付成國，張 穎，張美琪，李 雙，高 嵩，徐 建，鄢必新

（吉林修正藥業(yè)新藥開發(fā)有限公司，吉林省中藥標(biāo)準(zhǔn)化關(guān)鍵工程技術(shù)重點實驗室·吉林 長春·130103）

溫膽湯出自唐代孫思邈《備急千金要方》，方曰：“治大病后，虛煩不得眠，此膽寒故也，宜服此溫膽湯方”[1]。 該方由清半夏、竹茹、麩炒枳實、陳皮、生姜、炒甘草共6 味藥材組成。 傳統(tǒng)功能主治脾胃不和，痰熱內(nèi)擾之虛煩不眠，或嘔吐呃逆，或驚悸不寧可等癥?，F(xiàn)代研究表明其對神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)等疾病均有一定的療效[2]。中藥指紋圖譜可以科學(xué)、系統(tǒng)、全面地反應(yīng)中藥的復(fù)雜化學(xué)成分組成[3]，指紋圖譜技術(shù)應(yīng)用日益廣泛，不僅應(yīng)用于中藥的含量測定，還是對中藥已知成分和未知成分進(jìn)行整體評價和分析的質(zhì)量控制方法。 指紋圖譜技術(shù)已經(jīng)成為中藥材和制劑控制質(zhì)量的重要手段之一。 有關(guān)溫膽湯指紋圖譜的研究報道較少[4]，本文通過HPLC 法建立了10 批溫膽湯的指紋圖譜，并采用相似度評價軟件，客觀地反映了溫膽湯化學(xué)成分的整體性、復(fù)雜性及質(zhì)量差異，為溫膽湯的物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供了實驗依據(jù)[5-8]。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

戴安U3000 高效液相色譜儀， 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；MS105DU 型電子天平，梅特勒-托利多公司；TOLEDO XPR2 型百萬分之一分析天平，梅特勒-托利多公司；SB25-12DT 型超聲波清洗器，寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 試劑與試藥

1.2.1 試藥

溫膽湯樣品 （批號：230101 ～230105；230201 ～230205），均由修正藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司提供；甘草苷（批號：111610-201607）、 柚皮苷（批號：110722-202116）、蕓香柚皮苷（批號：2014-0025）、橙皮苷（批號：110721-202019）、 新橙皮苷 （批號：111857-201804）、甘草酸銨（批號：110731-201418）、6-姜辣素（批號：111833-202007），中國食品藥品檢定研究院。

1.2.2 試劑

乙腈為色譜純；甲醇、甲酸、磷酸，均為分析純；水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Agilent ZORBAX SB C18色譜柱 （柱長為250mm，內(nèi)徑為4.6mm，粒徑為5μm )；以乙腈為流動相A，以0.3%磷酸溶液為流動相B，按下表中規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫；檢測波長為237nm；柱溫為25℃；流速1ml/min，進(jìn)樣量為10μL。 理論板數(shù)按柚皮苷峰計算應(yīng)不低于10000。

時間（分鐘）流動相A（%）流動相B（%）0～1412→2088→80 14～1520→1580→85 15～191585 19～2015→2085→80 20～352080 35～5020→7280→28 50～6072→1228→88

2.2 對照品溶液的制備

取甘草苷、蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、甘草酸銨、6-姜辣素，精密稱定，分別加甲醇制成每lml 含20μg 的溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備

取溫膽湯樣品1g， 置具塞錐形瓶中， 精密加入50%甲醇15ml， 稱定重量， 超聲處理30 分鐘 （功率250W，40KHz），放冷，再稱定重量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 方法學(xué)考察[9-10]

2.4.1 精密度試驗

精密吸取“2.3”項下的供試品溶液10μL，按照“2.1”項下的色譜條件和指紋圖譜測定方法，連續(xù)進(jìn)樣6 次，進(jìn)行測定，記錄指紋圖譜數(shù)據(jù)，選取柚皮苷作為參照峰（S 峰），計算共有峰的相對保留時間和相對峰面積，分別考察其RSD 值，結(jié)果相對保留時間RSD均小于0.5%，相對峰面積RSD 均小于5.0%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 重復(fù)性試驗

取同一批供試品（批號：230204），按“2.3”項下方法制備6 份供試品溶液，按照“2.1”項下的色譜條件進(jìn)行測定，選取柚皮苷作為參照峰（S 峰），計算共有峰的相對保留時間和相對峰面積。 分別考察其RSD值，結(jié)果相對保留時間RSD 均小于0.5%，相對峰面積RSD 均小于5.0%，表明該方法的重復(fù)性較好。

2.5 指紋圖譜的建立

2.5.1 參照物選擇

指紋圖譜的參照物主要用于考察指紋圖譜的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性，并有助于色譜峰的辯認(rèn)，起著辯認(rèn)和評價色譜指紋圖譜共有峰的指引作用。在溫膽湯指紋圖譜色譜圖中，因柚皮苷峰（7 號峰）其保留時間適中，峰面積較大，分離度較好，所以選為參照峰（S 峰）。

2.5.2 共有模式的建立

取10 批溫膽湯樣品， 批號分別為 （230101－230105；230201－230205），分別進(jìn)行檢測，結(jié)合重復(fù)性試驗結(jié)果，去除相對峰面積較小、峰形不佳等易受影響，導(dǎo)致檢測結(jié)果不穩(wěn)定的色譜峰。將10 批樣品測定指紋圖譜導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)，經(jīng)多點校正，將色譜峰匹配，生成對照圖譜，確定15 個指紋峰。 10 批樣品指紋圖譜相似度均大于0.9。 其相對保留時間和相對峰面積結(jié)果分別見表1 和表2。

表1 10 批樣品相對保留時間考察結(jié)果

表2 10 批樣品相對峰面積考察結(jié)果

2.5.3 峰指認(rèn)

取甘草苷、蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、甘草酸銨、6-姜辣素適量，精密稱定，分別用甲醇制成每lml 含20μg 的溶液，依法測定。 通過上述對照品色譜峰進(jìn)行指認(rèn)。結(jié)果表明，峰4 為甘草苷、峰5 為蕓香柚皮苷、峰7 為柚皮苷、峰8 為橙皮苷、峰9 為新橙皮苷、峰12 為甘草酸銨、峰13 為6-姜辣素。

3 結(jié)論

建立了溫膽湯指紋圖譜測定方法， 確定了15 個指紋峰，分別指認(rèn)了7 個指紋峰。 建立的指紋圖譜方法能有效表征溫膽湯的質(zhì)量情況，是成品質(zhì)量控制方法的提升和完善，能全面有效地控制產(chǎn)品質(zhì)量，結(jié)果見圖1。

圖1 10 批溫膽湯指紋圖譜疊加圖及其對照指紋圖譜（R）

4 討論

在不同檢測波長[11]（237nm、257nm、283nm、327nm）下分別進(jìn)樣檢測， 分析后發(fā)現(xiàn)在237nm 時色譜峰出峰較多， 各峰比例和峰型較佳， 分離度好， 故選擇237nm 作為檢測波長進(jìn)行后續(xù)檢測。 分別考察了乙腈-0.1%甲酸水、乙腈-0.1%磷酸水、乙腈-0.3%磷酸水等流動相梯度洗脫系統(tǒng)，結(jié)果表明，以乙腈-0.3%磷酸水為流動相梯度洗脫，色譜峰基線噪音小，峰型好，分離效果最佳，確定乙腈-0.3%磷酸水為流動相。實驗中10 批樣品的批號分別為（230101－230105；230201－230205），在10 批樣品中，15 個共有峰中未標(biāo)定的成分， 有待進(jìn)一步采用對照品或液-質(zhì)聯(lián)用技術(shù)進(jìn)一步分析確定，為后續(xù)建立經(jīng)典名方溫膽湯的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供參考[12-13]。