中國(guó)樟科植物資源豐富，主要分布于長(zhǎng)江流域南部，四川、廣東、廣西、江西等分布較多[1]，是集醫(yī)藥用、材用、城市綠化為一體的植物資源[2]。天竺桂（Cinnamomum japonicum Sieb.）屬于樟科樟屬植物，其枝、干、葉都可提取精油，用來(lái)制作各種香料、調(diào)料、藥物[3]。由于天竺桂枝繁葉茂，生長(zhǎng)較快，用作城市綠化樹(shù)種時(shí)，修剪的枝葉常作廢物處理，造成大量浪費(fèi)[4]。大腸桿菌（Escherichia coli）是條件致病菌，可引起各種局部組織器官感染。肺炎克雷伯氏菌（Klebsiel‐la Pneumoniae）能造成肺部感染，最終惡化為肺炎。鮑曼不動(dòng)桿菌（Acinetobacter baumannii）是醫(yī)院感染常見(jiàn)的一種細(xì)菌，通常會(huì)引起各類炎癥。植物精油來(lái)源于自然環(huán)境，使用后不會(huì)產(chǎn)生藥物殘留造成污染[5]。目前，樟屬植物精油在殺菌、抑菌方面的研究較為豐富，具有良好的抑菌活性。新木姜子精油對(duì)大腸桿菌有著較強(qiáng)的抑制效果[6]。肉桂精油對(duì)肺炎克雷伯氏菌有良好的抑制效果[7]，能快速滅殺銅綠假單胞菌[8]。天竺桂精油的抑菌范圍廣，對(duì)金黃色葡萄球菌、黑曲霉、大腸桿菌、甘藍(lán)黑腐菌、普通變形桿菌、藤黃八疊球菌、白菜軟腐菌等都有著良好的抑菌效果[9-10]，但抑菌活性強(qiáng)弱差異較大。本研究通過(guò)分析天竺桂葉精油的抑菌活性，確定它對(duì)大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌和鮑曼不動(dòng)桿菌抑菌活性的強(qiáng)弱，為其植物資源化開(kāi)發(fā)提供基礎(chǔ)理論支撐。

1材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1植物材料

天竺桂新鮮樹(shù)葉采集于四川農(nóng)業(yè)大學(xué)成都校區(qū)內(nèi)，用水洗凈后裝入尼龍網(wǎng)袋，自然晾干待用。

1.1.2供試菌種與培養(yǎng)基

大腸桿菌（Escherichia coli）、肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella Pneumoniae）、鮑曼不動(dòng)桿菌（Aci‐netobacter baumannii）菌種均由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)院提供。細(xì)菌的擴(kuò)大培養(yǎng)和最小抑菌濃度的測(cè)定采用肉湯液體培養(yǎng)基進(jìn)行分析。

1.1.3實(shí)驗(yàn)儀器

高溫高壓滅菌鍋MLS-3780、恒溫?fù)u床ZWY-2102C、超凈工作臺(tái)VD-850，恒溫培養(yǎng)箱等。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1精油提取

將天竺桂樹(shù)葉粉碎，采用水蒸氣蒸餾法提取精油。將天竺桂樹(shù)葉與蒸餾水按1：4比例裝入燒瓶中，蒸餾3 h，再用無(wú)水Na2SO4對(duì)精油進(jìn)行干燥，密封避光待用，并計(jì)算提取率。

1.2.2精油溶液配置

以三氯甲烷為溶劑，按100%、75%、50%、25%、0%精油體積分?jǐn)?shù)進(jìn)行精油溶液的配置，五種體積分?jǐn)?shù)的精油溶液每次配置200 L，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2.3細(xì)菌擴(kuò)大培養(yǎng)

采用恒溫?fù)u床對(duì)三種細(xì)菌擴(kuò)大培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速160 r/min，培養(yǎng)溫度37℃，培養(yǎng)時(shí)間24 h。對(duì)3種菌液濃度采用麥?zhǔn)媳葷岱ㄟM(jìn)行測(cè)定，測(cè)定3種菌液濃度均為3×108/mL。

1.2.4抑菌活性測(cè)定

采用打孔法測(cè)定精油的抑菌活性。具體步驟為：用移液槍將100 L細(xì)菌加入已備好的無(wú)菌培養(yǎng)基中，涂布均勻后靜置，待培養(yǎng)基完全吸收菌液后，用6 mm直徑的無(wú)菌打孔器將其打孔，再將50 L精油溶液加入孔中，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中。24 h后采用十字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑。

1.2.5最小抑菌濃度測(cè)定

采用96孔板法測(cè)定精油的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度。吐溫80作為溶劑（按吐溫80：精油= 1：5）配置精油乳濁液，用二倍稀釋法設(shè)置精油乳濁液濃度，取6個(gè)無(wú)菌離心管，依次編號(hào)，將300 L精油、60 L吐溫80、840 L培養(yǎng)液加入第1個(gè)無(wú)菌離心管中，搖晃均勻后，將600 L培養(yǎng)液各自加入其余離心管中，再按順序從前1個(gè)離心管中取600 L溶液加入并搖晃均勻。從不同的離心管中，各取20 L乳濁液加入微孔板中，并將160 L培養(yǎng)液和20 L菌懸液加入每個(gè)試樣中，使每個(gè)微孔板中試樣的精油濃度分別為10.0000、5.0000、2.5000、1.2500、0.6250、0.3125 L/mL，將僅加入20μL菌懸液和180 uL培養(yǎng)液的微孔試樣作為陽(yáng)性對(duì)照，再將96孔板放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，24 h后試樣清澈未發(fā)現(xiàn)明顯細(xì)菌生長(zhǎng)的濃度為最小抑菌濃度，從清澈透明的試樣中取100 L涂布于固體培養(yǎng)基上，24 h后平板上完全無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)的濃度為最小殺菌濃度。

2結(jié)果與分析

2.1精油抑菌活性

本研究中，天竺桂葉精油提取率為0.82%。由表1可知，天竺桂葉精油對(duì)大腸桿菌抑菌效果最好，100%體積分?jǐn)?shù)的天竺桂葉精油抑菌圈直徑可達(dá)17.45 mm，25%體積分?jǐn)?shù)的天竺桂葉精油抑菌圈直徑也有10.23 mm；對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌抑菌效果較大腸桿菌略差，最大抑菌圈直徑13.46 mm，最小抑菌圈直徑8.34 mm；對(duì)肺炎克雷伯氏菌的抑菌效果最差，最大抑菌圈直徑10.12 mm，50%體積分?jǐn)?shù)以下的天竺桂葉精油抑菌效果不明顯。

2.2最小抑菌濃度（MIC）

用天竺桂葉精油分別對(duì)大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌、鮑曼不動(dòng)桿菌最小抑菌濃度進(jìn)行測(cè)定，其結(jié)果詳見(jiàn)表2，由表2可知，天竺桂葉精油對(duì)大腸桿菌和鮑曼不動(dòng)桿菌的最小抑菌濃度均為2.5L·mL-1，天竺桂葉精油對(duì)肺炎克雷伯氏菌的最小抑菌濃度為5.0L·mL-1，直徑達(dá)17.45 mm，25%體積分?jǐn)?shù)的天竺桂葉精油抑菌圈直徑也有10.23 mm；對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌抑菌效果較大腸桿菌略差，最大抑菌圈直徑13.46 mm，最小抑菌圈直徑8.34 mm；對(duì)肺炎克雷伯氏菌的抑菌效果最差，最大抑菌圈直徑10.12mm，50%體積分?jǐn)?shù)以下的天竺桂葉精油抑菌效果不明顯。

2.3最小殺菌濃度（MBC）

將最小抑菌濃度實(shí)驗(yàn)中的清澈溶液再培養(yǎng)24 h后的結(jié)果詳見(jiàn)表3，天竺桂葉精油對(duì)大腸桿菌和鮑曼不動(dòng)桿菌的最小殺菌濃度為5.0 L·mL-1，對(duì)肺炎克雷伯氏菌的最小殺菌濃度為10.0 L·mL-1。

3結(jié)論與討論

天竺桂葉精油對(duì)肺炎克雷伯氏菌有抑菌效果但相對(duì)較差，但對(duì)大腸桿菌和鮑曼不動(dòng)桿菌都有著良好的抑菌效果。天竺桂葉精油對(duì)大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌和鮑曼不動(dòng)桿菌的最小抑菌濃度分別為2.5 L·mL-1、5.0 L·mL-1和2.5 L·mL-1，天竺桂葉精油對(duì)大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌和鮑曼不動(dòng)桿菌的最小殺菌濃度分別為5.0 L·mL-1、10.0 L·mL-1和5.0 L·mL-1。與馬英姿等人[9]的研究結(jié)果相比較，本實(shí)驗(yàn)中天竺桂葉精油對(duì)大腸桿菌的抑菌圈直徑較小，推測(cè)原因是抑菌實(shí)驗(yàn)方法的不同和精油溶液含量不同，打孔法精油溶液用量為50 L，馬英姿等人采用牛津杯法精油溶液用量為200 L。另外，本研究中對(duì)大腸桿菌的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度與馬英姿等人的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相比濃度更高，推測(cè)原因是所選溶劑不同，在抑菌圈試驗(yàn)中對(duì)肺炎克雷伯氏菌的抑菌效果稍差，而在最小抑菌濃度和最小殺菌濃度實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)尚可，推測(cè)原因是兩個(gè)研究所選溶劑不同。如在黃曉東[10]等人研究中，天竺桂葉精油與青霉素鈉等量合用時(shí)能夠一定程度上的增加青霉素鈉的抑菌效果，與硫酸慶大霉素聯(lián)合用藥時(shí)卻降低了硫酸慶大霉素抑菌效果。申鴿[11]研究表明，當(dāng)香樟葉與天竺桂葉精油按一定比例進(jìn)行混合后，對(duì)蚊蟲(chóng)的毒殺效果增強(qiáng)，若將這種方法運(yùn)用在精油抑菌方面，推測(cè)會(huì)有較好的效果，這對(duì)精油抑菌方面具有參考意義，為后續(xù)研究提供了新的方向。

參考文獻(xiàn)

[1]楊永，劉冰.中國(guó)樟科物種編目：?jiǎn)栴}和展望[J].生物多樣性，2015，23（2）：232-236.

[2]劉春生，盧彪，張鵬鵬.重慶地區(qū)樟科植物資源調(diào)查與應(yīng)用研究[J].綠色科技，2016（19）：6-8.

[3]陶思興，王佳玉，羅水平，等.野生天竺桂葉揮發(fā)油的抗氧化活性研究[J].北京聯(lián)合大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，28（2）：22-25.

[4]舒康云，陶永元，徐成東，等.天竺桂葉精油的提取及成分分析[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，34（1）：107-111.

[5]申鴿，彭映輝，秦巧慧，等.天竺桂葉精油成分分析及其對(duì)蚊蟲(chóng)的毒殺作用[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，30（9）：132-136.

[6]李娜，李鑫，祝子坪，等.舟山新木姜子揮發(fā)性成分的季節(jié)性變化及抑菌、抗氧化效果研究[J].林業(yè)科技，2018，43（5）：12-15.

[7]Yang SK， Yusoff K， Ajat M， et al. Disruption of KPCproducing Klebsiella pneumoniae membrane via induc‐tion of oxidative stress by cinnamon bark （Cinnamomum verum J. Presl） essential oil[J]. PloS one， 2019， 14（4）： e0214326.

[8]Elcocks ER， SpencerccHillips PTN， Adukwu EC. Rapid bactericidal effect of cinnamon bark essential oil against Pseudomonas aeruginosa[J]. Journal of applied microbiology， 2020， 128（4）： 1025-1037.

[9]馬英姿，譚琴，李恒熠，等.樟樹(shù)葉及天竺桂葉的精油抑菌活性研究[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，29（1）：36-40.

[10]黃曉東，黃曉昆，張嫻，等.天竺桂葉精油的含量動(dòng)態(tài)、化學(xué)成分及體外抗菌活性[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2010，26（4）：182-188.

[11]申鴿.十一種植物精油及其混劑對(duì)致倦庫(kù)蚊的熏蒸活性研究[D].中南林業(yè)科技大學(xué)，2012.

基金項(xiàng)目：彩葉樹(shù)種資源開(kāi)發(fā)及在龍泉山的應(yīng)用研究（21LQ03）；楨楠根腐病原菌與生防細(xì)菌鑒定以及對(duì)植株的抗性生理指標(biāo)分析（23ZR201）

【1成都農(nóng)業(yè)科技職業(yè)學(xué)院特色花木研究所李鳳，唐敏（通訊作者）；2四川農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院張優(yōu)】