制。其中，PPI結(jié)果顯示，IL-1B、TLR4、NFκB1、MMP9、EGFR、JUN等核心靶點(diǎn)可能參與了L-茶氨酸的作用。KEGG富集分析進(jìn)一步表明，L-茶氨酸的作用可能與雌激素信號(hào)通路、松弛素信號(hào)通路、cAMP信號(hào)通路和cGMP-PKG信號(hào)通路有關(guān)。

L-茶氨酸具有免疫調(diào)節(jié)作用［10-11］。有研究表明，L-茶氨酸可通過(guò)減輕機(jī)體氧化應(yīng)激損傷、下調(diào)機(jī)體促炎因子來(lái)減輕肝損傷［12］。L-茶氨酸處理可降低大腸桿菌E44813感染引起的小鼠血清TNF-α、IFN-γ表達(dá)及肝組織IFN-γ、TNF-α mRNA的表達(dá)［13］。此外，L-茶氨酸可降低抑郁大鼠血清、結(jié)腸和盲腸炎癥因子如TNF-α的表達(dá)水平［14］。L-茶氨酸調(diào)節(jié)細(xì)胞因子分泌的機(jī)制尚不清楚。為了闡明其可能的機(jī)制，本文利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)進(jìn)行了預(yù)測(cè)。PPI分析顯示，IL-1B、TLR4、NFκB1、MMP9、EGFR、JUN是L-茶氨酸發(fā)揮作用的核心靶點(diǎn)。其中，IL-1B是一種關(guān)鍵的促炎細(xì)胞因子，屬于IL-1型細(xì)胞因子家族，在炎癥發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用［15］。TLR4是LPS和HMGB1的作用受體，兩者與TLR4結(jié)合發(fā)揮促炎作用；NFκB1、MMP9、EGFR和JUN在細(xì)胞因子分泌及炎癥反應(yīng)發(fā)揮重要作用［16］。L-茶氨酸可能通過(guò)調(diào)節(jié)這些靶點(diǎn)從而調(diào)節(jié)細(xì)胞因子分泌，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。

KEGG富集分析表明，L-茶氨酸的作用可能與雌激素信號(hào)通路、松弛素信號(hào)通路、cAMP信號(hào)通路和cGMP-PKG信號(hào)通路有關(guān)，這些信號(hào)通路均參與細(xì)胞因子分泌及炎癥的發(fā)生發(fā)展。其中雌激素受體信號(hào)激活可抑制NFκB和TLR4的激活，從而抑制促炎細(xì)胞因子的分泌和促進(jìn)抑炎細(xì)胞因子的分泌［17-18］。此外，激活松弛素信號(hào)通路、cAMP信號(hào)通路以及cGMP-PKG信號(hào)通路可抑制NFκB的激活發(fā)揮抗炎作用［19-21］。 有研究表明，L-茶氨酸影響脾淋巴細(xì)胞中甲戊酸生物合成途徑，可能導(dǎo)致異戊烯焦磷酸的過(guò)度產(chǎn)生，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的分泌［11］。本研究提出雌激素信號(hào)通路、松弛素信號(hào)通路、cAMP信號(hào)通路和cGMP-PKG信號(hào)通路可能是L-茶氨酸調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的分泌的途徑，對(duì)進(jìn)一步了解L-茶氨酸藥理作用有指導(dǎo)意義。

綜上所述，L-茶氨酸調(diào)節(jié)細(xì)胞因子分泌的機(jī)制可能與其作用于IL-1B、TLR4、NFκB1、MMP9、EGFR、JUN等靶點(diǎn)進(jìn)而調(diào)節(jié)雌激素信號(hào)、松弛素信號(hào)路、cAMP信號(hào)和cGMP-PKG信號(hào)通路有關(guān)。

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