羅明明，張 暉，郭方曦，賈利娜，紀玉龍，王 琪

（1. 江西省腫瘤醫(yī)院，江西 南昌 330006；2. 贛南醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生與健康管理學(xué)院，江西 贛州 341000；3. 江西省衛(wèi)生健康事業(yè)發(fā)展中心，江西 南昌 330006）

膠質(zhì)瘤（Glioma）是顱內(nèi)腫瘤中最常見的惡性腫瘤，發(fā)病率占顱內(nèi)腫瘤首位，預(yù)后差、存活率低，目前治療膠質(zhì)瘤的主要手段是手術(shù)治療、化療和放療[1］，雖能在一定程度上延長患者生存時間，但由于膠質(zhì)瘤的耐藥性和易轉(zhuǎn)移性，患者預(yù)后依然較差，中位生存時間不足15 個月[2］。不僅如此，放化療等治療手段還會給患者帶來一系列不良反應(yīng)，影響患者生存質(zhì)量。因此，迫切需要新的治療手段和方法。近年來，中醫(yī)領(lǐng)域?qū)δz質(zhì)瘤的研究逐漸加深。中醫(yī)認為腦為髓之海，髓為腎精所化，故腦主要依賴腎之精血濡養(yǎng)，腎精血不足，頭腦失其所養(yǎng)，日久形成腦部腫瘤[3］。中醫(yī)治療膠質(zhì)瘤的方法包括中藥、針灸、推拿等，而以中藥治療為主。中藥具有活性成分多、可以增強患者免疫功能及不良反應(yīng)小等特點，已越來越多地被用于腫瘤的輔助治療中[4］。

在傳統(tǒng)的中藥中，黃芪具有悠久的藥用歷史，所含活性成分多，且具有補氣、止汗解毒、消腫、促進排尿的作用[5］，在臨床中應(yīng)用廣泛。異鼠李素作為黃芪活性成分之一，廣泛存在于自然界中，表現(xiàn)出抗炎、抗腫瘤、抗病毒、抗氧化應(yīng)激以及內(nèi)皮細胞保護等方面的功效[6］；而槲皮素作為黃芪中所富含的另一種成分，在多種中草藥中含量也很豐富，它是一種天然的小分子黃酮類化合物，具有包括抗氧化、抗腫瘤、降血糖、降血脂在內(nèi)的多種生物活性和藥理作用[7-9］。盡管黃芪含有多種成分，但目前關(guān)于這些成分對膠質(zhì)瘤的影響以及其作用機制仍不夠清楚，需要進一步研究。

近年來有學(xué)者[10］從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的角度提出了明確中藥與疾病有關(guān)的有效成分及可能機制的概念與方法：“網(wǎng)絡(luò)靶標”。作為一種新興方法，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)為探討中藥治療疾病的成分及其可能作用機制提供了新思路[11］。有研究[12-13］表明，運用分子對接、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)等方法能夠有效預(yù)測中藥的活性成分、作用靶點及作用機制，這為節(jié)約藥物開發(fā)成本提供了新思路，同時也為研究中醫(yī)藥的成分和機制提供了新途徑。

目前關(guān)于黃芪的活性成分治療膠質(zhì)瘤的研究較少，相應(yīng)的機制探討也較為缺乏。本研究擬通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)等技術(shù)來預(yù)測黃芪治療膠質(zhì)瘤的潛在作用靶點及作用機制，從中藥學(xué)角度為膠質(zhì)瘤的治療提供新的思路和方向。

1 材料與方法

通過篩選黃芪的化學(xué)成分及其作用靶點，確定膠質(zhì)瘤的相關(guān)靶點以獲取黃芪成分與膠質(zhì)瘤作用的靶標基因，在此基礎(chǔ)上進行網(wǎng)絡(luò)可視化及PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建、GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析，明確靶標基因及其功能和作用機制，最后通過分子對接可視化黃芪成分與基因互作的過程。研究過程及其介紹如表1所示，研究流程圖如圖1所示。

圖1 黃芪治療膠質(zhì)瘤的有效成分及作用機制的技術(shù)路線圖

2 結(jié)果與分析

2.1 活性成分篩選在TCMSP 數(shù)據(jù)庫中檢索黃芪，按口服生物利用度OB≥30%和藥物相似性DL≥0.18 作為篩選標準，共獲得20 種化合物，包括槲皮素、山柰酚等活性成分（圖2），同時構(gòu)建黃芪活性成分數(shù)據(jù)集，以便后續(xù)分析。

圖2 經(jīng)篩選獲得的20個黃芪活性成分

2.2 黃芪活性成分作用與膠質(zhì)瘤共同靶點篩選通過聯(lián)合兩個數(shù)據(jù)庫（GeneCards 數(shù)據(jù)庫、OMIM數(shù)據(jù)庫）以關(guān)鍵詞“Glioma”進行檢索，最終得到5 306 個膠質(zhì)瘤候選靶點基因。其中在GeneCards數(shù)據(jù)庫中檢索得到5 289 個與膠質(zhì)瘤相關(guān)的基因，在OMIM 數(shù)據(jù)庫補充基因17 個。在獲得黃芪活性成分的基礎(chǔ)上，從TCMSP 平臺檢索獲得黃芪活性成分對應(yīng)的靶點基因180個。將黃芪活性成分對應(yīng)的180 個靶點基因與膠質(zhì)瘤的5 306 個靶點基因取交集，共獲得137個共同靶點（圖3）。

圖3 黃芪活性成分與膠質(zhì)瘤交集靶點韋恩圖

2.3 成分—藥物靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建通過R x64 4.1.2軟件將20 種有效成分與137 個成分靶點按屬性進行編排后，導(dǎo)入Cytoscape v3.9.1軟件構(gòu)建黃芪活性成分—靶點網(wǎng)絡(luò)圖（圖4），黃芪20 個活性成分中有7個化合物未參與網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，因此圖中并未顯示。

圖4 黃芪活性成分—預(yù)測靶點網(wǎng)絡(luò)

圖中共有150 個節(jié)點，其中137 個基因節(jié)點，13個黃芪活性成分節(jié)點。圖中可見一個靶點可對應(yīng)多種藥物活性成分，一種藥物活性成分也對應(yīng)多個靶點。以Degree 值大小設(shè)置節(jié)點面積大小，并進行排列篩選獲得排名前5 的活性成分分別為quercetin（槲皮素）、kaempferol（山柰酚）、7-O-methylisomucronulatol（7-O-甲基異丙醇胺）、isorhamnetin（異鼠李素）、formononetin（芒柄花黃素），推測這些化合物可能是黃芪治療膠質(zhì)瘤的主要活性成分。

2.4 靶點相互作用PPI 網(wǎng)絡(luò)將得到的137 個交集靶點導(dǎo)入STRING平臺構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。所得PPI網(wǎng)絡(luò)共有137個節(jié)點，481條邊，平均節(jié)點數(shù)為7.02，并下載導(dǎo)出TSV格式文件，導(dǎo)入Cytoscape v3.9.1軟件進行網(wǎng)絡(luò)拓撲分析。選擇Degree≥12、Betweenness≥202.560 25 和Closeness≥0.418 43[16］的靶點作為關(guān)鍵靶點，共獲得16 個關(guān)鍵靶點：IL-2、AR、PRKCA、STAT1、HIF1A、RB1、MYC、MAPK8、IL-6、ESR1、MAPK14、FOS、AKT1、RELA、MAPK1、JUN。靶點信息見表2。黃芪治療膠質(zhì)瘤的PPI 網(wǎng)絡(luò)及關(guān)鍵靶點篩選過程見圖5。構(gòu)建“黃芪—化學(xué)成分—關(guān)鍵靶基因—膠質(zhì)瘤”網(wǎng)絡(luò)圖（圖6）。而Mairin、FA 等5 個化學(xué)成分的相關(guān)靶點與這16個關(guān)鍵靶點無交集，已 刪除，故未在圖中顯示。

圖5 黃芪治療膠質(zhì)瘤的PPI網(wǎng)絡(luò)及關(guān)鍵靶點篩選

圖6 黃芪—化學(xué)成分—關(guān)鍵靶基因—膠質(zhì)瘤網(wǎng)絡(luò)圖

表2 關(guān)鍵靶點信息

2.5 黃芪對膠質(zhì)瘤作用靶點的生物信息學(xué)分析

2.5.1 GO 功能富集分析經(jīng)過對交集靶點基因進行功能富集分析，共確定了2 326 個生物學(xué)過程（BP）、92 種細胞組分（CC）及204 種分子功能（MF）。根據(jù)P值從小到大篩選出排名前12 的生物學(xué)過程，見表3，并繪制柱狀圖（圖7）。

圖7 GO富集分析柱狀圖

表3 GO功能富集分析生物學(xué)過程

2.5.2 KEGG 通路分析為了探索黃芪治療膠質(zhì)瘤的信號通路機制，進行KEGG 通路分析。通過微生信平臺對交集靶點基因進行信號通路的KEGG富集分析，共有172 條信號通路差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P≤0.05）。其中，與膠質(zhì)瘤關(guān)系密切的前20 條通路如圖8、表4 所示。經(jīng)KEGG 通路分析發(fā)現(xiàn)，黃芪改善膠質(zhì)瘤主要作用于糖尿病并發(fā)癥中的AGERAGE 信號通路、脂質(zhì)和動脈粥樣硬化通路、流體剪切應(yīng)力和動脈粥樣硬化通路等，共同調(diào)節(jié)和互相協(xié)調(diào)可能為黃芪抗膠質(zhì)瘤的作用機制。

圖8 KEGG通路富集分析氣泡圖

表4 黃芪治療膠質(zhì)瘤關(guān)鍵靶點參與的通路信息

2.5.3 分子對接基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的結(jié)果，篩選出排名前5 的黃芪活性成分，分別是槲皮素、山柰酚、7-O-甲基異丙醇胺、異鼠李素、芒柄花黃素，并與排名前5 的蛋白AR（PDB ID：1E3G）、MAPK14（PDB ID：6ZWP）、AKT1（PDB ID：5WBL）、RELA（PDB ID：6POZ）、JUN（PDB ID：6OSN）分別進行分子對接，分子對接結(jié)果顯示，黃芪的活性成分與潛在靶點有較好的結(jié)合活性。小分子與蛋白質(zhì)對接的結(jié)合能熱圖見圖9，其中槲皮素與MAPK14（-9.50 KJ·mol-1）、槲 皮 素與JUN（-8.60 KJ·mol-1）、山 柰酚 與JUN（- 8.80 KJ·mol-1）、芒 柄 花 黃 素 與MAPK14（-8.00 KJ·mol-1）和AR（-8.00 KJ·mol-1）、異鼠李素與AR（-8.60 KJ·mol-1）結(jié)合較強。以槲皮素與MAPK14（-9.50 KJ·mol-1）、槲 皮 素 與JUN（-8.60 KJ·mol-1）、山柰酚與JUN（-8.80 KJ·mol-1）、異鼠李素與AR（-8.60 KJ·mol-1）為例，采用Pymol軟件查看小分子與蛋白質(zhì)的對接模式圖（圖10）。

圖9 小分子與蛋白質(zhì)對接結(jié)合能熱圖

圖10 活性成分與靶點基因的分子對接模式

3 討論

本研究所介紹的黃芪活性成分與傳統(tǒng)中藥學(xué)中的“有效成分”概念存在一定的出入。傳統(tǒng)的“有效成分”指的是黃芪中具有藥理學(xué)活性的化學(xué)成分；而本研究中的“活性成分”則選擇更嚴格的標準，通過采用OB/DL 兩個指標，結(jié)合“黃芪活性成分—預(yù)測靶點網(wǎng)絡(luò)”中得出的關(guān)鍵化學(xué)成分來作為黃芪的活性成分。黃芪中的活性成分槲皮素、異鼠李素、山柰酚等均有較好的抗腫瘤作用。槲皮素是一種天然的小分子黃酮類化合物，在多種中草藥中含量豐富，其化學(xué)名為3，3′，4′,5，7-五羥基黃酮，分子式為C15H10O17，具有多種生物活性和藥理作用[7-8］。其抗癌機制主要包括以下內(nèi)容：調(diào)節(jié)信號通路、抑制增殖和侵襲轉(zhuǎn)移、逆轉(zhuǎn)耐藥性、增強化療敏感性、誘導(dǎo)凋亡和自噬等[17］。槲皮素對腫瘤細胞增殖具有較強的抑制作用，已應(yīng)用于多種腫瘤治療。體外實驗發(fā)現(xiàn)，槲皮素可通過血腦屏障，阻斷人膠質(zhì)瘤細胞的DNA 合成而使其細胞周期停滯在G2/M 期，進而抑制腫瘤細胞侵襲和遷移[18］。異鼠李素即3，5，7-三羥基-2-（4-羥基-3-甲氧基苯基）苯并吡喃-4-酮，是一種廣泛存在于植物中的類黃酮，是槲皮素的直接代謝物，具有抗炎、抗氧化應(yīng)激、保護內(nèi)皮細胞、抗腫瘤等作用[6］。有研究[19］表明，異鼠李素可以抑制多種腫瘤細胞生長，其作用機制可能涉及抑制細胞增殖途徑并誘導(dǎo)細胞凋亡。異鼠李素可能通過調(diào)控Ras/MAPK信號通路實現(xiàn)細胞的S期阻滯，在這一過程中Ras/絲裂原激活蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinases， MAPK）信號通路下游級聯(lián)蛋白絲裂原激活蛋白激酶（Mitogen activated protein kinase， MEK）和細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（Extracellular regulated protein kinases，ERK）的磷酸化水平明顯降低，而Ras蛋白的表達水平無變化，說明異鼠李素可能通過調(diào)控Ras/MAPK 信號通路來實現(xiàn)細胞的S 期阻滯、減少處于G2/M 期和G0/G1期的細胞數(shù)量抑制腫瘤細胞增殖[20］。山柰酚是一種多羥基黃酮類化合物，廣泛存在于多種植物中。研究[21-22］表明，山柰酚具有多種藥理學(xué)活性，包括抗癌、抗氧化和抗炎等活性。有文獻[23］表明，山柰酚能夠抑制MAPK 相關(guān)的ERK 和p38 信號通路。此外，蔡美云等[24］研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)6-羥多巴胺干預(yù)的PC12 細胞炎癥水平升高，在加入了山柰酚處理后，炎癥相關(guān)蛋白表達明顯下調(diào)，同時磷酸化p38 絲裂原活化蛋白激酶（pp38 MAPK）表達升高，進一步實驗發(fā)現(xiàn)p38MAPK 可降低炎性相關(guān)蛋白的表達水平，表明山柰酚可能是通過p38 MAPK 信號通路發(fā)揮抗炎作用。HONG J等[25］發(fā)現(xiàn)山柰酚能顯著抑制血紅素加氧酶-1 基因的表達，降低其對PC12 細胞的氧化損傷作用，并且同樣也發(fā)現(xiàn)山柰酚通過MAPK等信號通路增強細胞的抗氧化功能。

PPI 網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果篩選出16 個關(guān)鍵靶點，包括IL-2、AR、PRKCA、STAT1、HIF1A、RB1、MYC、MAPK8、IL-6、ESR1、MAPK14、FOS、AKT1、RELA、MAPK1、JUN，尤其是JUN（AP-1轉(zhuǎn)錄因子）、AR（雄激素受體抗體）、MAPK14（MAP 激酶家族K14）、RELA（轉(zhuǎn)錄因子NF-κB），可能是核心靶點。相關(guān)研究[26］表明，JUN基因編碼的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄因子AP-1 在腫瘤形成、發(fā)展中發(fā)揮作用，AP-1 家族的JUN 蛋白能影響基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-1、MMP-2、CD44 等腫瘤相關(guān)因子。AP-1 調(diào)控膠質(zhì)瘤的作用可能是轉(zhuǎn)錄因子AP-1 的下調(diào)，使得MMP-2 等減少表達，促進膠質(zhì)瘤的進展。AR 是雄激素受體的一種，能作為激素誘導(dǎo)型DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮生物學(xué)功能。近年來研究[27］發(fā)現(xiàn)，AR 在膠質(zhì)瘤組織中表達水平升高，這提示AR 與膠質(zhì)瘤產(chǎn)生發(fā)展存在關(guān)聯(lián)。另有研究[28］證實，通過下調(diào)膠質(zhì)瘤細胞中AR 的表達水平可以減弱膠質(zhì)瘤的增殖、侵襲能力，同時促進腫瘤細胞的凋亡，進一步的實驗證實，AR 通過基因和非基因轉(zhuǎn)錄激活PI3K/Akt 信號通路參與細胞增殖進而影響腫瘤的進展。有研究[29］發(fā)現(xiàn)，AR 還參與了原癌基因和抑癌基因的調(diào)節(jié)過程：通過調(diào)控下游靶基因影響細胞的增殖與凋亡。MAPK14 屬于MAPK 家族成員之一，多種惡性腫瘤中均發(fā)現(xiàn)MAPK 出現(xiàn)異?；罨堨o等[30］對人膠質(zhì)瘤組織進行的免疫組化分析顯示，MAPK 及p-MAPK 陽性表達的區(qū)域面積百分率明顯高于正常腦組織，表明MAPK 異?；罨赡芘c神經(jīng)膠質(zhì)瘤的形成和發(fā)展有關(guān)。RELA，即轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，是1986 年由SEN R 等[31］在成熟的B 淋巴細胞中所提取出的一種對細胞信號通路起調(diào)控作用的重要轉(zhuǎn)錄因子。研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB 不僅可以對免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)起調(diào)控作用，同時還參與細胞分化、細胞周期調(diào)控、細胞凋亡等反應(yīng)[32-33］。近年來有研究[34］發(fā)現(xiàn)，在多種惡性腫瘤中均發(fā)現(xiàn)有NF-κB 持續(xù)活化的現(xiàn)象。NF-κB 可以促進IL-2 受體、T 細胞受體α、β 鏈的表達，進而介導(dǎo)IL-2 毒性損傷和T細胞與內(nèi)皮細胞的黏附。這可能會導(dǎo)致內(nèi)皮細胞受損，從而為腫瘤的轉(zhuǎn)移創(chuàng)造了條件[35］。核心靶點JUN、AR、MAPK14、RELA均有調(diào)控膠質(zhì)瘤的功能，表明黃芪治療膠質(zhì)瘤的作用機制可能與上述功能有關(guān)。

本研究將黃芪關(guān)鍵活性成分槲皮素、山柰酚、7-O-甲基異丙醇胺、異鼠李素、芒柄花黃素分別和5個核心靶點進行分子對接，結(jié)合關(guān)聯(lián)性熱圖、分子對接模式圖分析，所對接的所有靶點分子對接的結(jié)合能均＜-5 KJ·mol-1，其中槲皮素與MAPK14 對接的結(jié)合能為-9.50 KJ·mol-1，為所有對接中的最低值，說明黃芪中有效成分可以較好地結(jié)合在關(guān)鍵靶點上，驗證了基于生物網(wǎng)絡(luò)辨識關(guān)鍵成分的可靠性。

為探索黃芪治療膠質(zhì)瘤的作用機制，本研究進一步采用GO 分析和KEGG 通路分析進行探討。GO分析結(jié)果顯示，黃芪可能通過參與脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）、細胞應(yīng)激、細菌源分子、抗氧化以及藥物反應(yīng)等發(fā)揮治療膠質(zhì)瘤的作用。LPS反應(yīng)是膠質(zhì)瘤發(fā)生的根本機制之一。有研究[36］表明，LPS除通過神經(jīng)炎性機制間接損傷神經(jīng)元外，降低GluTs 功能，抑制膠質(zhì)細胞對Glu 的攝取，也是其損傷神經(jīng)元的作用機制之一。LPS是革蘭陰性菌的代謝產(chǎn)物[37］，黃芪或其活性成分多以口服攝入為主，因此黃芪是否可通過影響腸道微生物的穩(wěn)態(tài)，干擾脂多糖途徑影響膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展，值得深入探究。此外，NF-κB通路在炎性細胞因子（如IL-6、IL-8）的產(chǎn)生中發(fā)揮重要作用，在腫瘤微環(huán)境調(diào)控中發(fā)揮重要作用[32-33］。研究[38］表明，IL-6 可誘導(dǎo)膠質(zhì)母細胞瘤中的NF-κB，引起STAT3的激活，增強腫瘤侵襲性。KEGG 通路富集分析提示，膠質(zhì)瘤涉及的疾病較為復(fù)雜，主要包括糖尿病的并發(fā)癥、脂質(zhì)和動脈粥樣硬化、乙型肝炎等，同時涉及多種腫瘤，如前列腺癌、膀胱癌、胰腺癌和小細胞肺癌等，說明膠質(zhì)瘤發(fā)病機制復(fù)雜，涉及疾病廣泛。本研究結(jié)果為黃芪在治療膠質(zhì)瘤過程中的作用機制提供了較為清晰的科學(xué)依據(jù)，為黃芪的復(fù)方研發(fā)提供了思路。

本研究還存在一定局限性：本研究基于現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫進行探討，由于數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)在不斷更新，不斷用新的數(shù)據(jù)進行更新分析對于保持結(jié)果的相關(guān)性至關(guān)重要；此外，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)基于系統(tǒng)靶點分析初步探討了中藥成分的可能作用，這些推斷仍有待于臨床試驗、動物實驗進行驗證。

4 結(jié)論

基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法最終篩選出黃芪的5種活性成分：槲皮素、山柰酚、異鼠李素、7-O-甲基異丙醇胺及芒柄花黃素，作用于5 個核心靶點JUN、MAPK14、RELA、AR、ESR1，黃芪治療膠質(zhì)瘤的作用機制可能與脂多糖反應(yīng)、AGE-RAGE 信號通路在糖尿病并發(fā)癥中的作用、脂質(zhì)和動脈粥樣硬化等有關(guān)。