龍成鳳，張達(dá)娟，王澤斌，張樹林，畢相東，戴偉

（天津農(nóng)學(xué)院 水產(chǎn)學(xué)院 天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300392）

隨著我國工業(yè)及城鎮(zhèn)化進(jìn)程加快，工業(yè)廢水、生活污水、溫室氣體排放量增加，水體富營養(yǎng)和大氣污染等已對生態(tài)環(huán)境造成嚴(yán)重影響，甚至威脅人類生存和發(fā)展[1-3]，因此推廣綠色高效的環(huán)境修復(fù)技術(shù)是亟待完成的任務(wù)之一。為解決這一問題，20 世紀(jì)中葉OSWALD 和GOTAAS 提出用微藻治理污水[4-5]。微藻屬于自養(yǎng)型微生物，能將光能轉(zhuǎn)化為化學(xué)能，在生長過程中可吸收降解污水中的氮、磷等污染物，從而起到凈化水質(zhì)的作用[6-9]。李超等[10]用四尾柵藻（Scenedesmus quadricauda）和蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）去除模擬生活污水中的總氮，去除率分別達(dá)到78.33%、76.67%。李興涵等[11]用小球藻（Chlorellasp.）對天然橡膠加工廢水進(jìn)行處理，結(jié)果表明，小球藻對廢水中總氮、總磷均具有較好去除效果，去除率分別為89.21 %和70.00 %。

此外，我國在2020 年提出在2030 年前完成碳達(dá)峰，爭取2060 年前完成碳中和的“雙碳”目標(biāo)。CO2作為主要的溫室氣體之一，降低其在大氣中的含量，對實(shí)現(xiàn)“雙碳”目標(biāo)具有重要意義。微藻廣泛存在于水體中，可以直接利用光能且繁殖速度快，固定CO2效率是陸生高等植物的10～50 倍[12]。20 世紀(jì)末，WERNER 等[13]提出藻類的分子式為C106H263O110N6P，并給出其光合作用反應(yīng)式：106CO2+16NO3-+HPO42-+122H2O+18H+→C106H263O110N6P+138O2，可以看出微藻能直接利用CO2，大大減少了固碳的時間。另外，由于水體中CO2與空氣CO2濃度含量差距較大，且CO2在水體中擴(kuò)散的速度僅為大氣中的萬分之一，微藻為了適應(yīng)水體較低濃度的CO2，建立了一套可以濃縮CO2的機(jī)制，以提高細(xì)胞內(nèi)CO2濃度從而保證高效的光合作用，因此，微藻在CO2的減排應(yīng)用上備受關(guān)注。

有些學(xué)者將固定CO2和污水處理結(jié)合起來，篩選出一些既能固定CO2又能清潔污水的微藻。如：趙云等[14]在光照強(qiáng)度240 μmol/（m·s）、初始氮濃度128 mg/L、通氣比0.3 m3/（m3·min）、通氣通斷間隔15 s/60 s 條件下培養(yǎng)小球藻，研究其對CO2固定和脫氮除磷效果，結(jié)果表明在培養(yǎng)期間，小球藻最高固碳速率達(dá)到564.67 mg/（L·d），氮、磷去除率分別為66.72%、55.95%。楊梟等[15]在微重力條件下研究小球藻在四種廢水中以及通入高濃度二氧化碳時的生長狀況，試驗(yàn)結(jié)果表明，小球藻在四種廢水中均能生長，且能有效吸收氮磷等污染物，通入高濃度CO2時，小球藻的固碳效率有顯著提升。耦合CO2減排和污水生態(tài)處理微藻資源化培養(yǎng)是現(xiàn)今環(huán)境領(lǐng)域關(guān)注的主題，但現(xiàn)在大多學(xué)者主要關(guān)注的是CO2耐受藻的選擇及微藻對工業(yè)CO2的吸收效果研究，忽略了微藻在自然條件下對CO2的吸收。因此本次試驗(yàn)選取斜生柵藻（Scenedesmus obliquus）、 綠球藻（Chlorococcumsp.）和普通小球藻為試驗(yàn)對象，研究三種微藻在相同條件下對尿素氮、硝態(tài)氮、銨態(tài)氮的去除率及對CO2固定的效率。

1 材料與方法

1.1 材料

斜生柵藻、綠球藻和普通小球藻由天津農(nóng)學(xué)院天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，均培養(yǎng)于BG-11 培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件如下：溫度25 ℃，光照強(qiáng)度4 000 lx，光暗比12 h∶12 h。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計

將對數(shù)生長期的斜生柵藻、綠球藻和普通小球藻分別接種至無碳源且以尿素氮（CH4N2O）、硝態(tài)氮（NaNO3）和銨態(tài)氮（NH4Cl4）為混合氮源的BG-11 培養(yǎng)基中，各氮素質(zhì)量比為1∶1∶1，氮的質(zhì)量濃度為247 mg/L，藻細(xì)胞初始密度均為1×106cells/mL，培養(yǎng)體積為1.5 L，每組設(shè)3 個平行，培養(yǎng)周期為6 d，期間持續(xù)通入空氣（流速為300 mL/min）以提供碳源，培養(yǎng)條件與藻種培養(yǎng)時一致，每天震蕩3 次。取樣測定培養(yǎng)液中尿素氮、硝態(tài)氮和銨態(tài)氮的含量及微藻的細(xì)胞密度和干重。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 培養(yǎng)液中各成分氮的測定方法

采用鋅鎘還原法測定硝態(tài)氮[16]（GB17378.4-2007），采用納氏試劑法測定銨態(tài)氮[17]（GB17378.4-2007），尿素氮采用國際標(biāo)準(zhǔn)二乙酰一肟分光光度法[18]（GB/T 18204.29-2000）。

1.3.2 微藻細(xì)胞密度—吸光度曲線建立

以微藻細(xì)胞密度為橫坐標(biāo)，不同密度微藻在750 nm 處的吸光值為縱坐標(biāo)，分別作出三種微藻與吸光值之間的相關(guān)性標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而通過測定吸光值確定微藻細(xì)胞密度。經(jīng)測定斜生柵藻、綠球藻和普通小球藻細(xì)胞密度與吸光度之間的關(guān)系分別為：y＝0.000 6x+0.417 4，R2＝0.997 6；y＝0.001 1x+0.252 1，R2＝0.990 5 和y＝0.000 6x+0.191 4，R2＝0.990 8。

1.3.3 微藻干重-吸光度曲線建立

微藻細(xì)胞干重測定是將孔徑為0.45 μm 的玻璃纖維濾膜編號后放置于105 ℃烘箱內(nèi)烘干過夜至恒重后稱重，并記錄為W1。取不同濃度的柵藻、綠球藻和小球藻藻液各20 mL，通過0.45 μm 玻璃纖維濾膜抽濾，將帶有藻體的濾膜分別放于105 ℃烘箱內(nèi)烘干至恒重，稱取其質(zhì)量W2，各種藻類的兩次質(zhì)量之差即為微藻干重。將不同濃度的三種微藻利用分光光度計于750 nm處分別測定吸光值，并各記錄為A。從而建立微藻干重與吸光度之間的曲線。經(jīng)測定斜生柵藻、綠球藻和普通小球藻三者細(xì)胞干重與吸光度之間的關(guān)系分別為：y＝1.615 1x+0.396 4，R2＝0.999 8；y＝1.812 7x+0.157 5，R2＝0.998 7 和y＝1.694 7x+0.211 6，R2＝0.993 4。

1.4 微藻比生長率、生物量生產(chǎn)率及CO2 固定速率計算

1.4.1 微藻的比生長率及生物量生產(chǎn)率

微藻的比生長率及生物量生產(chǎn)率計算參考文獻(xiàn)[19]，公式如下：

式中：t為培養(yǎng)時間，d；Nt2、Nt1為第t2天和第t1天微藻細(xì)胞密度，cells/mL；μ為微藻比生長率，d-1。

式中xP表示微藻生物量產(chǎn)率[g/（L·d）]；Xt表示時間t（d）藻細(xì)胞干重（g/L）；X0表示時間t0（d）初始接種液藻細(xì)胞干重（g/L）。

1.4.2 微藻CO2的固定速率

微藻CO2的固定速率計算方法參考文獻(xiàn)[20]，公式如下：

式中：為CO2固定速率[/（L·d）]；Px為微藻最大生物量產(chǎn)率[g/（L·d）]；Cc 為微藻干細(xì)胞含碳率，研究分析表明，微藻細(xì)胞干重含碳率為50%；為CO2的分子質(zhì)量，44；MC為C 原子質(zhì)量，12。

1.4.3 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用Origin 2018、Excel 2019 進(jìn)行繪圖，使用SPSS 單因素方差分析和LSD 多重比較進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 三種微藻生長曲線

如圖1 所示，在相同條件下三種微藻生長曲線呈現(xiàn)指數(shù)增長，符合微藻生長規(guī)律。從第三天開始，三種微藻生長差異顯著（P＜0.05），普通小球藻的細(xì)胞密度顯著高于斜生柵藻和綠球藻（P＜0.05）。第六天時斜生柵藻、綠球藻和普通小球藻細(xì)胞密度分別為687.67×104、616.87×104和1161.52×104cells/mL。

圖1 三種藻類的生長曲線

2.2 三種微藻比生長率變化及CO2 的固碳速率

微藻比生長率見表1，培養(yǎng)期間三種微藻的比生長率均呈先上升后下降趨勢，以第三天時最高；三種藻類間以普通小球藻最高，第三天時為0.87 d-1，顯著高于斜生柵藻和綠球藻（P＜0.05）。第六天時，斜生柵藻、綠球藻和普通小球藻的比生長率分別為0.18、0.19、0.15 d-1，三者間無顯著差異（P＞0.05）。試驗(yàn)期間，在通入300 mL/min 自然空氣情況下，普通小球藻對CO2的固定速率呈先上升后下降的趨勢（圖2），第三天達(dá)到最大值，為0.217 g/（L·d），顯著高于綠球藻和斜生柵藻（P＜0.05）；斜生柵藻和綠球藻在第六天達(dá)到最大值，分別為0.125 和0.142 g/（L·d），普通小球藻為0.119 g/（L·d），此時三者間無明顯差異。

表1 微藻比生長率 d-1

圖2 三種微藻CO2 固碳速率

2.3 三種微藻對不同氮源的去除率

斜生柵藻對三種氮源的去除率如圖3 所示，自第一天開始，斜生柵藻對尿素氮、硝態(tài)氮、銨態(tài)氮的去除率存在顯著差異（P＜0.05），至第六天時，培養(yǎng)液中三種氮源濃度分別為6.73、73.44、81.54 mg/L，去除率分別為92.86%、79.28%、22.86%，斜生柵藻對尿素氮的去除率顯著高于對硝態(tài)氮和銨態(tài)氮的去除率（P＜0.05）。綠球藻對三種氮源的去除率在第二天開始存在顯著差異（P＜0.05），第六天時，培養(yǎng)液中尿素氮、硝態(tài)氮和銨態(tài)氮的濃度分別為20.78、70.56 和64.00 mg/L，綠球藻對硝態(tài)氮的去除率為80.10%，顯著高于對尿素氮（77.98%）和銨態(tài)氮（39.45%）的去除率?？梢娋G球藻對硝態(tài)氮的去除效果優(yōu)于尿素氮和銨態(tài)氮。普通小球藻對三種氮源的去除率從第三天開始存在顯著性差異（P＜0.05），第六天時，培養(yǎng)液中尿素氮、硝態(tài)氮、銨態(tài)氮濃度分別為35.89、67.20、69.07 mg/L，對三種氮源的去除率分別為61.96%、81.04%、34.66%，三者間存在顯著差異（P＜0.05），說明普通小球藻對硝態(tài)氮的去除效果最好。

圖3 三種微藻對不同氮源的去除率

3 討論

3.1 三種微藻的生長及固碳速率

微藻由于自身的結(jié)構(gòu)特性，能夠進(jìn)行光合作用，合成有機(jī)物，滿足自身生長需求并儲存多余能量。通過食物鏈，將固定的碳傳遞至魚類、鳥類或哺乳類等高等生物，這些生物的排泄物又可被低等生物利用。經(jīng)食物鏈的傳遞，一部分碳被固定進(jìn)入底泥，另外一部分被移出水體。相對于森林儲存的碳幾百年內(nèi)大部分會重返大氣，儲存在水體中的碳則幾乎很少返回大氣[21]。據(jù)測算小球藻、柵藻和水華魚腥藻含碳量分別達(dá)46.38%、51.28%和68.76%。因此藻類被公認(rèn)為提高碳匯的重要載體。了解微藻的自然生長及固碳速率可以為碳匯測算提供理論基礎(chǔ)。

本研究中三種藻類在培養(yǎng)期間細(xì)胞密度隨時間的增加而增加，說明在該條件下三種微藻均能正常生長。三種微藻比生長率逐漸上升在第三天達(dá)到最大值，隨后降低，其中普通小球藻的平均比生長率高于綠球藻和斜生柵藻，說明普通小球藻在培養(yǎng)期間物質(zhì)積累最多，且藻種不同物質(zhì)積累的速率也有差異。

CO2作為光合作用的必要條件之一，其固定速率反應(yīng)了微藻對CO2的吸收轉(zhuǎn)化能力，對我們篩選和評價微藻固定CO2能力有重要意義。不同微藻固碳能力不同[22]，因此了解微藻的固碳差異對后續(xù)研究具有現(xiàn)實(shí)意義。劉明升等[23]對水華魚腥藻（Anabaena flos-aquae）、小顫藻（Oscillatoriatenuis）、阿氏顫藻（Oscillatoria agardhii）、水網(wǎng)藻（Hydrodictyon reticulatum）、斜生柵藻和鞘藻（Oedogonium sp.）六種淡水微藻在相同條件下進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)六種微藻的固碳速率有顯著差異；衛(wèi)晴等[24]以藻液初始濃度A680＝0.3±0.1 接種，無碳的BG-II 培養(yǎng)基為基礎(chǔ)通入0.04%、5.00%和20.00%的CO2（v/v），氣體流量為200 mL/min 的條件下，研究兩株綠藻對CO2濃度響應(yīng)，結(jié)果表明在0.04%條件下小球藻FACHB-1580 和柵藻FACHB-1618 CO2平均固定效率分別為0.352 和0.425 g/（L·d），5.00%和20.00% CO2條件下平均固碳速率均高于0.04%。本文中普通小球藻、綠球藻和斜生柵藻平均固碳速率分別為0.115、0.096和0.067 g/（L·d），說明在整個培養(yǎng)期間，普通小球藻吸收的CO2比綠球藻和斜生柵藻多，具有較好效果。其中普通小球藻與斜生柵藻平均固碳速率低于衛(wèi)晴的試驗(yàn)結(jié)果，這可能與微藻初始濃度及氮源不同有關(guān)。普通小球藻固碳速率在第三天出現(xiàn)拐點(diǎn)，這是由于細(xì)胞密度較大，藻液對光的掩蔽效應(yīng)增強(qiáng)，光合作用變?nèi)酢?/p>

3.2 微藻對不同氮源的吸收和利用

微藻能直接利用水體中的銨態(tài)氮，通過轉(zhuǎn)氨基，迅速合成自身所需氨基酸；而硝態(tài)氮和尿素氮需要經(jīng)過硝酸酶和尿素酶通過還原和脫羧產(chǎn)生銨態(tài)氮，最終被微藻吸收[25]。當(dāng)硝態(tài)氮、尿素氮作為唯一氮源時，藻類生長需要面臨更多的還原壓力，因此硝態(tài)氮、尿素氮被認(rèn)為不是一種經(jīng)濟(jì)的生存策略。但不同微藻對不同形態(tài)的氮源利用存在差異，且對濃度要求也不一樣，如：低濃度銨態(tài)氮促進(jìn)銅綠微囊藻生長，高濃度會對其產(chǎn)生生長脅迫[26]。

研究發(fā)現(xiàn)，硝酸氮是小球藻最適氮源，而王順昌等[27]發(fā)現(xiàn)尿素對蛋白小球藻生長、色素積累優(yōu)于硝態(tài)氮和銨態(tài)氮；胡章喜等[28]研究不同氮源對布朗葡萄藻（Botryococcus braunii）生長、總脂和總烴含量的影響中發(fā)現(xiàn)硝態(tài)氮是布朗葡萄藻764 和布朗葡萄藻765 較好的氮源；胡章喜等[28]指出相同條件下，亞心形扁藻（Platymonassubcordiformis）對尿素氮的去除利用優(yōu)于硝態(tài)氮和銨態(tài)氮，可見微藻種類、培養(yǎng)條件均會影響其對氮源的吸收。本試驗(yàn)中，三種微藻均能利用尿素氮、硝態(tài)氮、銨態(tài)氮，且尿素氮和硝態(tài)氮的去除率均顯著高于銨態(tài)氮，說明三種微藻對不同氮源去除存在差異。斜生柵藻對三種不同氮源去除率為：尿素氮＞硝態(tài)氮＞銨態(tài)氮，綠球藻為：硝態(tài)氮＞尿素氮＞銨態(tài)氮，普通小球藻為：硝態(tài)氮＞尿素氮＞銨態(tài)氮，三種微藻對不同氮源的去除率均不同，與微藻優(yōu)先利用銨態(tài)氮的說法有所差異。我們認(rèn)為是同一微藻在單一氮源和混合氮源中對氮源的吸收有所差異造成的。馬紅芳等[29]的研究結(jié)果表明，斜生柵藻偏好銨態(tài)氮，但楊坤等[30]在柵藻和小球藻對養(yǎng)殖廢水的試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)在混合氮源中，硝態(tài)氮的濃度大于銨態(tài)氮時，硝態(tài)氮的存在會抑制微藻對銨態(tài)氮的吸收。本文三種微藻銨態(tài)氮去除率最低，與上述結(jié)論相符。除此之外，對比三種微藻發(fā)現(xiàn)，不同微藻在相同混合氮培養(yǎng)下，單一氮源對其他形式氮源的影響也具有差異。斜生柵藻尿素氮抑制硝態(tài)氮和銨態(tài)氮的吸收，綠球藻及普通小球藻硝態(tài)氮抑制尿素氮和銨態(tài)氮的吸收。因此，選擇微藻處理污水時，既要考慮微藻的特性也要考慮其他氮源的影響。