陳秋羽，鄭曉婷，仲勁松，陳智兵，王 瑩，梁雪瑩，董宏標(biāo)，張家松

1.大連海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院，遼寧 大連 116023

2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點實驗室，廣東 廣州 510300

3.中洋漁業(yè) (清遠(yuǎn)) 有限公司，廣東 清遠(yuǎn) 513129

4.廣東省農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，廣東 廣州 510145

牛蛙 (Ranacatesbeiana) 屬兩棲綱、無尾目、蛙科，其肉質(zhì)鮮嫩、細(xì)軟爽口，蛋白質(zhì)和必需氨基酸含量高且脂質(zhì)含量較低，加工方便，深受消費者喜愛[1]。牛蛙皮中可提取一種生物活性肽，可作為新型抗菌肽開發(fā)原料[2]；而牛蛙的脂肪可通過生物技術(shù)處理生成一種天然油脂，因其具有優(yōu)秀的熱穩(wěn)定性和氧化穩(wěn)定性，在營養(yǎng)食品及制藥市場上有很大的潛力[3]。2021 年，我國牛蛙養(yǎng)殖產(chǎn)量超過60 萬噸，三產(chǎn)產(chǎn)值近千億[4]。然而，由于目前我國牛蛙養(yǎng)殖技術(shù)落后、種質(zhì)退化以及對種蛙濫用藥物等原因，雖每年投放蝌蚪苗種近20 萬尾進(jìn)行繁育，但僅三成可養(yǎng)成至商品蛙規(guī)格[5]；因此，高質(zhì)量苗種培育是關(guān)鍵的技術(shù)環(huán)節(jié)。

在脊椎動物中，兩棲綱動物具有獨特的變形期，其早期胚胎發(fā)育過程及胚后幼體發(fā)育過程在苗種培育、比較胚胎學(xué)和分子機制研究中均具有重要意義[6-7]。劉楚吾和陳信初[8]于1987 年系統(tǒng)研究了機械振蕩、溫度、pH、溶解氧對牛蛙受精卵孵化率的影響；王雪虹[9]進(jìn)一步研究了溫度驟變和機械振蕩對不同發(fā)育階段牛蛙胚胎的影響。目前，對牛蛙胚胎發(fā)育時期的研究僅簡單劃分了受精卵的發(fā)育時期[7]，只有手繪發(fā)育過程圖，并未對其發(fā)育過程進(jìn)行全面劃分，也未記錄每個發(fā)育時期所需的生物積溫。因此，本研究通過觀察牛蛙的胚胎發(fā)育過程，詳細(xì)記錄牛蛙胚胎從合子階段的受精卵發(fā)育至孵化完成階段的鰓蓋閉合期的各時期形態(tài)變化特征、發(fā)育所需時間及生物積溫，充實其影像學(xué)資料及生物學(xué)資料，旨在為牛蛙的苗種培育提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 種蛙馴養(yǎng)

牛蛙種蛙取自位于廣東省清遠(yuǎn)市陽山縣白蓮村的中洋漁業(yè) (清遠(yuǎn)) 有限公司養(yǎng)殖基地。雌雄種蛙在車間內(nèi)的水泥養(yǎng)殖池分開馴養(yǎng)，水源為山泉水，24 h 常流水，平均水溫為 (21.5±0.5) ℃，溶解氧質(zhì)量濃度為 (9.10±0.75) mg·L-1，車間內(nèi)室溫為 (26.5±0.5) ℃。每日投喂牛蛙配合飼料2 次，投喂時間為9:00 和18:00，日投喂量為牛蛙體質(zhì)量的7%～15%。

1.1.2 種蛙選擇

選擇規(guī)格較大、腹部緊致有彈性、四肢形態(tài)正常、后腿有勁、眼睛有神、處于發(fā)情期且趾端婚墊特征明顯的8 只雄蛙作父本，平均體質(zhì)量為 (723.75±40.90) g；選擇腹部膨大柔軟圓潤、形態(tài)正常、皮膚光滑油亮、眼睛有神、輕壓腹部能擠壓出少許卵粒的8 只雌蛙作母本，平均體質(zhì)量為 (503.75±23.93) g ；在配對繁殖前3 d 對雌蛙進(jìn)行禁食，以減少其體內(nèi)脂肪積累，保證產(chǎn)卵順利與卵子的質(zhì)量[10]。

1.1.3 受精卵采集

用100 目篩絹網(wǎng)在種蛙產(chǎn)卵池中分別圍出1 m×1 m×1 m 的網(wǎng)兜，網(wǎng)兜遠(yuǎn)離出水口和入水口。適當(dāng)調(diào)節(jié)水深控制在約0.4 m，保持24 h 流水。每個網(wǎng)兜內(nèi)放入1 對種蛙，其中4 對種蛙成功抱對產(chǎn)卵。在種蛙抱對產(chǎn)卵后，立即用篩絹網(wǎng)撈兜輕輕撈取受精卵，轉(zhuǎn)移到孵化盆，每個盆內(nèi)放入300 顆受精卵，并把產(chǎn)卵后的種蛙取出放回養(yǎng)殖池中。受精時間從種蛙抱對產(chǎn)出第一批散開在水面的卵后的第5 分鐘開始計時。蛙受精卵外有膠質(zhì)膜，產(chǎn)出后吸水膨大，漂浮于水面；若產(chǎn)出的受精卵未及時撈起，則易下沉不便于采卵；轉(zhuǎn)移蛙卵時避免震動，以免導(dǎo)致受精卵發(fā)育畸形[8-9]。

1.2 胚胎發(fā)育觀察

1.2.1 孵化準(zhǔn)備

選取方形塑料盆 (0.54 m×0.39 m×0.32 m) 作為孵化盆，將孵化盆的水位保持在0.2 m。水源皆為山泉水，水溫為(24.5±0.4) ℃，光照周期為14 L∶10 D，光照強度為1 000～1 400 lx。pH 和溶解氧的設(shè)置參照劉楚吾和陳信初[8]的實驗，pH 保持在7.0～7.5，溶解氧質(zhì)量濃度在7 mg·L-1以上，每12 h 檢測水中溶氧量，采用曝氣石持續(xù)增氧。蝌蚪脫膜前，每天8:00 換水1/3，及時處理胚胎的代謝產(chǎn)物和死掉的胚胎。每組設(shè)3 個平行。

1.2.2 胚胎發(fā)育觀察

用2 mL 的吸管從孵化盆中取10～15 顆受精卵均勻地鋪于載玻片上，在光學(xué)顯微鏡(LICHEN XSP-02，10×4 倍) 下觀察并拍照，詳細(xì)記錄各時期的發(fā)育特征及所需時間。使用高精度電子游標(biāo)卡尺測量受精卵的徑長。每期每組隨機取20～30 顆受精卵進(jìn)行觀察，參考謝永廣等[11]的實驗方法，以40%以上胚胎達(dá)到某期確定為該發(fā)育時期的起始時間，60% 以上胚胎達(dá)到某期確定為該發(fā)育時期的結(jié)束時間。受精卵在卵裂階段時，胚胎發(fā)育較快，每10 min 觀察1 次胚胎發(fā)育情況；進(jìn)入囊胚階段后，發(fā)育速度變緩，每30 min 觀察1次胚胎發(fā)育情況。生物積溫的計算參考邢君霞等[12]的研究，以每期的發(fā)育所需時間和平均水溫計算胚胎發(fā)育該期的生物積溫，計算公式為：

式中：K為生物積溫(h·℃)；T為該階段發(fā)育時的平均水溫(℃)；n為某一階段發(fā)育至下一階段所需時間 (h)。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

使用Excel 2021 軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計，用Adobe Photoshop 2022 軟件處理圖片。

2 結(jié)果

根據(jù)實驗觀察，并參照水產(chǎn)動物的胚胎發(fā)育過程[13]，可將牛蛙胚胎發(fā)育過程劃分為7 個階段。從受精卵開始為合子階段；受精卵出現(xiàn)倍增性的細(xì)胞分裂，為卵裂階段；伴隨細(xì)胞的繼續(xù)分裂分化，胚體形成一個多細(xì)胞的囊狀胚體，為囊胚階段；囊胚形成后，由于胚體的原腸作用，細(xì)胞會進(jìn)行內(nèi)陷和外包，形成原腸胚，為原腸胚階段；之后，胚體繼續(xù)發(fā)育會形成具有神經(jīng)管、脊索的胚體，此為神經(jīng)胚階段；神經(jīng)胚階段后，胚體上逐漸形成器官，此為器官形成階段；此后至鰓蓋完全閉合后，為孵化完成階段。為了進(jìn)一步細(xì)化牛蛙的胚胎發(fā)育過程，參照前人對蛙類的胚胎發(fā)育時期劃分[7-9,13-14]，并結(jié)合本實驗的觀察結(jié)果，將牛蛙胚胎發(fā)育的7 個階段再細(xì)分為最明顯且最具代表性的24 個時期 (圖1)。

圖1 牛蛙胚胎發(fā)育分期及各期的形態(tài)特征注：a.受精卵；b.2 細(xì)胞期；c.4 細(xì)胞期；d.8 細(xì)胞期；e.16 細(xì)胞期；f.32 細(xì)胞期；g.64 細(xì)胞期；h.囊胚早期；i.囊胚晚期；j.原腸早期；k.原腸中期；l.原腸晚期；m.神經(jīng)板期；n.神經(jīng)褶期；o.胚胎轉(zhuǎn)動期；p.神經(jīng)管期；q.尾芽期；r.肌肉效應(yīng)期；s.心跳期；t1.鰓血循環(huán)期 (頭部側(cè)面圖)；t2.鰓血循環(huán)期 (尾部側(cè)面圖)；u1.開口期 (頭部側(cè)面圖)；u2.開口期 (尾部側(cè)面圖)；v1.尾血循環(huán)期 (頭部側(cè)面圖)；v2.尾血循環(huán)期 (尾部側(cè)面圖)；w1.右端鰓蓋閉合期 (頭部背面圖)；w2.右端鰓蓋閉合期 (頭部腹面圖)；x1.鰓蓋閉合完成期 (背面圖)；x2.鰓蓋閉合完成期 (腹面圖)。Fig.1 Developmental stages and morphological characteristics of embryo of R.catesbeianaNote: a.Fertilized eggs; b.2-cell stage; c.4-cell stage; d.8-cell stage; e.16-cell stage; f.32-cell stage; g.64-cell stage; h.Early blastula; i.Late blastocyst;j.Early gastrula stage; k.Mid-gastrula stage; l.Late gastrula stage; m.Neural plate stage; n.Neural folds stage; o.Embryo rotation stage; p.Neural tube stage;q.Tail-bud period; r.Muscular contraction stage; s.Heart beat stage; t1.Gill blood circulation period (Head side); t2.Gill blood circulation period (Tail side);u1.Opening period (Head side); u2.Opening period (Tail side); v1.Tail blood circulation period (Head side); v2.Tail blood circulation period (Tail side);w1.Right gill cover closure period (Head back); w2.Right gill cover closure period (Head abdomen) x1.Gill cover closure period (Back view); x2.Gill cover closure period (Abdomen view).

在本實驗中水溫為 (24.5±0.4) ℃時，受精卵發(fā)育至肌肉效應(yīng)期需要67 h 49 min，總積溫為1 896.95 h·℃；到鰓蓋閉合期共耗時177 h 38 min，總積溫為4 249.71 h·℃。整個發(fā)育過程呈現(xiàn)前期發(fā)育速度較快、后期較慢的趨勢。胚胎發(fā)育各個時期的特征、耗時與積溫見表1 和圖1。

表1 牛蛙胚胎發(fā)育分期Table 1 Embryonic developmental stages of R.catesbeiana

2.1 合子

牛蛙受精卵自受精后到第一卵裂溝出現(xiàn)為止 (0～2 h 1 min)，此階段為合子階段，生物積溫為48.51 h·℃。整個卵呈球型，卵徑為 (1.41±0.31) mm。牛蛙受精卵屬端黃卵，呈極性分布，分為植物極和動物極。植物極卵黃集中，為灰白色，表面積大約占整個卵的1/3；動物極是原生質(zhì)集中的地方，有黑色素，呈黑棕色。受精卵外圍附著一層卵膜，卵膜吸水后膨脹，卵將沉底且能自轉(zhuǎn)，植物極轉(zhuǎn)動朝下，動物極轉(zhuǎn)動朝上 (圖1-a)。

2.2 卵裂

牛蛙的卵裂類型為不均等完全卵裂，整個卵裂階段共耗時2 h 1 min～13 h 35 min，生物積溫為304.99 h·℃。自受精2 h 1 min 后，受精卵的動物極出現(xiàn)一條縱溝，被分為不完全相等的2 個卵裂球，為2 細(xì)胞期，此時期持續(xù)25 min (圖1-b)；受精2 h 35 min 后，第二條卵裂溝出現(xiàn)，為緯裂，垂直于第一條卵裂溝，受精卵此時分裂為4 個卵裂球，為4 細(xì)胞期，此時期持續(xù)27 min (圖1-c)；受精3 h 2 min 后，受精卵出現(xiàn)第3 次卵裂，此時出現(xiàn)的卵裂溝將受精卵分為8 個大小不等的卵裂球，其動物極的卵裂球較植物極的小，此期為8 細(xì)胞期，持續(xù)42 min (圖1-d)；受精3 h 44 min 后，第4 次卵裂出現(xiàn)，將受精卵分裂為排列不甚規(guī)則且16 個大小不一致的卵裂球，為16 細(xì)胞期，持續(xù)30 min (圖1-e)；受精4 h 14 min 后，受精卵進(jìn)入32 細(xì)胞期，經(jīng)歷第5 次卵裂，此次分裂不規(guī)則，受精卵被分裂為32 個形狀各異的分裂球，持續(xù)2 h 1 min (圖1-f)；受精6 h 15 min 后，受精卵經(jīng)歷第6 次卵裂，被不規(guī)則分裂為64 個分裂球，動物極的卵球較植物極的多且小，此期為64 細(xì)胞期，持續(xù)7 h 20 min (圖1-g)。

2.3 囊胚

經(jīng)歷6 次卵裂后，受精卵進(jìn)入囊胚階段，此階段共耗時13 h 35 min～21 h 48 min，生物積溫為183.09 h·℃。自受精13 h 35 min 后，受精卵被分裂為大小不等的卵裂球，受精卵表面凹凸不平，有明顯卵裂溝，整體呈桑葚狀，此期為囊胚早期 (圖1-h)。在受精20 h 7 min 后，受精卵進(jìn)入囊胚晚期，可見其表面界限明顯的卵裂溝逐漸變得不清晰，但能分辨出有卵裂溝在受精卵表面 (圖1-i)。

2.4 原腸胚

在囊胚晚期后，受精卵進(jìn)入原腸胚階段，此階段共耗時21 h 48 min～33 h 58 min，生物積溫為288.50 h·℃。自受精21 h 48 min 后，受精卵表面的卵裂溝已經(jīng)無法分辨，此時原腸早期的卵裂球更小，且輪廓逐漸模糊；由于其內(nèi)胚層細(xì)胞的內(nèi)陷，受精卵表面可見有微凹陷部分，微凹陷部分的背側(cè)為背唇，此期為原腸早期 (圖1-j)。在受精26 h 5 min 后，受精卵表面變得光滑，只能分辨出有卵裂線不見卵裂溝；且其背唇位置的細(xì)胞逐漸下包，植物極細(xì)胞內(nèi)卷，逐漸形成圓形胚孔，胚孔中有白色凸起為卵黃栓，此期為原腸中期 (圖1-k)。受精27 h 7 min 后，受精卵隨著動植物極細(xì)胞的外包和內(nèi)卷，胚孔逐漸變小，直至被完全包入內(nèi)部，此期為原腸晚期 (圖1-l)。

2.5 神經(jīng)胚

在原腸胚階段之后，受精卵進(jìn)入神經(jīng)胚階段，此階段共耗時33 h 58 min～62 h 23 min，此階段外胚層特定區(qū)域細(xì)胞內(nèi)陷形成神經(jīng)系統(tǒng)，生物積溫為681.42 h·℃。自受精33 h 58 min 后，胚孔封閉，胚體已略變?yōu)槔嫘危瑐?cè)面明顯可見有神經(jīng)板出現(xiàn)，此期為神經(jīng)板期(圖1-m)。受精40 h 45 min 后，肉眼可見受精卵的整個胚體逐漸拉長，已變?yōu)榈湫偷睦嫘?；神?jīng)板逐漸隆起形成神經(jīng)褶，明顯可見神經(jīng)褶中間略有凹陷，此為神經(jīng)褶期 (圖1-n)。受精45 h 46 min 后，神經(jīng)褶的兩側(cè)隆起逐漸向中間靠攏合并，形成神經(jīng)溝，此時胚胎表面出現(xiàn)纖毛，由于纖毛的擺動可見胚體開始在膜內(nèi)轉(zhuǎn)動，為胚胎轉(zhuǎn)動期，又稱為神經(jīng)溝期 (圖1-o)。受精49 h 37 min 后，胚體繼續(xù)拉長，神經(jīng)溝逐漸消失合攏為一條線，從而形成神經(jīng)管，在胚體上還可見到有尾芽的原基出現(xiàn)，此為神經(jīng)管期 (圖1-p)。

2.6 器官形成

自原腸胚后，胚體繼續(xù)發(fā)育進(jìn)入器官形成階段，此階段經(jīng)歷時間為62 h 23 min～142 h 47 min，生物積溫為2 791.71 h·℃。卵受精62 h 23 min 后，胚體頭部出現(xiàn)吸盤，鰓區(qū)開始逐漸分化出現(xiàn)，且在胚體后背部有明顯的尾芽出現(xiàn)，此期為尾芽期 (圖1-q)。受精67 h 49 min 后，胚體進(jìn)入肌肉效應(yīng)期，此時胚體已完全脫膜，其尾芽更加明顯，胚體整體增長，在受到外部刺激時，胚體會做出頭尾彎曲的環(huán)形收縮反應(yīng) (圖1-r)。受精80 h 33 min 后，可見胚體尾部發(fā)育明顯，在頭部可見鰓芽出現(xiàn)；在顯微鏡下可觀察到胚體的咽腹部有規(guī)則的心跳搏動，此為心跳期(圖1-s)。受精89 h 45 min 后，胚體頭部側(cè)面有鰓絲長出，鰓絲有明顯收縮，在顯微鏡下可見鰓絲的血管中有血液循環(huán)流動；在胚體尾部可見明顯體節(jié)。胚體在孵化盆中常用吸盤側(cè)吸附在盆壁上不動，僅在受到外界刺激時才會扭曲游動，此期為鰓血循環(huán)期 (圖1-t1,1-t2)。受精96 h 37 min后，胚體進(jìn)入開口期，其頭部腹面可見口唇輪廓，兩腮的鰓絲增長，并可見眼部的角膜變透明 (圖1-u1,1-u2)。受精103 h 53 min 后，胚體吸盤逐漸退化；其眼部可見明顯的黑色眼球；外鰓基部可見鰓蓋褶出現(xiàn)；尾部變透明且有血液流動；腹部變短變圓，在水中可短暫直立，此期為尾血循環(huán)期 (圖1-v1,1-v2)。受精142 h 47 min后，胚體進(jìn)入右端鰓蓋閉合期，胚體頭部變橢圓，可見兩個黑色眼球；從背部可見右側(cè)鰓蓋已完全閉合，與體表合為一體，左邊的鰓絲仍然露出；吸盤已完全退化，腹部可見漩渦狀的腸道組織 (圖1-w1,1-w2)。

2.7 孵化完成

受精卵歷經(jīng)177 h 38 min，此時已完全孵化為蝌蚪體，蝌蚪體側(cè)的左端鰓蓋閉合完成，且外鰓已完全消失；口部上下唇已發(fā)育完成，僅留一小孔通水；蝌蚪在水中已能完全自由地游動，并平衡地立于水中，此期為鰓蓋閉合完成期 (圖1-x1,1-x2)。

3 討論

3.1 牛蛙受精卵發(fā)育階段與其他蛙類的異同

本研究中，牛蛙的胚胎發(fā)育包括合子、卵裂、囊胚、原腸胚、神經(jīng)胚、器官形成及孵化完成7 個階段。與棘胸蛙 (Quasipaaspinosa)[11]、黑斑蛙 (Pelophylaxnigromaculatus)[15]、花臭蛙 (Odorranaschmackeri)[16]、凹耳臭蛙(O.tormota)[17]、斑腿泛樹蛙 (Rhacophorusmegacephalus)[18]等兩棲無尾目動物的胚胎發(fā)育大致相近，自受精卵經(jīng)歷卵裂后，發(fā)育成囊胚，再自囊胚轉(zhuǎn)化為原腸胚，原腸胚發(fā)育成神經(jīng)胚后開始形成器官，最后孵化完成，成為幼體。此外，結(jié)合本實驗條件下牛蛙受精卵的發(fā)育過程，發(fā)現(xiàn)蛙類胚胎發(fā)育在經(jīng)歷卵裂階段的32 細(xì)胞期時，卵裂球溝均會由深卵裂溝分化為淺卵裂溝[13,19]。此時表層細(xì)胞之間會形成緊密連接，這些連接會顯著減少其能量代謝所需的氧氣供應(yīng)，所以此時胚胎表層細(xì)胞的發(fā)育能影響深層細(xì)胞的耗氧[20]。缺氧則會誘導(dǎo)激活其內(nèi)部細(xì)胞的糖酵解[21]，而在此時深層細(xì)胞可能處于缺氧狀態(tài)，從而促進(jìn)內(nèi)部細(xì)胞開始分化，產(chǎn)生胚胎后續(xù)一系列的結(jié)構(gòu)變化[22]。可見牛蛙的早期胚胎發(fā)育階段遵循大多數(shù)兩棲綱無尾目動物的胚胎發(fā)育模式。

1937 年，Pollister 和Moore[23]研究了木蛙 (R.Aylvatica) 的胚胎及幼體發(fā)育過程，將木蛙胚胎及幼體發(fā)育過程劃分為23 個時期，卻并未對各時期進(jìn)行命名。Shumway[14]于1940 年參照木蛙胚胎發(fā)育時期，將美洲豹蛙 (R.pipiens)的胚胎及幼體發(fā)育過程劃分為25 個時期，且以每時期最具特征性的表現(xiàn)為各時期命名。二者不同的是，Pollister 和Moore[23]將右端鰓蓋閉合期與鰓蓋閉合完成期歸為了同一時期，而Shumway[14]將這兩期單獨劃分了出來，筆者與其劃分方式一致，將牛蛙的右端鰓蓋閉合期與鰓蓋閉合完成期分為不同的兩期[23]。此后，學(xué)者們對黑斑蛙、花臭蛙、凹耳臭蛙、斑腿泛樹蛙等胚胎發(fā)育過程[15-18]皆參照了Shumway[14]的分期方式進(jìn)行劃分。已有部分研究在無尾兩棲類動物胚胎發(fā)育過程中的鰓血循環(huán)期之后、右端鰓蓋閉合期之前劃分出了鰓蓋褶期[8,15-16,23]。本研究與謝永廣等[11]、Shumway[14]、劉紹龍等[24]的發(fā)現(xiàn)一致，注意到鰓蓋褶期常在尾血循環(huán)期出現(xiàn)，且出現(xiàn)時模糊。根據(jù)胚胎發(fā)育分期和命名的原則，即必須以發(fā)育過程中顯著特征為劃分依據(jù)，本文未將鰓蓋褶期單獨劃分，鰓血循環(huán)期后即右端鰓蓋閉合期。

3.2 影響牛蛙受精卵發(fā)育耗時的因素

所有生物體都需要以負(fù)熵為食，即生物體在吸收外界環(huán)境中的熱能后，再向外界環(huán)境釋放熱能，以維持其能量代謝。能量代謝是維持生命組織的主要因素，所以人們將生物體的發(fā)育與其過程中消耗的能量代謝聯(lián)系起來[25]。胚胎發(fā)育時期的環(huán)境溫度則是影響胚胎發(fā)育形態(tài)、時間及發(fā)育速度的外部因素[26]。在胚胎發(fā)育至幼體的過程中，主要由受精卵中的卵黃提供能量，此過程中，水溫升高會提高卵黃中的蛋白降解酶活性，卵黃吸收率和代謝活性隨之增加，加快胚胎的發(fā)育速度[27]。研究發(fā)現(xiàn)，林蛙 (R.chensinensis)[28-29]、木蛙[30]、棘胸蛙[31]等胚胎發(fā)育速度與水溫呈正相關(guān)[32]，牛蛙也有類似現(xiàn)象[8-9]。

影響牛蛙胚胎發(fā)育耗時的因素除溫度外，還有光照條件[33]、養(yǎng)殖密度[34]、鹽度[35]等環(huán)境因素[36]，而受精卵的卵徑大小則為影響胚胎發(fā)育耗時的內(nèi)在因素。在水溫相似的條件下，飾紋姬蛙 (Microhylafissipes) 受精卵卵徑為(0.97±0.02) mm，發(fā)育至鰓蓋閉合期僅需82 h 36 min[37]；本實驗中的牛蛙受精卵卵徑為 (1.41±0.31) mm，發(fā)育至鰓蓋閉合完成期需要177 h 38 min，總積溫為4 249.71 h·℃；棘胸蛙受精卵卵徑為 (4.31±0.69) mm，發(fā)育至鰓蓋閉合期需要288 h 44 min，總積溫5 462.03 h·℃[11]。由此可見，受精卵卵徑越大所需發(fā)育時間越長，所需生物積溫更高，這一規(guī)律與大多數(shù)魚類中胚胎發(fā)育時間與卵徑的關(guān)系也相符[38]。這可能由于較大的卵裂球在生長發(fā)育中需要更多的營養(yǎng)和更高的生物積溫以維持其正常發(fā)育[39]，而產(chǎn)生這種現(xiàn)象的主要原因還需進(jìn)一步研究。

3.3 孵化過程中水體環(huán)境對牛蛙受精卵的影響

在胚胎的早期發(fā)育過程中，溶解氧、pH 等環(huán)境因子對胚胎發(fā)育的影響極大[40-41]。有研究表明，蛙類胚胎的耗氧量會隨著發(fā)育時間增加而增加，養(yǎng)殖生產(chǎn)過程中溶解氧含量過低可導(dǎo)致胚胎發(fā)育遲緩，甚至幼苗死亡[8,42]；而王春青和呂樹臣[43]發(fā)現(xiàn)當(dāng)水中溶解氧過高則會引起蝌蚪的氣泡病，若不及時救治將引起大量死亡。在受精卵孵化過程中，由于胚胎發(fā)育階段的酸堿調(diào)節(jié)機制尚未發(fā)育完全[44-45]，pH 也會顯著影響胚胎形態(tài)及孵化率[46]。當(dāng)pH 過高時，會導(dǎo)致云紋石斑魚 (Epinephelusmoar) 胚胎的孵化率降低[47]，這與劉楚吾和陳信初[8]的研究結(jié)果一致；而當(dāng)pH 過低，則會引起海灣扇貝 (Argopectenirradia) 胚胎的畸形率上升[45]。因此本實驗在孵化過程中將水中pH 嚴(yán)格控制在7.0～7.5，溶解氧質(zhì)量濃度在7 mg·L-1以上。在本實驗中也盡量避免蛙卵的移動，以免造成牛蛙胚胎的死亡。王雪虹[9]認(rèn)為機械振動刺激會導(dǎo)致蛙卵的死亡，Xie 等[48]的實驗證明慢性機械刺激會造成卵裂球的損害，誘導(dǎo)裂原活化蛋白激酶的磷酸化，從而減緩胚胎的生長。

本實驗在孵化牛蛙受精卵的過程中，每日換水1/3 并及時處理水中胚胎的代謝產(chǎn)物和死掉的胚胎。這是由于蛙類胚胎發(fā)育過程所產(chǎn)生的代謝廢物會導(dǎo)致水體中的氨氮(NH+4)、亞硝酸鹽 (NO-2-N) 等含量增加，可能會直接或間接影響胚胎及幼體的發(fā)育[49]。且在淡水魚類的受精卵孵化過程中常見有水霉病，此為卵菌性疾病，會顯著影響受精卵孵化的成活率[50-51]。在蛙類受精卵孵化中同樣常見，多發(fā)生于水質(zhì)較差、卵塊密度太大、水溫驟然下降等情況，尤其在連綿陰雨天氣的季節(jié)最易出現(xiàn)。一旦有卵感染上水霉病，卵四周即會長出肉眼可見的灰白色菌絲，若不及時處理，菌絲則會蔓延至其他正常卵團(tuán)中，導(dǎo)致大量胚胎死亡。因此，提前做好預(yù)防、保持良好的水質(zhì)和環(huán)境對促進(jìn)胚胎健康發(fā)育和提高受精卵成活率至關(guān)重要。

4 小結(jié)與展望

綜上所述，本研究通過觀察牛蛙早期胚胎發(fā)育的過程及其變化特征，將牛蛙胚胎發(fā)育過程劃分為7 個階段24 個時期。在水溫 (24.5±0.4) ℃的條件下，胚胎從合子階段的受精卵發(fā)育至器官形成階段的肌肉效應(yīng)期需要6 7 h 49 min，總積溫為1 896.95 h·℃；至孵化完成階段的鰓蓋閉合期共耗時177 h 38 min，總積溫為4 249.71 h·℃。此外，本研究詳細(xì)記錄并補充了牛蛙早期胚胎發(fā)育所經(jīng)歷每個時期的變化特征及清晰的影像學(xué)資料，可為其高質(zhì)量育種提供參考依據(jù)。

基于本研究的結(jié)果，可進(jìn)一步通過改變胚胎的發(fā)育環(huán)境[52]，研究環(huán)境因素對胚胎發(fā)育的影響，探究這些環(huán)境因素與基因調(diào)控之間的相互作用[53-54]。兩棲類動物具有較強的再生能力，如非洲爪蟾 (Xenopuslaevis) 在胚胎發(fā)育過程中一些特定的組織和器官在被損傷后可再生[55-56]。受此啟發(fā)，可通過研究牛蛙蝌蚪是否具有再生能力并分析其再生的分子機制和細(xì)胞信號通路[57]，了解再生在不同情況下的作用機制可為干細(xì)胞生物學(xué)、細(xì)胞可塑性研究提供參考[58]。