幸紅霞 姚倩 張雨鋮 廖俊米 董娟 余沁 郭曉強(qiáng)

摘要：目的 考察二氧化氯對(duì)桃褐腐病主要致病菌褐腐菌（Monilinia fructicola）、酵母菌（Kazachstania exigua）以及大腸埃希菌（Escherichia coli）的抑制效果。方法 以褐腐菌、酵母菌、大腸埃希菌為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，采用固體培養(yǎng)法測(cè)定菌斑直徑和細(xì)菌存活率；測(cè)定胞外培養(yǎng)液電導(dǎo)率，蛋白質(zhì)和DNA含量，檢測(cè)胞內(nèi)丙二醛濃度和脫氫酶活性，并采用掃描電鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。結(jié)果 隨著二氧化氯濃度升高，菌斑直徑和細(xì)菌存活率逐漸降低，胞外培養(yǎng)液電導(dǎo)率、蛋白質(zhì)、DNA含量和胞內(nèi)丙二醛含量增加，脫氫酶活性顯著下降；二氧化氯對(duì)褐腐菌的抑菌效果顯著高于酵母菌和大腸埃希菌（P＜0.05）。電鏡掃描下可見細(xì)菌細(xì)胞膜邊界模糊，有明顯滲出液。結(jié)論 二氧化氯能有效抑制褐腐菌的生長(zhǎng)，其機(jī)制與破壞細(xì)菌細(xì)胞膜，使細(xì)菌代謝酶失活有關(guān)。

關(guān)鍵詞：二氧化氯；褐腐菌；酵母菌；大腸埃希菌；抑菌機(jī)制

中圖分類號(hào)：R978.1 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Antibacterial effects of chlorine dioxide on Monilinia fructicola， yeast and Escherichia coli

Xing Hongxia1， Yao Qian2， Zhang Yucheng2， Liao Junmi3， Dong Juan3， Yu Qin2， and Guo Xiaoqiang2

（1 School of Food and Biological Engineering， Chengdu University， Chengdu 610106; 2 School of Pharmacy， Chengdu University， Chengdu 610106; 3 Sichuan Shuangjinduotai Biotechnology Co.， LTD， Chengdu 610100）

Abstract Objective To study the inhibitory effect of ClO2 on Monilinia fructicola ， the primary pathogen of peaches， as well as yeast （Kazachstania exigua） and Escherichia coli （E. coli）. Methods The plaque diameter and bacterial survival rate of Monilinia fructicola， yeast， and E. coli were measured using the solid culture method. The conductivity， protein， and DNA content of the extracellular culture medium， as well as the intracellular malondialdehyde content and dehydrogenase activity， were all tested using the same approach. Finally， scanning electron microscopy was applied to observe the bacterial morphology. Results The plaque diameter and bacterial survival rate gradually reduced as ClO2 concentration increased. However， extracellular conductivity， protein and DNA content as well as intracellular malondialdehyde content increased， while dehydrogenase activity declined dramatically. The inhibitory effect of ClO2 on Monilinia fructicola was notably stronger than that on yeast and E coli （P＜0.05）. The blurred boundary of bacterial cell membrane with visible intracellular effusion were observed under SEM. Conclusion The antibacterial mechanisms are associated with the impairment of cell membrane and inactivation of bacterial metabolic enzymes.

Key words Chlorine dioxide; Monilinia fructicola; Yeast; E. coli; Antibacterial mechanism

二氧化氯是一種新型的空氣消毒劑，具有適用面廣、使用劑量低、滅菌率高、持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)、無(wú)毒副作用及對(duì)環(huán)境無(wú)污染等優(yōu)點(diǎn)，己被世界衛(wèi)生組織列為A1級(jí)安全高效的綠色消毒劑[1]，被公認(rèn)為食品除臭和消毒最突出和最有效的化學(xué)品之一。二氧化氯對(duì)飲用水、水果和蔬菜進(jìn)行消毒處理時(shí)通常采用水溶液或者氣體形式[2]；研究表明，二氧化氯氣體處理后殘留的氯氣比其水溶液形式少，且表面的滲透速度也更快[3]。成都龍泉山脈區(qū)域是全國(guó)重要的水蜜桃生產(chǎn)基地之一，有“天下第一桃”的美譽(yù)[4]。桃的軟組織和薄果皮在采后貯藏期間易受到真菌感染引起疾病，褐腐菌是桃果實(shí)采后軟腐病的主要致病菌[5]，由褐腐菌引起的褐腐病是桃收獲后最具破壞性的病害[6]，在貯藏、運(yùn)輸、銷售及消費(fèi)過程中極易發(fā)生，使果實(shí)迅速腐敗，導(dǎo)致無(wú)法食用，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[7]。大腸埃希菌是食品主要污染源之一，食用后易引起腹瀉、嘔吐等消化道癥狀。酵母菌可利用果皮表面和傷口處的營(yíng)養(yǎng)迅速大量繁殖，從而消耗傷口處營(yíng)養(yǎng)且布滿整個(gè)傷口表面[8]。細(xì)菌加速了桃的腐爛變質(zhì)，不利于貯藏和運(yùn)輸。目前，桃果實(shí)采后主要依賴于化學(xué)殺菌劑防治微生物污染，但殺菌劑的過度使用會(huì)造成環(huán)境污染、對(duì)人體健康有一定的危害，為減少環(huán)境污染和滿足消費(fèi)者對(duì)安全食品日益增長(zhǎng)的需求，尋找新的褐腐菌防治方法迫在眉睫[9]。本文選擇水蜜桃貯存和運(yùn)輸過程中常見的3種菌-褐腐菌、酵母菌和大腸埃希菌，采用固體反接培養(yǎng)方法考察二氧化氯對(duì)3種菌的抑制作用，以期更好地模擬果蔬貯藏的實(shí)際狀況，找到高效低毒的水蜜桃保鮮策略，為延長(zhǎng)水蜜桃貨架期、提高水蜜桃營(yíng)養(yǎng)價(jià)值提供有益指導(dǎo)。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

大腸埃希菌BNCC336902（Escherichia coli）、酵母菌JC2636（Kazachstania exigua）均由成都大學(xué)四川省生物醫(yī)藥基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 試劑

丙二醛（malondialdehyde，MDA，AR，純度≥98%，廣東翁江化學(xué)試劑有限公司）；營(yíng)養(yǎng)瓊脂和LB肉湯購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司；硫代巴比妥酸、乙酸異戊酯和2， 3， 5－三苯基氯化四氮唑（2， 3， 5-triphenyl tetrazolium chloride，TTC）購(gòu)自上海泰坦科技股份有限責(zé)任公司；二氧化氯（AR，含量10%）由四川金科藥業(yè)有限公司提供。

1.3 儀器

UV5100B紫外可見分光光度計(jì)（上海元析儀器有限公司），F(xiàn)E30臺(tái)式電導(dǎo)儀（梅特勒-托力多儀器有限公司），SPX-250生化培養(yǎng)箱（常州邁科諾儀器有限公司），CT14D高速冷凍離心機(jī)（上海天美生化儀器設(shè)備工程有限公司），Quanta 200掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope， SEM，美國(guó)FEI儀器有限公司）。

2 方法

2.1 褐腐菌的分離與復(fù)蘇

2.1.1 褐腐菌的分離

在龍泉水蜜桃病果上挑取少量腐爛部分，用無(wú)菌水連續(xù)稀釋，0.1 mL稀釋液置于PDA滅菌固體培養(yǎng)基，涂布均勻，25 ℃培養(yǎng)1 d，根據(jù)菌落形態(tài)挑選單個(gè)菌落，轉(zhuǎn)移至新的滅菌培養(yǎng)基中培養(yǎng)，重復(fù)3次。經(jīng)形態(tài)學(xué)和PCR驗(yàn)證[10]，鑒定為褐腐菌。菌株置于PDA斜面上，4 ℃低溫保存。

2.1.2 菌種復(fù)蘇與生長(zhǎng)

用接種環(huán)挑取褐腐菌、酵母菌、大腸埃希菌，分別接種于100 mL LB滅菌液體培養(yǎng)基中，分別在

25 ℃、28 ℃和37 ℃下以100 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。調(diào)整其濃度為106 CFU/mL，吸取50 μL菌懸液置于PDA平板中央，涂布均勻，將培養(yǎng)皿分別置于25 ℃、

28 ℃和37 ℃下培養(yǎng)1 d備用[11]。

2.2 反接培養(yǎng)法

參照文獻(xiàn)[11]的方法并稍作改進(jìn)。將滅菌的PDA培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，冷卻備用，無(wú)菌打孔器（6 mm）取“2.1.2”項(xiàng)下含菌培養(yǎng)基，制得菌餅，將其反接于PDA平板中央；精確稱量二氧化氯固體，分別用蒸餾水配置成0.0125、0.025、0.05和0.1 mmol/L的二氧化氯溶液10 mL，將10 mL二氧化氯溶液倒入50 mL燒杯中；將燒杯和培養(yǎng)皿（加蓋）放置于10 L塑料盒中，將塑料盒分別置于25 ℃、28 ℃和37 ℃下培養(yǎng)16 h。取出培養(yǎng)皿，繼續(xù)培養(yǎng)直至空白組的菌落直徑大于培養(yǎng)皿直徑的2/3，結(jié)束培養(yǎng)。以未經(jīng)二氧化氯處理的菌餅作為空白組。

2.3 抑菌活性測(cè)定

2.3.1 菌落直徑

培養(yǎng)結(jié)束后，用游標(biāo)卡尺采用十字交叉法測(cè)定各組菌斑直徑3次，結(jié)果取平均值。

2.3.2 存活率

菌落培養(yǎng)結(jié)束后，用小刀刮下相同大小的菌斑（直徑約4 cm），置于試管中，用20 mL無(wú)菌PBS分散均勻，于600 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光值，與空白組的吸光度值做比較，按下式計(jì)算存活率lg（Nt/N0）[12]：

lg（Nt/N0）=lg（At/A0）

其中，Nt和N0分別表示二氧化氯處理組和空白組的細(xì)菌數(shù)量，At和A0分別表示二氧化氯處理組和空白組細(xì)菌混懸液的吸光度值。

2.4 抑菌機(jī)制考察

2.4.1 電導(dǎo)率

取“2.3.2”項(xiàng)下培養(yǎng)結(jié)束后的菌斑，用無(wú)菌水分散樣品置于燒杯中，用電導(dǎo)儀測(cè)定電導(dǎo)值記為A1，測(cè)完后將所有樣品沸水浴15 min，冷卻后再次測(cè)其電導(dǎo)值記為A2，參照文獻(xiàn)[13]計(jì)算電導(dǎo)率。

電導(dǎo)率（%）=A1/A2×100

2.4.2 蛋白質(zhì)和DNA

使用PBS沖洗反接處理培養(yǎng)后菌落，12000 r/min

離心30 min；吸取上清液，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定A260和A280，DNA含量用260 nm波長(zhǎng)處的吸光值表示，參照文獻(xiàn)[14]計(jì)算蛋白質(zhì)含量。

蛋白質(zhì)含量/（mg/mL）=1.45×A280 -0.74×A260

2.4.3 MDA測(cè)定

MDA含量測(cè)定參照文獻(xiàn)[15]，并稍作改進(jìn)。取反接菌斑，用PBS分散，隨后吸取1.5 mL，加入3 mL 10%三氯醋酸（w/v），在4 ℃、4500 r/min離心30 min；吸取上清液2 mL，加0.67% 硫代巴比妥酸（w/v）4.5 mL，沸水浴10 min，離心，于532 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光值，根據(jù)MDA標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算含量。

2.4.4 脫氫酶活性測(cè)定

脫氫酶活性測(cè)定參照文獻(xiàn)[15]，并稍作改進(jìn)。取經(jīng)PBS分散的菌液6 mL，加入2 mL Tris-HCl（pH 8.8）溶液，以及2 mL TTC-葡萄糖溶液，37 ℃水浴加熱2 h，分別加入7.5 mL甲苯和冰醋酸溶液，室溫放置1 h后，于485 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光值；以未經(jīng)二氧化氯處理的細(xì)菌作為陰性對(duì)照。

2.5 細(xì)菌形態(tài)觀察

取“2.1.2”項(xiàng)下培養(yǎng)的細(xì)菌，二氧化氯處理16 h，用6 mm無(wú)菌打孔器取菌餅，分散于滅菌蒸餾水中，8000 r/min離心5 min；棄上清液，加入2 mL 2.5%戊二醛（w/v），4℃下放置12 h；然后參照Tao等[16]方法進(jìn)行梯度洗脫，樣品經(jīng)自然干燥后，噴金、上樣，在掃描電鏡下觀察形態(tài)。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

樣品測(cè)定重復(fù)3次，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。使用Origin 2021軟件作圖，SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析[17]，當(dāng)P≤0.05時(shí)，組間有顯著性差異。

3 結(jié)果

3.1 抑菌活性

菌落直徑結(jié)果如表1所示，二氧化氯濃度與菌落直徑呈負(fù)相關(guān)，即濃度越大，菌落直徑越小。采用相同濃度的二氧化氯處理后，褐腐菌的菌落直徑均顯著小于酵母菌和大腸埃希菌，表明二氧化氯對(duì)褐腐菌的殺菌效果最好。細(xì)菌存活率表現(xiàn)了相同的趨勢(shì)，即隨著二氧化氯濃度的升高，細(xì)菌存活率下降，顯示了二氧化氯較強(qiáng)的殺菌作用（圖1）；濃度≥0.025 mmol/L時(shí)褐腐菌的存活率顯著低于酵母菌和大腸埃希菌（P＜0.05），濃度≥0.05 mmol/L時(shí)酵母菌存活率顯著低于大腸埃希菌（P＜0.05）。

3.2 抑菌機(jī)制研究

3.2.1 電導(dǎo)率

電導(dǎo)率測(cè)定結(jié)果如圖2（A）所示，隨著二氧化氯濃度的增加，細(xì)菌培養(yǎng)液的電導(dǎo)率不斷增加；在二氧化氯濃度≤0.0125 mmol/L時(shí)，3種菌株電導(dǎo)率無(wú)顯著性差異；二氧化氯濃度升至0.025 mmol/L，電導(dǎo)率順序?yàn)楹指窘湍妇敬竽c埃希菌。

3.2.2 蛋白質(zhì)含量

培養(yǎng)基中細(xì)菌泄露的蛋白質(zhì)含量測(cè)定結(jié)果如圖2（B）所示，二氧化氯處理后，褐腐菌、酵母菌和大腸埃希菌滲出的蛋白質(zhì)含量與二氧化氯濃度呈正相關(guān)，在多數(shù)濃度下，蛋白質(zhì)含量順序?yàn)楹指窘湍妇敬竽c埃希菌（P＜0.05），褐腐菌胞外蛋白的含量均顯著高于酵母菌和大腸埃希菌。

3.2.3 DNA含量

細(xì)胞外DNA含量測(cè)定結(jié)果如圖2（C）所示，隨著二氧化氯濃度的增加，細(xì)菌胞外DNA含量逐漸增大，當(dāng)二氧化氯濃度至0.025 mmol/L時(shí)，褐腐菌DNA含量急劇增大；二氧化氯濃度達(dá)0.05 mmol/L時(shí)，酵母菌胞外DNA開始迅速上升，而大腸埃希菌的DNA呈現(xiàn)勻速增大趨勢(shì)。二氧化氯濃度為0.05 mmol/L時(shí)，3種細(xì)菌DNA含量順序?yàn)楹指敬竽c埃希菌＞酵母菌（P＜0.05）；當(dāng)氣體濃度增至0.1 mmol/L時(shí)，DNA含量為褐腐菌＞酵母菌＞大腸埃希菌，褐腐菌胞外DNA濃度顯著高于其他兩種細(xì)菌（P＜0.05）。

3.2.4 MDA含量

細(xì)菌MDA含量測(cè)定結(jié)果如圖2（D）所示，隨著二氧化氯濃度增加，細(xì)菌胞內(nèi)MDA含量逐漸增大；在多數(shù)濃度作用下，MDA含量順序?yàn)楹指窘湍妇敬竽c埃希菌，濃度≥0.0125 mmol/L時(shí)褐腐菌胞內(nèi)產(chǎn)生的MDA顯著高于酵母菌和大腸埃希菌（P＜0.05）。

3.2.5 ? ?脫氫酶活性

脫氫酶活性測(cè)定結(jié)果如圖2（E），隨著二氧化氯濃度增加，3種細(xì)菌的脫氫酶活性迅速降低。二氧化氯濃度為0.0125 mmol/L時(shí)，大腸埃希菌的酶活性顯著高于褐腐菌與酵母菌（P＜0.05），表明二氧化氯對(duì)大腸埃希菌酶的破壞作用相對(duì)較弱；二氧化氯濃度增至0.025 mmol/L時(shí)，3種菌株酶活性為大腸埃希菌＞酵母菌＞褐腐菌（P＜0.05）；二氧化氯濃度≥

0.05 mmol/L時(shí)，3種菌株的脫氫酶活性持續(xù)降低，組間均無(wú)顯著性差異（P＞0.05），表明高濃度二氧化氯可使不同細(xì)菌的脫氫酶失活，從而引起細(xì)菌的死亡。

3.3 ? ?細(xì)菌形態(tài)變化

SEM掃描結(jié)果如圖3所示，空白組形態(tài)完整，表面較為光滑，基本沒有褶皺，SEM背景較干凈，說(shuō)明無(wú)內(nèi)容物流出。處理組中3種菌的部分形態(tài)發(fā)生改變，表面干癟粗糙、凹陷，細(xì)胞膜受損，邊界變得模糊，鏡下可見多處團(tuán)聚體和滲出液，其中褐腐菌變形最嚴(yán)重，形態(tài)嚴(yán)重塌陷并有大量滲出液，這與滅活效果一致。

4 討論

大量研究表明，二氧化氯可抑制細(xì)菌、病毒、孢子形成的生物體，具有來(lái)源廣泛、安全性高、毒副作用小和環(huán)境友好等優(yōu)勢(shì)。褐腐菌引起的褐腐病是桃果實(shí)采后的重要侵染性病害，二氧化氯對(duì)褐腐菌的抑菌研究較少。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與酵母菌和大腸埃希菌相比，二氧化氯能較好抑制褐腐菌生長(zhǎng)，原因可能是褐腐菌有菌絲體，二氧化氯能較快進(jìn)入褐腐菌的菌絲細(xì)胞，抑制菌落生長(zhǎng)。Yu等[18]報(bào)道二氧化氯氣體可抑制黃曲霉的菌絲體生長(zhǎng)、孢子萌發(fā)和AFB1產(chǎn)毒能力。

二氧化氯促進(jìn)微生物的死亡機(jī)制被認(rèn)為有以下兩種，一種是由于細(xì)胞表面蛋白質(zhì)巰基的氧化和細(xì)胞膜通透性的增加[19]，另一種是通過影響細(xì)胞內(nèi)部成分，如蛋白質(zhì)和核酸含量，并干擾蛋白質(zhì)的合成[20]。細(xì)菌懸浮液中的電導(dǎo)率可以反映細(xì)胞膜的滲透性改變，如果電解質(zhì)滲漏，表明細(xì)胞膜被破壞，可檢測(cè)到胞外培養(yǎng)液電導(dǎo)率升高[21-22]。二氧化氯處理后3種菌株的電導(dǎo)率增加，說(shuō)明二氧化氯對(duì)細(xì)菌細(xì)胞膜有一定程度的破壞作用，引起細(xì)胞膜內(nèi)電解質(zhì)外滲。二氧化氯處理后3種菌株的胞外蛋白質(zhì)和DNA含量均有所增加，表明二氧化氯處理后細(xì)菌的細(xì)胞膜遭到破壞，使胞內(nèi)物質(zhì)泄露到細(xì)胞外。蛋白質(zhì)和DNA是細(xì)菌維持生命活動(dòng)的物質(zhì)基礎(chǔ)，它與病原菌體內(nèi)的正常生理活動(dòng)和細(xì)胞周期等密切相關(guān)；細(xì)菌胞內(nèi)蛋白質(zhì)和DNA的滲出加速了細(xì)菌的死亡。MDA為細(xì)胞脂質(zhì)膜的氧化產(chǎn)物，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)二氧化氯處理后，3種菌株的MDA含量均明顯增加，同時(shí)表現(xiàn)出了濃度依賴性，即隨著二氧化氯濃度升高，MDA含量增大，說(shuō)明二氧化氯通過氧化脂質(zhì)的形式使細(xì)菌細(xì)胞膜受損。同時(shí)，二氧化氯可抑制細(xì)菌相關(guān)代謝酶活性[20]，TTC法測(cè)定脫氫酶活性可表征細(xì)菌呼吸活性的大??；本實(shí)驗(yàn)顯示，低劑量的二氧化氯能使細(xì)菌脫氫酶活性急劇下降，在高劑量下脫氫酶活性降至40%以下，說(shuō)明二氧化氯對(duì)細(xì)菌代謝酶有強(qiáng)烈的抑制作用，從而引起細(xì)菌的死亡。

通常，二氧化氯對(duì)真菌的抑制作用強(qiáng)于細(xì)菌。在本實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)二氧化氯濃度高于0.025 mmol/L時(shí)，對(duì)酵母菌的抑制率顯著高于大腸埃希菌，但當(dāng)濃度低于0.025 mmol/L時(shí)，二氧化氯對(duì)大腸埃希菌的抑制作用高于酵母菌（圖1），可能的原因?yàn)榈蜐舛鹊亩趸燃纯善茐拇竽c埃希菌細(xì)胞核，使其DNA外溢；而酵母菌的細(xì)胞核在相同濃度作用下?lián)p傷較小，在培養(yǎng)液中僅檢出少量DNA，細(xì)胞核的完整性使酵母菌保持較強(qiáng)的活力（圖2C）。另外，不同真菌對(duì)藥物的敏感性存在差異，比如Pereira等[23]發(fā)現(xiàn)，氯氣對(duì)不同真菌的殺滅作用不一致，與培養(yǎng)真菌的基質(zhì)有較大關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)所用培養(yǎng)基可能對(duì)酵母菌有一定保護(hù)作用，導(dǎo)致其對(duì)低濃度二氧化氯不敏感。

以上結(jié)果表明，二氧化氯對(duì)褐腐菌、酵母菌和大腸埃希菌均有抑制作用，其抑制機(jī)理可能是二氧化氯使細(xì)菌細(xì)胞膜氧化，導(dǎo)致細(xì)胞膜破損，胞內(nèi)電解質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA滲出，引起細(xì)菌死亡；此外，二氧化氯對(duì)細(xì)菌代謝酶有強(qiáng)烈的抑制作用，研究結(jié)果為二氧化氯作為安全無(wú)毒抑菌劑的推廣應(yīng)用提供了理論依據(jù)。二氧化氯的其他抑菌機(jī)制，如是否抑制蛋白的表達(dá)，是否改變細(xì)菌能量代謝和相關(guān)基因的表達(dá)等，有待進(jìn)一步深入研究。

參 考 文 獻(xiàn)

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