曹志威 武曉蓉 邵國(guó) 趙志軍 張春陽(yáng)

骨的再生修復(fù)一直是個(gè)世界性難題。骨骼具有很強(qiáng)的再生能力，具體表現(xiàn)在損傷（骨折）修復(fù)期間，以及成年后的骨骼發(fā)育和持續(xù)重塑過(guò)程中[1]。大量研究表明，骨修復(fù)與骨發(fā)育過(guò)程相似，其機(jī)制十分復(fù)雜，涉及多種細(xì)胞類型和細(xì)胞內(nèi)外分子信號(hào)通路[2-3]。骨不連、骨缺損或骨溶解等是臨床上常見(jiàn)的再生修復(fù)類型，目前治療手段非常有限，此類疾病都是因骨細(xì)胞分化成熟過(guò)程出現(xiàn)問(wèn)題引起的。因此，在體外選取一種成骨細(xì)胞模型來(lái)探究骨生長(zhǎng)及再生修復(fù)的分子機(jī)制是十分有必要的。

MC3T3-E1細(xì)胞（小鼠顱頂前骨細(xì)胞）是最常用的成骨樣細(xì)胞系之一，通常情況下，MC3T3-E1細(xì)胞在含抗壞血酸、β-甘油磷酸鈉和地塞米松等誘導(dǎo)因子的培養(yǎng)基中能夠很好地向成骨細(xì)胞分化[4]，重現(xiàn)體內(nèi)成骨細(xì)胞的生長(zhǎng)周期。該細(xì)胞現(xiàn)已被發(fā)展為研究細(xì)胞分化調(diào)節(jié)、細(xì)胞因子和激素調(diào)節(jié)、基質(zhì)蛋白的合成和分泌、骨骼疾病的分子機(jī)制和藥物藥代動(dòng)力學(xué)的理想模型[5-9]。近年來(lái)，MC3T3-E1細(xì)胞培養(yǎng)也發(fā)展到對(duì)新型生物材料的細(xì)胞相容性和成骨活性方面的評(píng)估[10-11]。

本文就MC3T3-E1細(xì)胞成骨模型的培養(yǎng)、鑒定及應(yīng)用等方面進(jìn)行綜述。以期明確MC3T3-E1細(xì)胞成骨模型的研究方向，并提出幾點(diǎn)新見(jiàn)解。

1 體外培養(yǎng)

MC3T3-E1細(xì)胞取自新生小鼠顱頂骨，是一種貼壁生長(zhǎng)的成纖維細(xì)胞[12]。該細(xì)胞系有多個(gè)亞克隆，在含抗壞血酸培養(yǎng)基中的成骨分化與礦化能力各有不同[13]。MC3T3-E1亞克隆4和亞克隆14表現(xiàn)出高水平的成骨細(xì)胞分化能力，是當(dāng)前研究者們首選的成骨模型。

不同組分的培養(yǎng)基對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖和成骨的影響有所不同。維生素C（Vitamin C, VC）是抗壞血酸的L-對(duì)映體，是生物體不可缺少的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[14]。Ⅰzumiya等[15]比較了是否含VC的α-MEM或DMEM培養(yǎng)基對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖和成骨的影響，結(jié)果顯示無(wú)論細(xì)胞密度如何，α-MEM都會(huì)促進(jìn)細(xì)胞增殖，即使在不含VC的α-MEM中也是如此。此外，細(xì)胞在含或不含VC的DMEM培養(yǎng)基中增殖能力都明顯低于α-MEM培養(yǎng)基。這些結(jié)果表明VC并不是MC3T3-E1細(xì)胞的必需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，α-MEM似乎是此細(xì)胞培養(yǎng)的更優(yōu)選擇。在使用VC和β-甘油磷酸成骨誘導(dǎo)后，出現(xiàn)了一個(gè)有趣的現(xiàn)象[15]，在額外添加VC的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞鈣化程度明顯高于在α-MEM培養(yǎng)基中自帶VC培養(yǎng)的細(xì)胞，這或許是因?yàn)樯虡I(yè)α-MEM培養(yǎng)基中的VC失去了生物活性，而新鮮的VC發(fā)揮了重要作用。相反，使用DMEM作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基來(lái)誘導(dǎo)成骨，其效果并不明顯，在3周時(shí)幾乎沒(méi)有鈣化。

上述研究表明，用于培養(yǎng)MC3T3-E1細(xì)胞的兩種主要培養(yǎng)液α-MEM和DMEM在增殖、成骨和鈣化等方面存在很大差異，這些差異影響了生物材料的評(píng)估，即使評(píng)估相同的材料，也可能產(chǎn)生不同的結(jié)果。目前大部分實(shí)驗(yàn)對(duì)于該細(xì)胞的培養(yǎng)及成骨誘導(dǎo)所使用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基都是α-MEM，如何優(yōu)化培養(yǎng)基的成骨效果是研究者們下一步的研究方向。

2 鑒定方法

2.1 細(xì)胞形態(tài)

MC3T3-E1細(xì)胞在使用基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí)形態(tài)與成纖維細(xì)胞類似，呈梭形，而進(jìn)行成骨誘導(dǎo)后細(xì)胞逐漸伸展呈多角形，并伸出多個(gè)樹(shù)枝狀突起，胞體和胞核逐漸變大[16]。大部分研究鑒定該成骨模型時(shí)未將細(xì)胞形態(tài)納入其評(píng)價(jià)指標(biāo)，這些學(xué)者認(rèn)為細(xì)胞形態(tài)與細(xì)胞狀態(tài)、代數(shù)及培養(yǎng)基的不同都有關(guān)系，甚至不同人培養(yǎng)出來(lái)的細(xì)胞形態(tài)可能都會(huì)略有差異，故單從細(xì)胞形態(tài)來(lái)判斷MC3T3-E1細(xì)胞成骨模型建立是否成功沒(méi)有意義。

形態(tài)決定功能，盡管細(xì)胞形態(tài)對(duì)于MC3T3-E1細(xì)胞成骨的鑒定沒(méi)有太大幫助，但對(duì)細(xì)胞成骨前后的形態(tài)對(duì)比研究可能會(huì)揭示細(xì)胞的某些功能。

2.2 堿性磷酸酶活力檢測(cè)

堿性磷酸酶（alkaline phosphatase, ALP）是成骨細(xì)胞的標(biāo)志性酶，在MC3T3-E1細(xì)胞成骨早期產(chǎn)生，很容易在細(xì)胞表面找到[17]。文獻(xiàn)報(bào)道，MC3T3-E1細(xì)胞的ALP活力隨著成骨誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加[18]。

目前檢測(cè)成骨細(xì)胞中ALP表達(dá)的主要技術(shù)有基因檢測(cè)法、染色法和活力檢測(cè)法。傳統(tǒng)的ALP活力檢測(cè)基本原理是在特定條件下，ALP可以將底物對(duì)-硝基苯磷酸鹽（Para-nitrophenyl phosphate, PNPP）分解成對(duì)-硝基苯酚（p-Nitrophenol, PNP）和磷酸鹽，通過(guò)測(cè)定PNP的吸光度來(lái)間接反映ALP的活力[19]。雖然該方法已廣泛應(yīng)用于成骨細(xì)胞的鑒定，但仍存在靈敏度低、干擾強(qiáng)、可能出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果等問(wèn)題。在過(guò)去的幾年里，隨著光學(xué)、電化學(xué)及熒光探針等新興材料的出現(xiàn)[20-21]，各種ALP活性分析方法得到了蓬勃發(fā)展。這將為檢測(cè)ALP活性提供更多潛在的原則和策略。

2.3 礦化結(jié)節(jié)染色

礦化結(jié)節(jié)是MC3T3-E1細(xì)胞分化成熟的標(biāo)志[22]，同時(shí)也是其行使成骨功能的主要形態(tài)學(xué)表現(xiàn)。正常成骨條件下，細(xì)胞在培養(yǎng)至第14天后會(huì)有少量礦化結(jié)節(jié)形成，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，礦化結(jié)節(jié)逐漸增加[23]，且在一些促成骨藥物的作用下，礦化結(jié)節(jié)也可提前出現(xiàn)。

目前實(shí)現(xiàn)商品化的礦化結(jié)節(jié)染色方法包括Von Kossa法、茜素紅S法和四環(huán)素法[24-26]。Von Kossa法是礦化結(jié)節(jié)染色的經(jīng)典方法，但由于其特異性較差，在成骨培養(yǎng)中觀察到的陽(yáng)性染色可能不僅僅是羥基磷酸鈣結(jié)節(jié)，也有可能是某些來(lái)源不明的營(yíng)養(yǎng)不良礦化[27]，現(xiàn)在大多數(shù)實(shí)驗(yàn)均不使用此方法。茜素紅S法是檢測(cè)礦化結(jié)節(jié)的最常用方法，它是一種蒽醌類衍生物，作為陰離子染料，能夠與鈣離子以螯合方式形成橘紅色或紫紅色復(fù)合物[24]。值得一提的是，茜素紅并不是鈣特異性染料，會(huì)受到其他金屬離子（如鎂、錳、鋇、鍶等）的干擾，但是這些離子含量往往很低，因此并不會(huì)影響最終的染色結(jié)果。與Von Kossa法相比，茜素紅S法的優(yōu)勢(shì)在于對(duì)少量的礦化結(jié)節(jié)能夠得到更可靠的結(jié)果。此外，四環(huán)素可以與礦化結(jié)節(jié)中的鈣離子螯合并形成熒光的磷酸復(fù)合物，這一特性使得四環(huán)素也可用來(lái)檢測(cè)成骨過(guò)程中的礦化情況[25]。

除上述三種染色方法外，研究者們還嘗試?yán)酶鞣N熒光染料對(duì)礦化結(jié)節(jié)進(jìn)行檢測(cè)，Querido等[28]首次證實(shí)Giemsa可作為體外礦化結(jié)節(jié)的熒光染料。掃描電鏡通常用于觀察骨的膠原結(jié)構(gòu)，而廖乃順等[29]首次利用掃描電鏡來(lái)觀察成骨細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)的形態(tài)結(jié)構(gòu)，雖然該方法可更加精確地顯示礦化結(jié)節(jié)的數(shù)量及微觀結(jié)構(gòu)，且具有一定的新穎性，但此方法成本較大，不利于推廣。

2.4 成骨相關(guān)基因檢測(cè)

在MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化過(guò)程中，許多基因參與其中，如矮小相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（runt-related transcription factor 2, Runx2）、ALP、骨鈣素（osteocalcin, OCN）和骨橋蛋白（osteopontin, OPN）等。利用蛋白印跡法和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)等技術(shù)手段檢測(cè)這些基因的表達(dá)，往往也可作為一種佐證來(lái)判斷細(xì)胞是否成骨。正常成骨條件下，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，成骨相關(guān)基因的表達(dá)也隨之增加。但細(xì)胞和培養(yǎng)基的不同可能會(huì)使部分基因的表達(dá)出現(xiàn)略微差異。

在MC3T3-E1細(xì)胞正常成骨誘導(dǎo)過(guò)程中，成骨相關(guān)基因的表達(dá)在14天前大致呈上升趨勢(shì)[23]。茜素紅染色礦化結(jié)節(jié)也在該時(shí)間節(jié)點(diǎn)出現(xiàn)，說(shuō)明在此之后細(xì)胞可能已經(jīng)分化成熟。因此做成骨相關(guān)研究時(shí)，選取成骨誘導(dǎo)14天前的細(xì)胞較為合適。若培養(yǎng)周期過(guò)長(zhǎng)，細(xì)胞污染幾率和時(shí)間成本也會(huì)增加。

3 細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境

MC3T3-E1細(xì)胞通常在體外二維微環(huán)境中培養(yǎng)。然而，該培養(yǎng)環(huán)境與成骨細(xì)胞的組織內(nèi)環(huán)境非常不同，不能完全模擬體內(nèi)骨環(huán)境。三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是一種新穎的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，可以通過(guò)支架或特殊裝置模擬細(xì)胞在體內(nèi)的生長(zhǎng)狀態(tài)[30]。水凝膠能模擬天然細(xì)胞外基質(zhì)的生物化學(xué)和力學(xué)環(huán)境，已被廣泛用于細(xì)胞培養(yǎng)和組織工程。Ⅰ型膠原是骨骼細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，其為成骨細(xì)胞提供了一個(gè)良好的培養(yǎng)環(huán)境。已經(jīng)證明，在3D膠原凝膠中培養(yǎng)細(xì)胞會(huì)影響細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞間相互作用和對(duì)可溶性因子的反應(yīng)[31]。Matthews等[32]將MC3T3-E1細(xì)胞接種于3D Ⅰ型膠原凝膠中，并與2D凝膠中培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，前者礦化結(jié)節(jié)及成骨細(xì)胞標(biāo)志基因的上調(diào)出現(xiàn)較早。此外，有研究團(tuán)隊(duì)研發(fā)出了3D羥基磷灰石（HAP）-多肽雜化水凝膠[33]，該水凝膠具有良好的生物相容性、機(jī)械穩(wěn)定性及低細(xì)胞毒性等特點(diǎn)，可長(zhǎng)期用于細(xì)胞培養(yǎng)。

利用MC3T3-E1細(xì)胞來(lái)研究成骨細(xì)胞在體外的生物學(xué)變化成為當(dāng)前的熱點(diǎn)。微重力（microgravity, MG）和輻射（radiation, RA）是太空中的主要環(huán)境因素[34]，對(duì)人體尤其是骨組織有多種影響。Dong等[35]模擬微重力和X射線單獨(dú)或聯(lián)合作用MC3T3-E1細(xì)胞，與對(duì)照組相比，細(xì)胞活性降低，成骨相關(guān)基因Runx2表達(dá)降低。等離子體能夠產(chǎn)生多種生物活性物質(zhì)，特別是活性氧（reactive oxygen species,ROS），各種實(shí)驗(yàn)表明ROS可以影響細(xì)胞活性[36]。Tominami等[37]證明短期適當(dāng)?shù)牡入x子體照射可促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞分化，且不會(huì)對(duì)細(xì)胞造成損傷，但其潛在機(jī)制仍不清楚。

隨著人們對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境的研究進(jìn)一步深入，越來(lái)越多骨骼疾病的發(fā)病機(jī)制被揭示。通過(guò)模擬不同情境下體內(nèi)骨細(xì)胞所處的微環(huán)境來(lái)探究某些疾病的發(fā)病機(jī)制已成為現(xiàn)階段的研究熱點(diǎn)。

4 細(xì)胞模型的體外應(yīng)用及優(yōu)劣勢(shì)

骨質(zhì)疏松癥是一種以骨折風(fēng)險(xiǎn)增加、骨量減少和骨結(jié)構(gòu)紊亂為特征的全身代謝性骨骼疾病[38]。成骨細(xì)胞是骨的主要成分，對(duì)骨的發(fā)育和形成至關(guān)重要。骨形成在很大程度上取決于成骨細(xì)胞的數(shù)量和活性，成骨細(xì)胞功能障礙是導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的直接原因[39]。因此，探索促進(jìn)成骨細(xì)胞活性和分化的方法可能有助于預(yù)防骨質(zhì)疏松。MC3T3-E1細(xì)胞成骨模型是其理想選擇之一。

顱骨缺損通常由創(chuàng)傷、感染、腫瘤、先天性畸形或骨骼疾病引起[40]，骨重建是目前最主流的治療方法。顱骨修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮主要作用的是前骨細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞，二者向成骨細(xì)胞的分化能夠幫助缺損部位的快速修復(fù)。組織工程技術(shù)在近幾年發(fā)展迅速，一種典型方式是將合適的種子細(xì)胞和生長(zhǎng)因子添加到可降解的多孔支架中[41]。MC3T3-E1細(xì)胞作為前骨細(xì)胞，在體外成骨后與支架結(jié)合能促進(jìn)缺損部位的骨修復(fù)。

牙齒脫落后會(huì)導(dǎo)致牙槽骨的破壞和吸收減少[42]。這可能會(huì)給后期恢復(fù)拔除部位的美觀和功能帶來(lái)困難。目前最可靠、最有效的治療方法是用植骨材料填充拔牙后的缺損區(qū)[43]。利用體外實(shí)驗(yàn)尋找一種促成骨因子或藥物是當(dāng)下研究的熱點(diǎn)，不少研究者選擇MC3T3-E1細(xì)胞作為體外實(shí)驗(yàn)的種子細(xì)胞。

原代培養(yǎng)的成骨細(xì)胞可以很好地模擬體內(nèi)成骨過(guò)程[44]，但存在增殖能力差、培養(yǎng)時(shí)間受限、轉(zhuǎn)染效率低等問(wèn)題，在骨組織工程的應(yīng)用方面受到了限制。研究者們開(kāi)發(fā)出了多種成骨細(xì)胞系，其中包括骨樣細(xì)胞MLO-Y4、骨肉瘤細(xì)胞MG-63、前骨細(xì)胞MC3T3-E1等。MC3T3-E1細(xì)胞的生物學(xué)功能與原代培養(yǎng)的成骨細(xì)胞最為接近，其增殖能力強(qiáng)、能無(wú)限傳代，并且作為成骨細(xì)胞的前體，可用于研究細(xì)胞的整個(gè)成骨過(guò)程。而其他成骨細(xì)胞系雖能無(wú)限傳代，但由于其取自成熟的骨細(xì)胞或瘤樣細(xì)胞，部分生物學(xué)特性與原代培養(yǎng)的成骨細(xì)胞略有不用，故不作為細(xì)胞成骨模型的首選。所以，在當(dāng)前骨組織工程的大背景下，MC3T3-E1細(xì)胞被廣泛地用于研究成骨細(xì)胞的分化、增殖和分子機(jī)制，并且作為眾多疾病的靶細(xì)胞類型的首選。

盡管MC3T3-E1細(xì)胞是一種幾乎能替代原代人成骨細(xì)胞的體外模型，適用于各研究領(lǐng)域，但在臨床轉(zhuǎn)化方面，最令人擔(dān)憂的是物種差異，有一定的局限性。因此，應(yīng)謹(jǐn)慎推斷結(jié)果，根據(jù)具體研究情況得出結(jié)論。另外，目前商業(yè)化的MC3T3-E1細(xì)胞系來(lái)源于新生小鼠的顱頂骨，而在現(xiàn)階段的大部分研究中，MC3T3-E1細(xì)胞系多應(yīng)用于四肢骨的研究，顱頂骨的生長(zhǎng)方式以膜內(nèi)成骨為主，而四肢骨則以軟骨內(nèi)成骨為主，二者的生長(zhǎng)方式不一樣，當(dāng)MC3T3-E1細(xì)胞應(yīng)用于四肢骨的成骨過(guò)程研究時(shí)所得出的結(jié)論是否嚴(yán)謹(jǐn)需要進(jìn)一步討論。

5 展望

合適的細(xì)胞模型有助于更好地了解所涉及的生理、病理和再生過(guò)程。MC3T3-E1細(xì)胞是一種前骨細(xì)胞，其在早期具有較強(qiáng)的增殖、礦化和分化能力，已被廣泛用于研究成骨細(xì)胞在體外的生物學(xué)變化。必須指出的是，許多因素可以影響MC3T3-E1細(xì)胞的生長(zhǎng)，例如，用于細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基及其添加劑、細(xì)胞接種密度及培養(yǎng)系統(tǒng)本身，這可能會(huì)導(dǎo)致不同的結(jié)果。長(zhǎng)期以來(lái)，單層培養(yǎng)一直是MC3T3-E1細(xì)胞體外培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)方法。但這不能反映自然條件下的骨生長(zhǎng)，因此人們對(duì)建立一個(gè)更接近細(xì)胞自然環(huán)境的細(xì)胞系統(tǒng)更感興趣。研究表明，在3D系統(tǒng)中培養(yǎng)的細(xì)胞，與普通培養(yǎng)的細(xì)胞有很大的差異，其更能體現(xiàn)細(xì)胞的真實(shí)狀態(tài)，這將會(huì)是未來(lái)研究的重點(diǎn)。此外，許多研究已經(jīng)將MC3T3-E1細(xì)胞成骨模型用于生物材料的評(píng)估，并將注意力放在參與細(xì)胞成骨的信號(hào)通路上。隨著研究深入和其他技術(shù)的發(fā)展，有望擴(kuò)大其應(yīng)用前景。