羅小寧，張 羽，王釔力，王祥財(cái)

（贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤科，江西 贛州 341000）

肺鱗狀細(xì)胞癌（Squamous cell carcinoma，SCC）是非小細(xì)胞肺癌（Non-small cell lung cancer，NSCLC）中較常見(jiàn)的病理亞型，約占NSCLC 的30%[1］。盡管吸煙習(xí)慣的改變降低了SCC 的發(fā)病率，但仍缺乏有效的治療方案來(lái)改善肺SCC 患者的預(yù)后[2］。近20 年來(lái)，鉑基雙體化療被認(rèn)為是肺SCC的標(biāo)準(zhǔn)一線(xiàn)治療方案。新的治療方法，主要包括貝伐單抗、間變淋巴瘤激酶（Anaplastic lymphoma kinase，ALK）抑制劑、EGFR 酪氨酸激酶抑制劑等，顯著提高了腺癌患者的總生存期，但對(duì)肺SCC 患者的治療效果不明顯[3-4］。因此，尋求新的治療方法對(duì)肺SCC患者十分迫切。

自然殺傷細(xì)胞（Natural killer cell，NK cell）是機(jī)體內(nèi)重要的免疫細(xì)胞[5］。NK 細(xì)胞在沒(méi)有預(yù)先抗原致敏的情況下高效殺傷和產(chǎn)生細(xì)胞因子[6-7］。NK 細(xì)胞功能可受不同信號(hào)通路的調(diào)控[8］。ADAM17 是metzincin 金屬蛋白酶超家族的adamalysin 亞家族的成員，它含有一個(gè)保守的蛋氨酸氨基酸，同時(shí)含有毗鄰蛋白酶催化區(qū)域的鋅結(jié)合基元[9］。ADAM17已被證明在癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)，并導(dǎo)致癌細(xì)胞釋放EGFR 配體和黏附分子，促進(jìn)生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[10］。綜上所述，下調(diào)ADAM17 活性可能以直接和間接的方式抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和存活[11］。有研究[12］報(bào)道了人類(lèi)NK細(xì)胞表達(dá)ADAM17，并且NK細(xì)胞中ADAM17的過(guò)度激活可能會(huì)導(dǎo)致CD16 和CD62L 表達(dá)下調(diào)，進(jìn)而損害其效應(yīng)功能。但目前尚不清楚在肺SCC中抑制ADAM17 表達(dá)對(duì)NK 細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)及其功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料人NCI-H520 細(xì)胞株購(gòu)自ACTT 公司，Lipo 2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因醫(yī)學(xué)科技股份有限公司，NK 細(xì)胞激活擴(kuò)增試劑盒、磁性激活細(xì)胞分離（MACS）試劑盒、qRT-PCR 試劑盒購(gòu)自Thermo Fisher Scientific 公司，陰性對(duì)照siRNA、ADAM17 siRNA 由上海吉?jiǎng)P基因醫(yī)學(xué)科技股份有限公司合成，ADAM17、GAPDH 引物由上海生工生物工程有限公司合成，ADAM17、γ 干擾素（IFN-γ）、顆粒酶B（GraB）、穿孔素（PFP）、GAPDH 抗體購(gòu)自Affinity Biosciences LTD 公司，CCK-8 試劑購(gòu)自南京建成生物技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組將NCI-H520細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI1640 培養(yǎng)基中，細(xì)胞在培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)生長(zhǎng)到融合度為80%時(shí)進(jìn)行消化傳代。其中陰性對(duì)照組、ADAM17 下調(diào)組NCI-H520 細(xì)胞使用Lipo 2000 轉(zhuǎn)染試劑分別轉(zhuǎn)染nonsense siRNA、ADAM17 siRNA。

1.2.2 NK細(xì)胞制備取志愿者外周靜脈血10 mL，加入PBS 緩沖液，混勻后采用密度梯度離心法分離出單個(gè)核細(xì)胞，使用PBS 緩沖液進(jìn)行洗滌，按照MACS 試劑盒操作步驟分離出CD3-CD56+NK 細(xì)胞，按照NK細(xì)胞激活擴(kuò)增試劑盒操作步驟對(duì)NK細(xì)胞進(jìn)行激活擴(kuò)增，隨后對(duì)NK細(xì)胞使用含500 U·mL-1重組白細(xì)胞介素2的培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.2.3 qRT-PCR 檢 測(cè) 各 組NCI-H520 細(xì) 胞ADAM17 mRNA 表達(dá)分別提取各組細(xì)胞的總RNA，逆 轉(zhuǎn) 錄 合 成cDNA，采 用qRT-PCR 檢 測(cè)ADAM17 mRNA 表達(dá)水平。按表1 設(shè)計(jì)引物，使用2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 Western blotting 檢測(cè)各組NCI-H520 細(xì)胞中各種蛋白表達(dá)用BCA 法測(cè)定各組細(xì)胞的總蛋白質(zhì)濃度。配置樣品并將待測(cè)樣品加入加樣孔，將電壓設(shè)置為70 V 開(kāi)始電泳，待兩邊的Protein Marker分開(kāi)后將電壓調(diào)至120 V。將電流設(shè)置為200 mA進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，洗膜，一抗4 ℃孵育過(guò)夜，洗膜。二抗室溫孵育1 h，洗膜，免疫反應(yīng)化學(xué)發(fā)光法顯色。

1.2.5 NK 細(xì)胞殺傷活性檢測(cè)各組按20∶1（NCI-H520 細(xì)胞∶NK 細(xì)胞）加入100 μL NK 細(xì)胞，同時(shí)設(shè)立相應(yīng)的空白對(duì)照組。孵育24 h 后，每孔加入CCK-8試劑20 μL，繼續(xù)孵育4 h后，于酶標(biāo)儀450 nm處檢測(cè)每孔光密度（OD）值，計(jì)算細(xì)胞生存率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理利用Graphad Prism 8.0 軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析。以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞ADAM17 mRNA 和蛋白表達(dá)與正常對(duì)照組相比，陰性對(duì)照組ADAM17 mRNA 和蛋白表達(dá)無(wú)明顯差異，ADAM17 下調(diào)組ADAM17 mRNA 和蛋白表達(dá)顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（圖1）。提示ADAM17 低表達(dá)的NCI-H520細(xì)胞系構(gòu)建成功。

圖1 各組細(xì)胞ADAM17 mRNA和蛋白表達(dá)

2.2 NK 細(xì)胞對(duì)各組NCI-H520 細(xì)胞生存率的影響與正常對(duì)照組相比，陰性對(duì)照組NCI-H520 細(xì)胞生存率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而ADAM17 下調(diào)組NCI-H520細(xì)胞生存率明顯降低（P＜0.01）（圖2）。

圖2 NK細(xì)胞對(duì)各組NCI-H520細(xì)胞生存率的影響

2.3 各組細(xì)胞IFN-γ、GraB、PFP 蛋白表達(dá)與正常對(duì)照組相比，陰性對(duì)照組IFN-γ、GraB、PFP蛋白表達(dá)均無(wú)明顯差異，ADAM17 下調(diào)組IFN-γ、GraB、PFP蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（圖3）。

圖3 各組細(xì)胞IFN-γ、GraB、PFP蛋白表達(dá)

3 討論

SCC 是一種高度異質(zhì)性的肺部惡性腫瘤，具有易突變、難治療的特點(diǎn)[13］，近年來(lái)，隨著免疫研究領(lǐng)域的發(fā)展，一些基于免疫治療的一線(xiàn)方案已進(jìn)入臨床[14］。NK 細(xì)胞是重要的免疫細(xì)胞之一，具有多種生物學(xué)功能，如抗腫瘤、抗病毒感染等，同時(shí)還與機(jī)體的自身免疫性疾病相關(guān)[15］。NK 細(xì)胞在殺死和產(chǎn)生細(xì)胞因子方面非常有效，無(wú)須預(yù)先抗原致敏。NK的功能反應(yīng)受到激活和抑制信號(hào)的嚴(yán)格調(diào)控[16］。MISHRA H K 等[17］報(bào)道了人類(lèi)NK 細(xì)胞可以表達(dá)ADAM17。ADAM17 最初被稱(chēng)為腫瘤壞死因子α 轉(zhuǎn)化酶，ADAM17 是跨膜蛋白酶的去整合素和金屬蛋白酶（ADAM）家族的成員，參與一些細(xì)胞膜蛋白的脫落和調(diào)節(jié)各種信號(hào)通路。有研究[18］表明，ADAM17在小鼠關(guān)節(jié)軟骨中的表達(dá)與關(guān)節(jié)炎的發(fā)展呈正相關(guān)，其缺失可減輕關(guān)節(jié)軟骨退化。此外，ADAM17與腎小球炎癥和纖維化有關(guān)，在糖尿病小鼠中，近端小管中的ADAM17 缺失改善了葡萄糖耐量，防止足細(xì)胞丟失，并抑制了腎小球巨噬細(xì)胞和膠原的積聚[19］。更重要的是，ADAM17參與了包括肺癌、卵巢癌、乳腺癌、胃癌和宮頸癌在內(nèi)的多種癌癥的發(fā)生和發(fā)展[20-24］。然而，關(guān)于這種金屬蛋白酶在腫瘤中的異常表達(dá)與其免疫調(diào)節(jié)之間的關(guān)系研究甚少。

當(dāng)NK 細(xì)胞活化后會(huì)產(chǎn)生大量的IFN-γ、GraB、PFP蛋白，這些蛋白在發(fā)揮免疫保護(hù)方面有重要作用。有研究[17］指出，抗ADAM17 單克隆抗體MEDI3622與腫瘤細(xì)胞結(jié)合后，能增強(qiáng)NK 細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞結(jié)合，進(jìn)而增強(qiáng)人NK 細(xì)胞的IFN-γ 釋放。本研究表明，在低表達(dá)ADAM17 后，IFN-γ、GraB、PFP 蛋白的表達(dá)量均顯著升高，這進(jìn)一步證明了在NCI-H520細(xì)胞中ADAM17 下調(diào)對(duì)NK 細(xì)胞有一定的激活作用，所以在肺SCC 細(xì)胞NCI-H520 中低表達(dá)ADAM17 后可顯著增強(qiáng)NK細(xì)胞對(duì)其的殺傷作用。

總之，ADAM17 調(diào)節(jié)90 多種底物，其中一些與腫瘤的形成和發(fā)展密切相關(guān)。此外，ADAM17還參與調(diào)控免疫蛋白及其底物介導(dǎo)的信號(hào)通路。ADAM17被認(rèn)為是治療腫瘤的主要靶點(diǎn)，但其免疫調(diào)節(jié)作用和機(jī)制尚不清楚。本研究證明了在肺SCC 細(xì)胞NCI-H520中ADAM17下調(diào)可促進(jìn)NK細(xì)胞對(duì)其的殺傷作用，可為后期肺SCC 尋找免疫治療靶點(diǎn)提供新的理論依據(jù)。