李俊，趙新，陳紅，李飛武，梁晉剛，李允靜，王顥潛，高鴻飛，張華，陳子言，吳剛，沈平，徐利群，武玉花

轉(zhuǎn)基因定量檢測結(jié)果測量不確定度的自上而下評(píng)定方法研究及應(yīng)用

李俊1，趙新2，陳紅3，李飛武4，梁晉剛3，李允靜1，王顥潛3，高鴻飛1，張華3，陳子言3，吳剛1，沈平3，徐利群3，武玉花

1中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物溯源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430062；2天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，天津 300384；3農(nóng)業(yè)農(nóng)村部科技發(fā)展中心，北京 100025；4吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，長春 130033

【目的】定量檢測標(biāo)準(zhǔn)體系是實(shí)施轉(zhuǎn)基因定量標(biāo)識(shí)的基礎(chǔ)，而不確定度評(píng)定是定量檢測標(biāo)準(zhǔn)體系的重要組成部分。急需建立適合一般實(shí)驗(yàn)室采用的標(biāo)準(zhǔn)化轉(zhuǎn)基因定量檢測結(jié)果不確定度的自上而下評(píng)定方法，以便檢測實(shí)驗(yàn)室自行評(píng)定定量檢測結(jié)果的測量不確定度。【方法】測量方法精密度不確定度評(píng)定有2種方法，一種是根據(jù)“不確定度函數(shù)”的一般概念，利用15個(gè)不同濃度的常規(guī)樣品，建立測量方法精密度引入的不確定度評(píng)定公式；另一種是重復(fù)測量有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，根據(jù)檢測數(shù)據(jù)的中間精密度，計(jì)算方法精密度引入的不確定度。用有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或?qū)嶒?yàn)室配制樣品作陽性定量質(zhì)控品進(jìn)行偏倚不確定度評(píng)定，實(shí)驗(yàn)室配制樣品標(biāo)稱值的不確定度由實(shí)驗(yàn)室根據(jù)制備過程采用簡易程序自行評(píng)定。將測量方法精密度引入的不確定度和測量過程的偏倚不確定度合成，評(píng)定試樣定量結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)不確定度，然后乘以包含因子，獲得擴(kuò)展不確定度?！窘Y(jié)果】以轉(zhuǎn)基因玉米DBN9936定量檢測方法為例，分別用模擬的DBN9936常規(guī)樣品和有證基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（GBW（E）100901）評(píng)定測量方法精密度引入的不確定度，分別為0.76%和0.33%，與常規(guī)樣品相比，用有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)評(píng)定的測量方法精密度不確定度顯著偏小。用有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（GBW（E）100901）評(píng)定的偏倚不確定度為0.26%；用實(shí)驗(yàn)室配制粉末樣品和基因組DNA樣品（標(biāo)稱值均為3.0%）評(píng)定的偏倚不確定度分別為0.20%和0.19%。采用簡易程序評(píng)定實(shí)驗(yàn)室配制樣品標(biāo)稱值引入的不確定度時(shí)，部分不確定度分量被忽略，評(píng)定的偏倚不確定度偏小。將測量方法精密度不確定度和偏倚不確定度分別合成，用常規(guī)樣品評(píng)定的擴(kuò)展不確定度為1.26%、1.20%和1.20%；用有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)評(píng)定的擴(kuò)展不確定度為0.84%、0.78%和0.76%。【結(jié)論】建立了轉(zhuǎn)基因定量檢測結(jié)果自上而下的不確定度評(píng)定方法，檢測實(shí)驗(yàn)室要優(yōu)先選擇用常規(guī)樣品評(píng)定測量方法精密度引入的不確定度。在評(píng)定偏倚不確定度時(shí)，檢測實(shí)驗(yàn)室原則上要優(yōu)先選擇有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作陽性定量質(zhì)控品。

轉(zhuǎn)基因定量結(jié)果；測量不確定度；自上而下；有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)；陽性定量質(zhì)控品

0 引言

【研究意義】我國急需實(shí)施轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品定量標(biāo)識(shí)制度，規(guī)定標(biāo)識(shí)閾值，解決生物育種產(chǎn)業(yè)化后的產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因成分無意混雜或低水平混雜問題，降低生產(chǎn)經(jīng)營者的標(biāo)識(shí)成本和管理成本，提升生物育種產(chǎn)業(yè)化的經(jīng)濟(jì)效益[1-3]。實(shí)施定量標(biāo)識(shí)的前提是建立轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品定量檢測標(biāo)準(zhǔn)體系、研制出配套的有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。轉(zhuǎn)基因定量檢測結(jié)果不確定度評(píng)定是轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品定量檢測標(biāo)準(zhǔn)體系的重要組成部分，測量不確定度是一個(gè)始終與定量結(jié)果相關(guān)聯(lián)的參數(shù)，它表征合理地賦予被測量之值的分散性[4]。檢測實(shí)驗(yàn)室在報(bào)告定量檢測結(jié)果時(shí)，要同時(shí)報(bào)告試樣轉(zhuǎn)基因含量的測量值及其測量不確定度，以確定測量結(jié)果的可靠性和可比性[5]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】當(dāng)報(bào)告測量結(jié)束時(shí)，必須報(bào)告測量不確定度，測量不確定度就是對測量結(jié)果質(zhì)量的定量表征[5-6]。測量不確定度最早由國際計(jì)量局提出，通過國際標(biāo)準(zhǔn)化組織ISO發(fā)布，第一個(gè)被廣泛認(rèn)可的測量不確定度評(píng)定方法是《測量不確定度表示指南》（guide to the expression of uncertainty in measurement，GUM），通常被稱為GUM法，是采用“不確定度傳播率”得到被測量估計(jì)值的測量不確定度的方法[7]。對GUM法等同采用，中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)聯(lián)合國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局發(fā)布了標(biāo)準(zhǔn)《測量不確定度評(píng)定和表示》（GB/T 27418—2017）[8]、國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局發(fā)布了《測量不確定度評(píng)定與表示》（JJF 1059.1－2012）[9]。GUM法是所有測量不確定度評(píng)定的基礎(chǔ)，規(guī)定了不確定度的定義，將其與誤差區(qū)分開來，為測量不確定度的評(píng)定和表達(dá)制定了一般規(guī)則[10]。GUM法要求先建立特性值和其輸入量之間的數(shù)學(xué)模型，然后使用因果圖（魚骨圖）作為可視化輔助工具，剖分檢測過程中所有的不確定度分量來源，對各不確定度分量逐一分析，最后將各個(gè)不確定度分量合成，獲得總不確定度[11-12]。因?yàn)镚UM方法是基于剖分每個(gè)輸入量對不確定度的貢獻(xiàn)，該方法被稱作“自下而上（bottom-up）”的不確定度評(píng)定方法[13-14]。GUM法是測量領(lǐng)域?qū)Σ淮_定度進(jìn)行評(píng)定的基本方法，廣泛應(yīng)用于醫(yī)療檢測、工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、工程項(xiàng)目等各個(gè)領(lǐng)域[15-18]。GUM法是一種“自下而上”的不確定度評(píng)定方法，需要操作者深入了解測量方法，并建立特性值和輸入量間的數(shù)學(xué)模型，采用“不確定度傳播率”評(píng)估各個(gè)不確定度分量的貢獻(xiàn)，應(yīng)用門檻高，難以被一般的檢測實(shí)驗(yàn)室采用；若遺漏了關(guān)鍵不確定度分量，會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)估不確定度；而且對于沒有建立數(shù)學(xué)模型的測量，檢測實(shí)驗(yàn)室難以利用GUM方法進(jìn)行不確定度評(píng)定[14, 19]。于是提出了利用實(shí)驗(yàn)室內(nèi)或?qū)嶒?yàn)室間驗(yàn)證數(shù)據(jù)進(jìn)行不確定度評(píng)定的“自上而下”的不確定度評(píng)定方法[12]，我國對ISO/TS 21748:2004指南等同采用，于2010年發(fā)布了《利用重復(fù)性、再現(xiàn)性和正確度的估計(jì)值評(píng)估測量不確定度的指南》（GB/Z 22553-2010/ISO/TS 21748:2004），給出了基于再現(xiàn)性或中間精密度的估計(jì)值來評(píng)定測量不確定度的技術(shù)指導(dǎo)[20-21]。為規(guī)范轉(zhuǎn)基因定量檢測結(jié)果的不確定度評(píng)定，歐盟發(fā)布了轉(zhuǎn)基因檢測實(shí)驗(yàn)室不確定度評(píng)定指南《Guidance Document on Measurement Uncertainty for GMO Testing Laboratories》[22]。歐盟提出的不確定度評(píng)估原則與ISO/TS 21748:2004指南相似，注重整個(gè)方法在測量中的性能，被稱作“自上而下（top-down）”的不確定度評(píng)定方法。與GUM法相比，自上而下的不確定度評(píng)定方法不考慮測量方法的數(shù)學(xué)模型，無須對測量過程的各個(gè)不確定度分量一一評(píng)價(jià)，簡化了不確定度評(píng)定程序，便于檢測實(shí)驗(yàn)室采用，并且已成功應(yīng)用于醫(yī)學(xué)檢測[23-24]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】《檢驗(yàn)檢測機(jī)構(gòu)資質(zhì)認(rèn)定評(píng)審準(zhǔn)則》（市場監(jiān)管總局2023年第21號(hào)）和《檢測和校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室能力的通用要求》（GB T 17025-2017）均要求檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)/檢測實(shí)驗(yàn)室建立和保持應(yīng)用測量不確定度的程序[25-26]，在定量測量時(shí)，應(yīng)針對結(jié)果給出相應(yīng)的測量不確定度。我國生物育種產(chǎn)業(yè)化急需實(shí)施轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品定量標(biāo)識(shí)制度，需要每個(gè)檢測實(shí)驗(yàn)室建立轉(zhuǎn)基因定量檢測結(jié)果的不確定度評(píng)定程序，自行評(píng)定每個(gè)試樣定量結(jié)果的測量不確定度。前期，國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)總局等同采用歐盟發(fā)布的第1版不確定度評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)布了《轉(zhuǎn)基因檢測實(shí)驗(yàn)室測量不確定度評(píng)估指南》SN/T 4562-2016[27]，由于歐盟第1版不確定度評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)已經(jīng)廢止，該標(biāo)準(zhǔn)已不再適用。農(nóng)業(yè)農(nóng)村部在2021年發(fā)布了《轉(zhuǎn)基因成分定量檢測結(jié)果不確定度評(píng)定與表示》農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第423號(hào)-10-2021[28]，該標(biāo)準(zhǔn)提供了“自下而上”的不確定度評(píng)定方法。為支撐轉(zhuǎn)基因定量標(biāo)識(shí)制度的實(shí)施，本研究將建立一種可替代的、更適用于一般轉(zhuǎn)基因檢測實(shí)驗(yàn)室采用的“自上而下”的測量不確定度評(píng)定方法，并在轉(zhuǎn)基因檢測實(shí)驗(yàn)室間推廣應(yīng)用。在轉(zhuǎn)基因檢測領(lǐng)域，我國還未建立起適合一般實(shí)驗(yàn)室采用的“自上而下”的定量檢測結(jié)果不確定度評(píng)定方法。參考《利用重復(fù)性、再現(xiàn)性和正確度的估計(jì)值評(píng)估測量不確定度的指南》和歐盟不確定度評(píng)定指南[20-22]，建立了檢測實(shí)驗(yàn)室自行評(píng)定定量檢測結(jié)果測量不確定度的“自上而下”方法?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究針對我國標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)體系不完善的現(xiàn)狀，擬提出用實(shí)驗(yàn)室配制樣品作為偏倚質(zhì)控，并進(jìn)行偏倚不確定度評(píng)定的方法。以轉(zhuǎn)基因玉米DBN9936定量檢測方法為例進(jìn)行應(yīng)用示范，一般檢測實(shí)驗(yàn)室可以參照執(zhí)行，填補(bǔ)國內(nèi)轉(zhuǎn)基因定量檢測結(jié)果“自上而下”不確定度評(píng)定的空白。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

轉(zhuǎn)基因玉米DBN9936純合種子和非轉(zhuǎn)基因受體DBN318種子由大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司提供。用轉(zhuǎn)基因玉米DBN9936純合體基因組DNA制備的純品基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（GBW10266）以及用轉(zhuǎn)基因玉米DBN9936純合種子粉末和非轉(zhuǎn)基因玉米受體粉末混合制備的基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（GBW（E）100901）由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部科技發(fā)展中心和本單位聯(lián)合研制，并取得有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書，標(biāo)準(zhǔn)值和擴(kuò)展不確定度為（3.49±0.33）%。

1.2 常規(guī)樣品制備

以轉(zhuǎn)基因玉米DBN9936純合種子和非轉(zhuǎn)基因受體粉末為材料，用天平稱量法配制轉(zhuǎn)基因含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）為0.10%—4.00%的混合樣品，模擬實(shí)驗(yàn)室檢測過程中遇到的低濃度常規(guī)樣品。共配制15個(gè)樣品，質(zhì)量分?jǐn)?shù)依次為0.10%、0.12%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%、0.35%、0.40%、0.50%、0.70%、1.00%、2.00%、2.50%、3.00%和4.00%，15個(gè)模擬常規(guī)樣品依次命名為R1—R15。將15個(gè)模擬常規(guī)樣品分為2組，R1—R6的濃度小于或等于0.30%，接近方法的定量限，稱為低濃度常規(guī)樣品；R7—R15的濃度為0.30%—4.00%，稱為高濃度常規(guī)樣品。

1.3 陽性定量質(zhì)控品制備

若沒有有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行偏倚控制，需實(shí)驗(yàn)室自己配制轉(zhuǎn)基因含量與標(biāo)識(shí)閾值相當(dāng)?shù)姆勰悠坊蚧蚪MDNA樣品，作為陽性定量質(zhì)控品。

用轉(zhuǎn)基因玉米DBN9936粉末和非轉(zhuǎn)基因玉米粉末混合配制粉末質(zhì)控品。在配制粉末樣品前，先單粒檢測轉(zhuǎn)基因種子基因型和純度，至少檢測50粒種子；用至少3 000粒種子制備的混樣，檢測非轉(zhuǎn)基因種子純度。將研磨的轉(zhuǎn)基因粉末和非轉(zhuǎn)基因粉末暴露在相同的試驗(yàn)條件下至少24 h，平衡2種粉末的含水量，以減小含水量差異對標(biāo)稱值不確定度的影響。然后用校準(zhǔn)的天平稱量配制轉(zhuǎn)基因含量是3.0%的粉末樣品。

用轉(zhuǎn)基因玉米DBN9936純合體基因組DNA和非轉(zhuǎn)基因玉米基因組DNA混合制備基因組DNA質(zhì)控品。在配制之前，首先鑒定轉(zhuǎn)基因單株和非轉(zhuǎn)基因單株的基因型，分別提取轉(zhuǎn)基因單株和非轉(zhuǎn)基因單株的基因組DNA，評(píng)定基因組質(zhì)量后，用0.1×TE緩沖液將基因組DNA濃度調(diào)整到約100 ng·μL-1，然后用數(shù)字PCR對轉(zhuǎn)基因DNA和非轉(zhuǎn)基因DNA的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因拷貝數(shù)濃度進(jìn)行多次測量，確定二者的拷貝數(shù)濃度后，用校準(zhǔn)的移液器配制轉(zhuǎn)基因含量是3.0%的基因組DNA樣品。

1.4 DNA提取

用Qiagen基因組DNA提取試劑盒（Qiagen DNeasy Plant Mini Kit，1540355331）提取標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（GBW（E）100901）及模擬常規(guī)樣品的基因組DNA。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（GBW（E）100901）取5個(gè)平行子樣，每個(gè)模擬常規(guī)樣品取2個(gè)平行子樣，每個(gè)平行子樣獨(dú)立提取1份DNA。提取的DNA溶解到100 μL 0.1×TE緩沖液中?；蚪MDNA完全溶解后，用Nanodrop1000紫外分光光度計(jì)檢測DNA溶液的濃度及純度，將DNA濃度調(diào)整到50 ng·μL-1。

1.5 熒光定量PCR

采用前期建立的DBN9936轉(zhuǎn)化體特異性熒光定量PCR方法檢測模擬常規(guī)樣品的轉(zhuǎn)基因含量[29]，轉(zhuǎn)基因玉米DBN9936轉(zhuǎn)化體特異性引物探針和玉米內(nèi)標(biāo)基因引物探針序列詳見表1。DBN9936轉(zhuǎn)化體和內(nèi)標(biāo)基因的反應(yīng)體系和程序相同。熒光定量PCR反應(yīng)體系：2×TaqMan? Universal PCR Master Mix 10 μL、正向引物和反向引物各0.8 μL、探針0.4 μL、DNA模板2 μL，加ddH2O至總體積20 μL。反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 60 s，45個(gè)循環(huán)；在第二階段的退火延伸（60 ℃）時(shí)段收集熒光信號(hào)。以梯度稀釋的基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（GBW10266）為校準(zhǔn)品繪制DBN9936轉(zhuǎn)化體和內(nèi)標(biāo)基因標(biāo)準(zhǔn)曲線。每個(gè)模擬常規(guī)樣品檢測2個(gè)平行子樣，每個(gè)子樣提取1份DNA，每份DNA設(shè)置2個(gè)PCR重復(fù)。對有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（GBW（E）100901）進(jìn)行定量時(shí)，在短時(shí)間內(nèi)重復(fù)測量5 d（t=1,...,5），不同時(shí)間可用不同的檢測員、不同的試劑、或不同的設(shè)備進(jìn)行檢測。每天檢測5個(gè)平行子樣，每個(gè)子樣提取1份DNA，每份DNA設(shè)置2個(gè)PCR重復(fù)。

表1 DBN9936轉(zhuǎn)化體及zSSIIb內(nèi)標(biāo)基因引物和探針序列

1.6 用常規(guī)樣品評(píng)定測量方法精密度引入的不確定度

可用實(shí)驗(yàn)室收集或配制的常規(guī)樣品評(píng)定測量方法精密度引入的測量不確定度[22]，用較低濃度樣品評(píng)定恒定標(biāo)準(zhǔn)差，用較高濃度樣品評(píng)定相對恒定標(biāo)準(zhǔn)差。

1.6.1 用低濃度樣品評(píng)定恒定標(biāo)準(zhǔn)差用6個(gè)低濃度常規(guī)樣品（不同濃度的樣品用下標(biāo)表示，=1,...,6）評(píng)定恒定標(biāo)準(zhǔn)差。每個(gè)子樣的測量值為2個(gè)PCR重復(fù)的平均值，每個(gè)低濃度樣品的2個(gè)子樣的測量值分別記為1,j和2,j，二者的絕對差值計(jì)算為：

恒定標(biāo)準(zhǔn)差計(jì)算為：

每個(gè)高濃度樣品的2份子樣DNA測量值的相對差值計(jì)算為：

相對恒定標(biāo)準(zhǔn)差計(jì)算為：

1.6.3測量方法精密度引入的不確定度評(píng)定 根據(jù)確定的恒定標(biāo)準(zhǔn)差和相對恒定標(biāo)準(zhǔn)差評(píng)定樣品檢測過程中測量方法精密度引入的不確定度（u），不確定度u計(jì)算為：

1.7 用有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)評(píng)定測量方法精密度引入的不確定度

若檢測實(shí)驗(yàn)室沒有收集到足量的常規(guī)樣品，可用認(rèn)定值與標(biāo)識(shí)閾值相當(dāng)?shù)挠凶C標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)評(píng)定測量方法精密度引入的不確定度[22]。

1.7.1 檢測數(shù)據(jù)分析 對有證基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)重復(fù)測量5 d，每天測量5個(gè)平行子樣的檢測數(shù)據(jù)，進(jìn)行單因素方差分析。每天5個(gè)平行子樣的檢測數(shù)據(jù)為一組數(shù)據(jù)，檢測數(shù)據(jù)的組內(nèi)均方MS計(jì)算為：

檢測數(shù)據(jù)的組間均方MS計(jì)算為：

式中，u表示測量方法精密度引入的不確定度；表示重復(fù)性方差；表示試樣的平行子樣數(shù)；表示組間方差。

1.8 偏倚不確定度評(píng)定

1.8.1 用有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)評(píng)定偏倚不確定度 陽性定量質(zhì)控品次（=3）重復(fù)檢測數(shù)據(jù)平均值的標(biāo)準(zhǔn)不確定度計(jì)算為：

陽性定量質(zhì)控品次重復(fù)檢測數(shù)據(jù)平均值偏倚的標(biāo)準(zhǔn)不確定度計(jì)算為：

若||＜2×u（擴(kuò)展不確定度，95%置信水平下包含因子為2），表明該次試驗(yàn)陽性定量質(zhì)控品檢測數(shù)據(jù)的偏倚不顯著，評(píng)定的偏倚不確定度可用于合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度。

1.8.2 用實(shí)驗(yàn)室配制樣品評(píng)定偏倚不確定度 用實(shí)驗(yàn)室配置樣品作陽性定量質(zhì)控品時(shí)，需要實(shí)驗(yàn)室自行評(píng)定陽性定量質(zhì)控品標(biāo)稱值的不確定度?？紤]到檢測實(shí)驗(yàn)室的可操作性，對不確定度評(píng)定過程進(jìn)行一定的簡化處理。

根據(jù)配制粉末質(zhì)控品所用的轉(zhuǎn)基因種子和非轉(zhuǎn)基因種子的純度不確定度，以及用來稱量轉(zhuǎn)基因粉末和非轉(zhuǎn)基因粉末的電子天平的不確定度，評(píng)定粉末質(zhì)控品標(biāo)稱值的標(biāo)準(zhǔn)不確定度。粉末質(zhì)控品標(biāo)稱值的相對不確定度按下式計(jì)算：

粉末質(zhì)控品標(biāo)稱值的標(biāo)準(zhǔn)不確定度計(jì)算為：

u=c·u,r（16）

式中，u,r表示粉末質(zhì)控品的合成相對不確定度；p表示95%置信度下轉(zhuǎn)基因種子純度；p-GM表示95%置信度下非轉(zhuǎn)基因種子純度；m表示轉(zhuǎn)基因粉末質(zhì)量；m-GM表示非轉(zhuǎn)基因粉末質(zhì)量；U表示電子天平的擴(kuò)展不確定度；u表示粉末質(zhì)控品標(biāo)稱值的標(biāo)準(zhǔn)不確定度；c表示粉末質(zhì)控品標(biāo)稱值。

根據(jù)配制基因組DNA質(zhì)控品所用的轉(zhuǎn)基因DNA和非轉(zhuǎn)基因DNA拷貝數(shù)濃度測定的不確定度，以及用來移取轉(zhuǎn)基因DNA和非轉(zhuǎn)基因DNA的移液器的不確定度，評(píng)定基因組DNA質(zhì)控品標(biāo)稱值的標(biāo)準(zhǔn)不確定度?；蚪MDNA質(zhì)控品標(biāo)稱值的相對不確定度按下式計(jì)算：

式中，u,r表示基因組DNA質(zhì)控品的合成相對不確定度；表示轉(zhuǎn)基因DNA拷貝數(shù)濃度相對不確定度；表示非轉(zhuǎn)基因DNA拷貝數(shù)濃度相對不確定度；v表示轉(zhuǎn)基因DNA體積；v-GM表示非轉(zhuǎn)基因DNA體積；u表示移液器的不確定度，若移液器使用校準(zhǔn)證書，則u=U/(=2)；若移液器使用檢定證書（為檢定證書中對應(yīng)級(jí)別給出的最大允許誤差）。

基因組DNA質(zhì)控品標(biāo)稱值的標(biāo)準(zhǔn)不確定度按公式（10）計(jì)算。然后按公式（15）和公式（16）評(píng)定用實(shí)驗(yàn)室配制樣品進(jìn)行偏倚控制引入的不確定度。

若陽性定量質(zhì)控品檢測數(shù)據(jù)的相對標(biāo)準(zhǔn)差≤25%，且偏倚||≤25%，表明陽性定量質(zhì)控品檢測數(shù)據(jù)的偏倚不顯著，本次試驗(yàn)陽性定量質(zhì)控品檢測數(shù)據(jù)合格。評(píng)定的偏倚不確定度可用于合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度。

1.9 試樣測量結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)不確定度評(píng)定

1.9.2 用有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)評(píng)定的測量方法精密度不確定度與偏倚不確定度合成 基于有證基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的檢測數(shù)據(jù)，按公式（12）評(píng)定測量方法精密度不確定度u。用有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或?qū)嶒?yàn)室配制樣品做陽性定量質(zhì)控品，評(píng)定測量偏倚引入的不確定度u。按下式將u與用有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或?qū)嶒?yàn)室配制樣品評(píng)定的u分別合成，計(jì)算試樣定量結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

式中，u表示定量結(jié)果的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度；2表示重復(fù)性方差；表示試樣的平行子樣數(shù)；2表示組間方差；u表示陽性定量質(zhì)控品次重復(fù)檢測平均值偏倚的標(biāo)準(zhǔn)不確定度。

1.9.3 計(jì)算擴(kuò)展不確定度 試樣定量檢測結(jié)果的擴(kuò)展不確定度（）計(jì)算為：

=ku（20）

式中，表示擴(kuò)展不確定度；u表示定量結(jié)果的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度；表示包含因子（95%置信度下，=2）。

2 結(jié)果

2.1 測量方法精密度引入的不確定度評(píng)定

根據(jù)歐盟發(fā)布的轉(zhuǎn)基因檢測實(shí)驗(yàn)室測量不確定度評(píng)定指導(dǎo)文件（第3版）[22]，可用常規(guī)樣品或有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)評(píng)定測量方法精密度引入的不確定度。

2.1.1 用常規(guī)樣品評(píng)定測量方法精密度引入的不確定度 用常規(guī)樣品評(píng)定測量方法引入的不確定度，測量過程包含了樣品制備、DNA提取純化、PCR檢測和數(shù)據(jù)分析等全部程序，用于評(píng)定測量不確定度的數(shù)據(jù)涵蓋了所有不確定度分量，反映了從樣品制備到數(shù)據(jù)處理全過程的所有變異，因此，用常規(guī)樣品評(píng)定測量不確定度是進(jìn)行轉(zhuǎn)基因定量檢測結(jié)果不確定度評(píng)定的首選方法。

Thompson等[30]提出“不確定度函數(shù)”（）的一般概念（公式（7）），不確定度大小取決于參數(shù)“”和參數(shù)“”。參數(shù)“”描述在轉(zhuǎn)基因含量接近定量限（limit of quantification，LOQ）時(shí)對不確定度的恒定貢獻(xiàn)，當(dāng)轉(zhuǎn)基因含量接近定量限時(shí)，測量不確定度是一個(gè)常數(shù)；參數(shù)“”表示轉(zhuǎn)基因含量較高時(shí)的恒定相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，當(dāng)轉(zhuǎn)基因含量較高時(shí)，測量不確定度貢獻(xiàn)量依賴于被測量值，即測量不確定度與轉(zhuǎn)基因含量成正比。

2.1.2 用有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)評(píng)定測量方法精密度引入的不確定度 ISO/IEC 17025規(guī)定，認(rèn)可實(shí)驗(yàn)室必須對標(biāo)準(zhǔn)測量方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室內(nèi)驗(yàn)證，以證明實(shí)驗(yàn)室能正確地實(shí)施標(biāo)準(zhǔn)方法，且標(biāo)準(zhǔn)方法滿足預(yù)期用途[31]。因此，檢測實(shí)驗(yàn)室必須在方法驗(yàn)證的框架內(nèi)，用標(biāo)準(zhǔn)方法檢測有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（轉(zhuǎn)基因含量標(biāo)準(zhǔn)值與標(biāo)識(shí)閾值相當(dāng)）的轉(zhuǎn)基因含量，證明檢測實(shí)驗(yàn)室的偏倚和精密度能得到較好的控制。標(biāo)準(zhǔn)GB/Z 22553—2010/ISO/TS 21748:2004提出，利用重復(fù)性、再現(xiàn)性和正確度的估計(jì)值評(píng)估測量不確定度[23-24]。在檢測實(shí)驗(yàn)室的偏倚和精確度能得到較好控制的前提下，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)方法驗(yàn)證的中間精密度是測量不確定度評(píng)定的有效依據(jù)，因此，本方法根據(jù)中間精密度評(píng)定定量方法精密度引入的測量不確定度。

表2 15個(gè)常規(guī)樣品的定量檢測數(shù)據(jù)及分析結(jié)果

表3 恒定標(biāo)準(zhǔn)差α計(jì)算過程及結(jié)果

當(dāng)轉(zhuǎn)基因含量接近標(biāo)識(shí)閾值時(shí)，準(zhǔn)確評(píng)定其不確定度是轉(zhuǎn)基因定量檢測的關(guān)鍵，因此，選用標(biāo)準(zhǔn)值（轉(zhuǎn)基因含量）與標(biāo)識(shí)閾值相當(dāng)?shù)挠凶C轉(zhuǎn)基因基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)評(píng)定測量不確定度。本研究選用了轉(zhuǎn)基因玉米DBN9936的有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（GBW（E）100901）作陽性定量質(zhì)控品，評(píng)定DBN9936轉(zhuǎn)化體特異性定量PCR方法的測量不確定度，標(biāo)準(zhǔn)值DBN9936轉(zhuǎn)化體/拷貝數(shù)比值為3.49%，擴(kuò)展不確定度為0.33%。每天測試5個(gè)平行子樣，連續(xù)測量5 d（表5）。對檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，剖分組內(nèi)方差（平行子樣間方差，又稱重復(fù)性方差）和組間方差（日期間方差），計(jì)算中間精密度。每天5個(gè)平行子樣的檢測數(shù)據(jù)為一組數(shù)據(jù)，按公式（8）—公式（11），先計(jì)算數(shù)據(jù)的組內(nèi)均方MS和組間均方MS，然后計(jì)算檢測數(shù)據(jù)的重復(fù)性方差2和組間方差2（表5）。

表4 相對恒定標(biāo)準(zhǔn)差β計(jì)算過程及結(jié)果

表5 有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GBW（E）100901的定量檢測數(shù)據(jù)

試樣檢測了3個(gè)PCR重復(fù)，根據(jù)公式（12），測量方法精密度引入的不確定度評(píng)定為

與常規(guī)樣品相比，有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)少了檢測過程中樣品制備這個(gè)步驟，用有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)評(píng)定的不確定度顯著偏小，而且評(píng)定的不確定度是1個(gè)常數(shù)，反映不出試樣轉(zhuǎn)基因含量不同時(shí)，其檢測數(shù)據(jù)精密度的變化。

2.2 偏倚不確定度評(píng)定

原則上，實(shí)驗(yàn)室在定量檢測過程中，要用標(biāo)準(zhǔn)值與標(biāo)識(shí)閾值相當(dāng)?shù)挠凶C標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作陽性定量質(zhì)控，進(jìn)行偏倚控制，但考慮到我國的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)體系還不完善，大部分標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)還在研制中，在沒有有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可用的情況下，允許實(shí)驗(yàn)室對原材料進(jìn)行鑒定和確認(rèn)后，自行配制轉(zhuǎn)基因含量與標(biāo)識(shí)閾值相當(dāng)?shù)臉悠纷鲫栃远抠|(zhì)控，并自行評(píng)定實(shí)驗(yàn)室配制樣品標(biāo)稱值的標(biāo)準(zhǔn)不確定度。我國還未公布定量標(biāo)識(shí)閾值，本文假定標(biāo)識(shí)閾值為3%，模擬偏倚不確定度評(píng)定方法。

表6 陽性定量質(zhì)控品檢測數(shù)據(jù)

a用有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作質(zhì)控品，認(rèn)證值的標(biāo)準(zhǔn)不確定度根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書提供的擴(kuò)展不確定度計(jì)算；b用實(shí)驗(yàn)室配制樣品作質(zhì)控品，標(biāo)稱值的標(biāo)準(zhǔn)不確定度由實(shí)驗(yàn)室根據(jù)制備過程自行評(píng)定

aUsing a CRM as quality control, the standard uncertainty of the certified value is calculated based on the expanded uncertainty provided by the certificate;bUsing a laboratory prepared sample as quality control, the standard uncertainty of the nominal value is evaluated by the laboratory based on the preparation process

陽性定量質(zhì)控品重復(fù)檢測數(shù)據(jù)平均值的偏倚計(jì)算為，偏倚擴(kuò)展不確定度計(jì)算為2×u=2×0.260%=0.52%。因?yàn)?.217%＜0.52%，即||＜2×u。表明該次試驗(yàn)陽性定量質(zhì)控品檢測數(shù)據(jù)的偏倚不顯著，評(píng)定的偏倚不確定度u（0.260%）可用于合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度。

2.2.2 用實(shí)驗(yàn)室配制樣品作陽性定量質(zhì)控品評(píng)定偏倚不確定度 若無有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，則檢測實(shí)驗(yàn)室配制標(biāo)稱值與標(biāo)識(shí)閾值相當(dāng)?shù)臉悠纷鳛殛栃远抠|(zhì)控品，進(jìn)行偏倚控制。實(shí)驗(yàn)室可用經(jīng)純度鑒定的轉(zhuǎn)基因純合體種子粉末和非轉(zhuǎn)基因粉末，用校準(zhǔn)的天平稱量配制轉(zhuǎn)基因含量與標(biāo)識(shí)閾值相當(dāng)?shù)姆勰悠纷鳛殛栃远抠|(zhì)控品；也可用轉(zhuǎn)基因純合體基因組DNA和非轉(zhuǎn)基因單株基因組DNA，用校準(zhǔn)的移液器配制轉(zhuǎn)基因含量與標(biāo)識(shí)閾值相當(dāng)?shù)幕蚪MDNA樣品作為陽性定量質(zhì)控品。與有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)相比，實(shí)驗(yàn)室配制樣品的標(biāo)稱值沒有認(rèn)證的不確定度，需實(shí)驗(yàn)室自行評(píng)定配制樣品標(biāo)稱值的標(biāo)準(zhǔn)不確定度。

2.2.2.1 粉末質(zhì)控品偏倚不確定度評(píng)定 根據(jù)公式（14），要評(píng)定粉末質(zhì)控品的偏倚不確定度，需分別評(píng)定其標(biāo)稱值的標(biāo)準(zhǔn)不確定度和重復(fù)檢測數(shù)據(jù)平均值的標(biāo)準(zhǔn)不確定度。本次實(shí)驗(yàn)室配制一個(gè)轉(zhuǎn)基因含量為3%的粉末質(zhì)控品，共配制1 g。首先對轉(zhuǎn)基因種子和非轉(zhuǎn)基因種子進(jìn)行原材料純度鑒定，轉(zhuǎn)基因種子純度采用單粒法檢測，為保證檢測樣本對總體的代表性，至少抽檢50粒種子進(jìn)行單粒檢測。經(jīng)檢測，50粒種子全部為純合體，在95%置信度下，根據(jù)泊松分布，轉(zhuǎn)基因種子純度≥94.2%；檢測3 000粒非轉(zhuǎn)基因種子，結(jié)果為陰性，非轉(zhuǎn)基因種子純度≥99.9%。將轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因種子研磨干燥后，用校準(zhǔn)的電子天平（校準(zhǔn)證書上擴(kuò)展不確定度為0.2 mg）稱量0.97 g非轉(zhuǎn)基因粉末、0.03 g轉(zhuǎn)基因粉末，混勻制備標(biāo)稱值為3%的粉末陽性定量質(zhì)控樣品。按公式（15），粉末陽性定量質(zhì)控品標(biāo)稱值的相對不確定度計(jì)算為：

按公式（16）計(jì)算粉末質(zhì)控品標(biāo)稱值的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u=3%×0.018=0.06%。

2.2.2.2 基因組DNA質(zhì)控品偏倚不確定度評(píng)定 配制一個(gè)轉(zhuǎn)基因含量為3%的基因組DNA質(zhì)控品，共配制1 ml。用內(nèi)標(biāo)基因數(shù)字PCR分別檢測DBN9936純合體基因組DNA和非轉(zhuǎn)基因DNA的濃度，每種DNA至少重復(fù)測量3次（表7），計(jì)算3次重復(fù)檢測數(shù)據(jù)平均值的相對標(biāo)準(zhǔn)差（表7）。

表7 轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因DNA濃度測量及分析數(shù)據(jù)

經(jīng)濃度檢測，轉(zhuǎn)基因DNA和非轉(zhuǎn)基因DNA的拷貝數(shù)濃度相似，直接用移液器按體積量取轉(zhuǎn)基因DNA和非轉(zhuǎn)基因DNA溶液，配制轉(zhuǎn)基因含量為3%的基因組DNA溶液。用量程為100—1 000 μL的檢定移液器（檢定證書上移取500—1 000 μL溶液，容量允差為±1.0%）移取970 μL的非轉(zhuǎn)基因DNA溶液，用量程為20—200 μL的檢定移液器（檢定證書上移取20—100 μL溶液，容量允差為±2.0%）移取30 μL非轉(zhuǎn)基因溶液，混勻制備1 ml標(biāo)稱值為3%的基因組DNA陽性定量質(zhì)控樣品。按公式（17），基因組DNA陽性定量質(zhì)控品標(biāo)稱值的相對不確定度計(jì)算為：

（移液器鑒定證書直接給出了容量允差的相對值，因此，評(píng)定移液體積引入的不確定度無須再除以移取體積）?；蚪MDNA質(zhì)控品標(biāo)稱值的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u= 3%×0.021=0.063%。

用實(shí)驗(yàn)室配制粉末樣品和基因組DNA樣品作為定量檢測的陽性定量質(zhì)控品，檢測數(shù)據(jù)的相對標(biāo)準(zhǔn)差RSD分別為10.21%和9.23%，均小于規(guī)定的25%，因此，評(píng)定的偏倚不確定度可用于試樣定量結(jié)果測量不確定度的合成。

實(shí)驗(yàn)室自行評(píng)定配制樣品標(biāo)稱值的標(biāo)準(zhǔn)不確定度時(shí)，在充分考慮原材料純度、設(shè)備校準(zhǔn)不確定度、測量數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)差等因素的基礎(chǔ)上，考慮到一般檢測實(shí)驗(yàn)室的可操作性，本文提出了不確定度評(píng)定的簡易程序（公式（15）、（17）），忽略了均勻性檢驗(yàn)、穩(wěn)定性檢驗(yàn)等不確定分量，評(píng)定的實(shí)驗(yàn)室配制樣品標(biāo)稱值標(biāo)準(zhǔn)不確定度顯著小于有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)認(rèn)證值的標(biāo)準(zhǔn)不確定度，進(jìn)而導(dǎo)致用實(shí)驗(yàn)室配制樣品評(píng)定的偏倚不確定度略小于用有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)評(píng)定的偏倚不確定度（表6）。

2.3 試樣擴(kuò)展不確定度評(píng)定

本研究檢測了一個(gè)含玉米DBN9936轉(zhuǎn)化體的試樣，檢測3個(gè)子樣，每個(gè)子樣3個(gè)PCR重復(fù)，檢測平均值為4.15%。試樣定量結(jié)果的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度主要包括2個(gè)分量，分別是測量方法精密度引入的不確定度，和試樣檢測過程中偏倚引入的不確定度。測量方法精密度引入的不確定度用常規(guī)樣品或有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)評(píng)定，試樣的轉(zhuǎn)基因含量為4.15%時(shí)，用常規(guī)樣品評(píng)定的測量方法精密度不確定度為0.76%，用有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)評(píng)定的不確定度為0.33%。偏倚引入的不確定度用陽性定量質(zhì)控品評(píng)定，首選有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作質(zhì)控，若沒有有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)用實(shí)驗(yàn)室配制的粉末樣品或基因組DNA樣品作質(zhì)控，3種質(zhì)控品評(píng)定的偏倚不確定度u見表6。將評(píng)定的方法精密度不確定度與不同質(zhì)控品的偏倚不確定度分別合成，評(píng)定試樣定量結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)不確定度。

2.3.1 將常規(guī)樣品評(píng)定的測量方法精密度不確定度與偏倚不確定度合成 用公式（18）將常規(guī)樣品評(píng)定的測量方法精密度不確定度與偏倚不確定度合成，計(jì)算試樣定量檢測結(jié)果的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度。采用3種不同的質(zhì)控品評(píng)定偏倚引入的不確定度：1）若用有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)評(píng)定偏倚不確定度，則試樣定量結(jié)果的測量不確定度計(jì)算為

2）若用實(shí)驗(yàn)室配制的粉末樣品評(píng)定偏倚不確定度，則試樣定量結(jié)果的測量不確定度計(jì)算為

3）若用實(shí)驗(yàn)室配制的基因組DNA樣品評(píng)定偏倚不確定度，則試樣定量結(jié)果的測量不確定度計(jì)算為

（表8）。與有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)相比，用實(shí)驗(yàn)室配制樣品作為陽性定量質(zhì)控品評(píng)定的偏倚不確定度雖然偏?。ū?），但用3種不同質(zhì)控品進(jìn)行偏倚控制，評(píng)定的試樣合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度相近（表8）。根據(jù)公式（20）計(jì)算定量結(jié)果的擴(kuò)展不確定度，用有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、實(shí)驗(yàn)室配制粉末樣品、實(shí)驗(yàn)室配制基因組DNA樣品做陽性定量質(zhì)控品，計(jì)算的擴(kuò)展不確定度依次為1.26%、1.20%、1.20%，定量結(jié)果依次表示為（4.15± 1.26）%、（4.15±1.20）%、（4.15±1.20）%（表8）。

用常規(guī)樣品評(píng)定測量方法精密度引入的不確定度，其大小與待測樣品的測量值呈正相關(guān)（公式7），待測樣品的測量平均值越大，評(píng)定的不確定度越大。當(dāng)待測樣品的測量平均值為4.15%時(shí)，評(píng)定的方法精密度不確定度為0.76%。而用有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)評(píng)定的不確定度為1個(gè)常數(shù)，為0.33%，不確定度大小不隨試樣轉(zhuǎn)基因含量不同發(fā)生變化。由于用有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)評(píng)定方法精密度不確定度時(shí)，測量過程中少了樣品制備的步驟，用有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)評(píng)定的不確定度顯著偏小，導(dǎo)致最終評(píng)定的試樣測量結(jié)果擴(kuò)展不確定度顯著偏?。ū?）。建議檢測實(shí)驗(yàn)室優(yōu)先選擇用常規(guī)樣品評(píng)定測量方法精密度引入的不確定度。

表8 試樣測量不確定度評(píng)定結(jié)果及定量結(jié)果表示

3 討論

3.1 需要建立自上而下的轉(zhuǎn)基因定量結(jié)果不確定度評(píng)定方法

GUM方法要求，在轉(zhuǎn)基因定量檢測過程中，操作者要密切關(guān)注所有可能的不確定性來源[7]。取樣（即樣品收集）通常對總體不確定性有很大影響。但在大多數(shù)情況下，實(shí)驗(yàn)室很難估計(jì)這一步驟引入的不確定度，因?yàn)楦鶕?jù)試樣（食物/飼料）的類型，通常用不同的方法抽取代表性樣品。此外，抽樣通常由檢測實(shí)驗(yàn)室以外的其他機(jī)構(gòu)執(zhí)行。因此，定量檢測結(jié)果不確定度主要評(píng)定從樣品制備到結(jié)果分析產(chǎn)生的測量不確定度。測量不確定度主要來源于樣品制備（將實(shí)驗(yàn)室樣品縮減為測試樣品）、DNA提取、純化DNA、定量分析（qPCR或dPCR）及包括校準(zhǔn)在內(nèi)的數(shù)據(jù)評(píng)估[29]。GUM方法需要考慮所有的不確定度來源，除非可以證明特定的不確定度分量可以忽略不計(jì)。實(shí)踐證明，采用“自下而上”的不確定度評(píng)定方法，需要操作人員對檢測過程有非常深入的理解，適用于校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室采用，而一般的檢測實(shí)驗(yàn)室在使用GUM方法時(shí)往往會(huì)遭遇困難[14, 19]。

在轉(zhuǎn)基因檢測領(lǐng)域，根據(jù)轉(zhuǎn)基因定量檢測的技術(shù)特點(diǎn)，歐盟發(fā)布了轉(zhuǎn)基因檢測實(shí)驗(yàn)室測量不確定度評(píng)定指導(dǎo)文件，提出了“自上而下”評(píng)定測量不確定度的方法。該指南目前已發(fā)布了3版，最新的第3版于2020年發(fā)布[22]。國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)總局等同采用了歐盟發(fā)布的第一版標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)布了SN/T 4562-2016《轉(zhuǎn)基因檢測實(shí)驗(yàn)室測量不確定度評(píng)估指南》[27]。歐盟的第3版標(biāo)準(zhǔn)與前面2版相比，考慮了歐盟發(fā)布的轉(zhuǎn)基因有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、定量檢測標(biāo)準(zhǔn)，以及檢測實(shí)驗(yàn)室的需求；認(rèn)為每個(gè)檢測實(shí)驗(yàn)室都應(yīng)該針對每個(gè)定量檢測標(biāo)準(zhǔn)評(píng)定自己的測量不確定度，而且要求實(shí)驗(yàn)室優(yōu)先選擇用常規(guī)樣品評(píng)定方法精密度引入的不確定度，并修正了不確定度評(píng)定方法。目前我國參照歐盟第一版標(biāo)準(zhǔn)發(fā)布的《轉(zhuǎn)基因檢測實(shí)驗(yàn)室測量不確定度評(píng)估指南》已經(jīng)滯后[27]，需要制定頒布新的轉(zhuǎn)基因定量結(jié)果不確定度評(píng)定指南。

3.2 檢測實(shí)驗(yàn)室優(yōu)先用常規(guī)樣品評(píng)定測量方法精密度引入的不確定度

本研究參照歐盟第3版轉(zhuǎn)基因檢測實(shí)驗(yàn)室測量不確定度評(píng)定指導(dǎo)文件[22]，模擬了用常規(guī)樣品和有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)評(píng)定測量方法精密度引入不確定度的方法。與用常規(guī)樣品評(píng)定的測量方法精密度不確定度相比，用有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)評(píng)定的不確定度，少了樣品制備的過程，方法精密度引入的不確定度被低估；而且用有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，基于測量結(jié)果的中間精密度評(píng)定的不確定度是一個(gè)常數(shù)，不能反映出樣品不確定度隨測量值變化的趨勢。因此，檢測實(shí)驗(yàn)室應(yīng)優(yōu)先用常規(guī)樣品評(píng)定測量方法精密度引入的不確定度。若缺少常規(guī)樣品，檢測實(shí)驗(yàn)室可選用有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)評(píng)定測量不確定度，但積累了足量的滿足要求的常規(guī)樣品后，要重新評(píng)定測量方法精密度引入的不確定度。一旦實(shí)驗(yàn)室對特定標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行了方法精密度不確定度評(píng)定，實(shí)驗(yàn)室建立的方法精密度不確定度評(píng)定公式（公式（7））及數(shù)值（公式（12））可用于后續(xù)試樣定量檢測結(jié)果的不確定度評(píng)定。但前提是試樣檢測結(jié)果是同一實(shí)驗(yàn)室在相同條件下獲得的，且用于檢測過程偏倚控制的陽性定量質(zhì)控品的檢測數(shù)據(jù)合格。

3.3 檢測實(shí)驗(yàn)室原則上用有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行偏倚控制

在定量檢測過程中，要設(shè)置陽性定量質(zhì)控品對檢測全過程進(jìn)行監(jiān)控，并根據(jù)陽性定量質(zhì)控品的數(shù)據(jù)評(píng)定檢測過程引入的偏倚不確定度[22]。原則上，檢測實(shí)驗(yàn)室應(yīng)該選擇有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為陽性定量質(zhì)控品，且有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)值要與轉(zhuǎn)基因定量標(biāo)識(shí)閾值相當(dāng)。由于目前我國的有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)還存在缺口，大部分轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品還沒有研制出相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。實(shí)驗(yàn)室在定量檢測過程中，會(huì)面臨缺乏有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的難題。在這種情況下，實(shí)驗(yàn)室只能自行配制轉(zhuǎn)基因含量與標(biāo)識(shí)閾值相當(dāng)?shù)姆勰悠坊蚧蚪MDNA樣品，作為定量檢測的陽性定量質(zhì)控品。對于實(shí)驗(yàn)室配制的質(zhì)控品，沒有認(rèn)證的不確定度，如果忽略陽性定量質(zhì)控品引入的偏倚不確定度，試樣的測量不確定度將會(huì)被嚴(yán)重低估。因此本研究提出了實(shí)驗(yàn)室配制質(zhì)控品標(biāo)稱值不確定度的評(píng)定方法（公式（15）—（17）），考慮到檢測實(shí)驗(yàn)室的可操作性，對不確定度評(píng)定過程進(jìn)行了一定的簡化處理。粉末質(zhì)控品未考慮含水量差異、均勻性、穩(wěn)定性等因素引入的不確定度；基因組DNA質(zhì)控品未考慮用數(shù)字PCR測量拷貝數(shù)濃度過程中微滴體積差異、微滴識(shí)別，以及均勻性、穩(wěn)定性等因素引入的不確定度。與有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)相比，實(shí)驗(yàn)室評(píng)定的配制樣品標(biāo)稱值的不確定度偏低，因此，實(shí)驗(yàn)室在檢測過程中要優(yōu)選有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為陽性定量質(zhì)控品。

4 結(jié)論

基于我國的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)體系建設(shè)情況，建立了轉(zhuǎn)基因定量檢測結(jié)果“自上而下”的不確定度評(píng)定方法。在評(píng)定測量方法精密度引入的不確定度時(shí)，用有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)評(píng)定會(huì)低估測量不確定度，檢測實(shí)驗(yàn)室要優(yōu)先選擇用常規(guī)樣品評(píng)定測量方法精密度引入的不確定度。在評(píng)定偏倚不確定度時(shí)，原則上要選擇有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作陽性定量質(zhì)控品，在沒有有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的情況下，允許用實(shí)驗(yàn)室配制樣品作陽性定量質(zhì)控品，但實(shí)驗(yàn)室要自行評(píng)定實(shí)驗(yàn)室配制樣品標(biāo)稱值的標(biāo)準(zhǔn)不確定度?？紤]到一般檢測實(shí)驗(yàn)室的可操作性，提出了標(biāo)稱值標(biāo)準(zhǔn)不確定度的簡易評(píng)定方法，雖然評(píng)定的標(biāo)稱值標(biāo)準(zhǔn)不確定度偏低，但合成后評(píng)定的偏倚不確定度與有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)相近。每個(gè)檢測實(shí)驗(yàn)室都要根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室的檢測數(shù)據(jù)評(píng)定自己的測量不確定度水平。在重復(fù)試驗(yàn)條件下，實(shí)驗(yàn)室評(píng)定的測量方法精密度不確定度可用于后續(xù)試樣定量檢測結(jié)果的不確定度評(píng)定，但隨著檢測數(shù)據(jù)的積累，檢測實(shí)驗(yàn)室要定期更新測量不確定度評(píng)定數(shù)據(jù)，讓測量不確定度準(zhǔn)確反映實(shí)驗(yàn)室當(dāng)前的測量水平。

[1] 焦悅, 王智, 張振民, 彭萱子, 付海濱, 朱鵬宇, 黃春蒙, 張永江, 付偉. 基于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品成分低水平混雜問題探究我國轉(zhuǎn)基因閾值制度. 中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào), 2022, 24(3): 20-27.

JIAO Y, WANG Z, ZHANG Z M, PENG X Z, FU H B, ZHU P Y, HUANG C M, ZHANG Y J, FU W. Research on the transgenic threshold system in China based on low-level presence of genetically modified products. Journal of Agricultural Science and Technology, 2022, 24(3): 20-27. (in Chinese)

[2] TRANBERG J. Developing a policy for low-level presence (LLP): a Canadian case study. AgBioForum, 2013, 16: 37-45.

[3] 徐麗麗, 李寧, 田志宏. 轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品低水平混雜問題研究. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(社會(huì)科學(xué)版), 2012, 29(2): 125-132.

XU L L, LI N, TIAN Z H. Analysis on the low level presence of genetically modified product. Journal of China Agricultural University (Social Sciences), 2012, 29(2): 125-132. (in Chinese)

[4] International Organization for Standardization (ISO), International Electrotechnical Commission (IEC). International vocabulary of metrology—Basic and general concepts and associated terms (VIM), ISO/IEC Guide 99:2007, https://www.iso.org/standard/45324.html. [2022-04-07].

[5] INFUSINO I, PANTEGHINI M. Measurement uncertainty: Friend or foe? Clinical Biochemistry, 2018, 57: 3-6.

[6] International Organization for Standardization (ISO), International Electrotechnical Commission (IEC). Uncertainty of measurement— Part 4: Role of measurement uncertainty in conformity assessment. ISO/IEC Guide 98-4:2012. https://www.iso.org/standard/50465.html.

[7] International Organization for Standardization (ISO), International Electrotechnical Commission (IEC). Uncertainty of measurement— Part 3: Guide to the expression of uncertainty in measurement (GUM:1995), ISO/IEC Guide 98-3:2008. https://www.iso.org/standard/ 50461.html. [2022-04-07].

[8] GB/T 27418—2017. 測量不確定度評(píng)定和表示. 北京: 中國標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2017: 1-77.

GB/T 27418—2017.Guide to the evaluation and expression of uncertainty in measurement. Beijing: China Standards Press, 2017: 1-77. (in Chinese)

[9] 葉培德, 趙峰, 施昌彥, 原遵東, 沙定國, 周桃庚, 陳紅. 測量不確定度評(píng)定與表示, JJF1059.1-2012. 北京: 中國質(zhì)檢出版社, 2012: 1-56.

YE P D, ZHAO F, SHI C Y, YUAN Z D, SHA D G, ZHOU T G, CHEN H. Evaluation and expression of uncertainty in measurement, JJF1059.1- 2012. Beijing: China Quality Inspection Press, 2012: 1-56. (in Chinese)

[10] FARRANCE I, BADRICK T, FRENKEL R. Uncertainty in measurement and total error: different roads to the same quality destination? Clinical Chemistry and Laboratory Medicine, 2018, 56(12): 2010-2014.

[11] DABALUS ISLAM M, SCHWEIKERT TURCU M, CANNAVAN A. Comparison of methods for the estimation of measurement uncertainty for an analytical method for sulphonamides. Food Additives & Contaminants Part A, Chemistry, Analysis, Control, Exposure & Risk Assessment, 2008, 25(12): 1439-1450.

[12] RIGO-BONNIN R, BLANCO-FONT A, CANALIAS F. Different top-down approaches to estimate measurement uncertainty of whole blood tacrolimus mass concentration values. Clinical Biochemistry, 2018, 57: 56-61.

[13] MORGADO V, PALMA C, BETTENCOURT DA SILVA R J N. Bottom-up evaluation of the uncertainty of the quantification of microplastics contamination in sediment samples. Environmental Science & Technology, 2022, 56(15): 11080-11090.

[14] FARRANCE I, FRENKEL R. Uncertainty of measurement: a review of the rules for calculating uncertainty components through functional relationships. The Clinical Biochemist Reviews, 2012, 33(2): 49-75.

[15] WHITE G H, FARRANCE I, AACB Uncertainty of Measurement Working Group. Uncertainty of measurement in quantitative medical testing: a laboratory implementation guide. The Clinical Biochemist Reviews, 2004, 25(4): S1-S24.

[16] FRENKEL R B, FARRANCE I. Uncertainty in measurement: procedures for determining uncertainty with application to clinical laboratory calculations. Advances in Clinical Chemistry, 2018, 85: 149-211.

[17] SOUSA J A, BATISTA E, DEMEYER S, FISCHER N, PELLEGRINO O, RIBEIRO A S, MARTINS L L. Uncertainty calculation methodologies in microflow measurements: Comparison of GUM, GUM-S1 and Bayesian approach. Measurement, 2021, 181: 109589.

[18] GIECHASKIEL B, L?HDE T, MELAS A D, VALVERDE V, CLAIROTTE M. Uncertainty of laboratory and portable solid particle number systems for regulatory measurements of vehicle emissions. Environmental Research, 2021, 197: 111068.

[19] FARRANCE I, BADRICK T, FRENKEL R. Uncertainty in measurement: A review of the procedures for determining uncertainty in measurement and its use in deriving the biological variation of the estimated glomerular filtration rate. Practical Laboratory Medicine, 2018, 12: e00097.

[20] International Organization for Standardization (ISO). Guidance for the use of repeatability, reproducibility and trueness estimates in measurement uncertainty estimation. ISO/TS 21748:2004. https:// www.iso.org/standard/34686.html. [2022-04-07]

[21] 王斗文, 陳玉忠, 于振凡, 張帆, 楊軍, 王海鷹, 丁文興, 宋桂蘭, 曾澤. 利用重復(fù)性、再現(xiàn)性和正確度的估計(jì)值評(píng)估測量不確定度的指南. GB/Z 22553-2010. 北京: 中國標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2010: 1-20.

WANG D W, CHEN Y Z, YU Z F, ZHAGN F, YANG J, WANG H Y, DING W X, SONG G L, ZENG Z. Guidance for the use of repeatability, reproducibility and trueness estimates in measurement uncertainty estimation. GB/Z 22553-2010. Beijing: Standards Press of China, 2010:1-20. (in Chinese)

[22] TRAPMANN S, BURNS M, CORBISIER P, GATTO F, ROBOUCH P, SOWA S, EMONS H. Guidance document on Measurement Uncertainty for GMO Testing Laboratories 3rd Edition, EUR 30248 EN, Publications Office of the European Union, Luxembourg, 2020, ISBN 978-92-76-19432-3, doi:10.2760/738565, JRC120898.

[23] MARTINELLO F, SNOJ N, SKITEK M, JERIN A. The top-down approach to measurement uncertainty: which formula should we use in laboratory medicine? Biochemia Medica, 2020, 30(2): 020101.

[24] LEE J H, CHOI J H, YOUN J S, CHA Y J, SONG W, PARK A J. Comparison between bottom-up and top-down approaches in the estimation of measurement uncertainty. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine, 2015, 53(7): 1025-1032.

[25] 國家市場監(jiān)督管理總局認(rèn)可與檢驗(yàn)檢測監(jiān)督管理局. 檢驗(yàn)檢測機(jī)構(gòu)資質(zhì)評(píng)審準(zhǔn)則. https://www.samr.gov.cn/rkjcs/tzgg/202201/t20220128_ 339457.html. [2023-01-11].

State Administration for Market Regulation, Administration for Accreditation, Inspection and Testing Supervision. Qualification evaluation criteria for inspection and testing institutions. https:// www.samr.gov.cn/rkjcs/tzgg/202201/t20220128_339457.html. [2023- 01-11]. (in Chinese)

[26] INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION (ISO). General requirements for the competence of testing and calibration laboratories, ISO17025-2017. https://www.iso.org/standard/ 66912.html. [2022-04-07].

[27] 梁新苗, 蔡穎, 郭錚蕾, 李宏, 饒紅, 駱衛(wèi)峰, 周廣彪, 韓玥, 馬丹, 徐姍, 劉若思. 轉(zhuǎn)基因檢測實(shí)驗(yàn)室測量不確定度評(píng)估指南, SN/T 4562-2016. 北京: 中國標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2016: 1-22.

LIANG X M, CAI Y, GUO Z L, LI H, RAO H, LUO W F, ZHOU G B, HAN Y, MA D, XU S, LIU R S. Guidance on measurement uncertainty for GMO testing laboratories, SN/T 4562-2016. Beijing: Standards Press of China, 2016:1-22. (in Chinese)

[28] 高運(yùn)華, 張秀杰, 李亮, 李夏瑩, 金蕪軍, 劉衛(wèi)曉, 王迪, 梅英婷. 轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測轉(zhuǎn)基因成分定量檢測結(jié)果不確定度評(píng)定與表示, 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第423號(hào)—10—2021. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 2021: 1-9.

GAO Y H, ZHANG X J, LI L, LI X Y, JIN W J, LIU W X, WANG D, MEI Y T. Detection of genetically modified plants and derived products— Guidance on measurement uncertainty for GMO testing results, Announcement of Ministry of Agriculture and Rural Affairs 423-10-2021. Beijing: Agriculture press of China, 2021: 1-9. (in Chinese)

[29] LI J, GAO H F, LI Y J, XIAO F, ZHAI S S, WU G, WU Y H. Event-specific PCR methods to quantify the genetically modified DBN9936 maize. Journal of Food Composition and Analysis, 2022, 105: 104236.

[30] THOMPSON M, MATHIESON K, DAMANT A P, WOOD R. A general model for interlaboratory precision accounts for statistics from proficiency testing in food analysis. Accreditation and Quality Assurance, 2008, 13(4/5): 223-230.

[31] BURNS M, VALDIVIA H. A procedural approach for the identification of sources of uncertainty associated with GM quantification and real-time quantitative PCR measurements. European Food Research and Technology, 2007, 226(1/2): 7-18.

Development and application of top-down approaches for estimating measurement uncertainty of GMO quantitative results

LI Jun1, Zhao Xin2, CHEN Hong3, LI FeiWu4, Liang JinGang3, LI YunJing1, Wang HaoQian3, GAO HongFei1, Zhang Hua3, CHEN ZiYan3, WU Gang1, SHEN Ping3, XU LiQun3,WU YuHua1

1Oil Crops Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of agricultural genetically modified organism traceability, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Wuhan 430062;2Tianjin Academy of Agricultural Sciences, Tianjin 300384;3Development Center of Science and Technology, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Beijing 100025;4Jilin Academy of Agricultural Sciences, Changchun 130033

【Objective】The enforcement of labeling regulations on genetically modified organisms (GMOs) requires establishing a standard system for accurate quantification of GMOs that includes the standard or guide for estimating measurement uncertainty (MU). It is urgent to establish a standardized top-down approach for estimating MU of quantitative results, which is conveniently adopted by the general testing laboratories. 【Method】There are two approaches for estimating the MU introduced by precision of quantitative method, one is to establish the equation of MU estimation using data obtained on 15 routine samples based on the "uncertainty function", the other is to evaluate the MU by repeatedly measuring a certified reference material (CRM) and calculating the intermediate precision. The uncertainty introduced by bias is evaluated using a CRM or a sample prepared by laboratory as bias control. The uncertainty of the nominal value of the sample prepared by laboratory is evaluated by using a simplified program based on the preparation process. The MU contributed by method precision and bias are combined into the standard uncertainty of the quantitative results, and then multiplied by the coverage factorto obtain the expanded uncertainty. 【Result】The event-specific PCR method of genetically modified maize DBN9936 was took as an example. The MU of method precision was evaluated to be 0.76% using simulated DBN9936 routine samples, and to be 0.33% using a CRM (GBW (E) 100901). Compared with routine samples, the MU of method precision evaluated using a CRM is significantly underestimated. The uncertainty introduced by bias was evaluated to be 0.26% using a CRM (GBW (E) 100901) as a bias control. Using a laboratory prepared powder sample and a genomic DNA sample (nominal values of 3.0%) as bias control, the bias uncertainty was evaluated to be 0.20% and 0.19%, respectively. Since the simplified program ignored some uncertainty components, the uncertainty of the nominal value of laboratory prepared samples was estimated to be smaller. By combining the MU of method precision and bias, the expanded uncertainty using routine samples was obtained to be 1.26%, 1.20%, and 1.20%, respectively, the expanded uncertainty using a CRM was 0.84%, 0.78%, and 0.76%, respectively. 【Conclusion】This study established the top-down approaches for MU estimation of quantitative results, testing laboratories should prioritize routine samples to estimate the MU contributed by the method precision, and select CRMs as bias control in principle to evaluate bias uncertainty during GMO quantification.

quantitative results of GMO content; measurement uncertainty; top-down approach; certified reference materials; bias control

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.22.002

2023-04-30；

2023-07-27

科技創(chuàng)新2030—重大項(xiàng)目（2022ZD0402010）

李俊，E-mail：lijuner@caas.cn。通信作者徐利群，E-mail：gmotest@126.com。通信作者武玉花，E-mail：wuyuhua@oilcrops.cn

（責(zé)任編輯 李莉）