許穎捷，童喬瑩，尚婷荷，于鵬，邵博，賈夢瑩，龔忠誠*

1新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院(附屬口腔醫(yī)院)口腔頜面腫瘤外科，新疆烏魯木齊 830054；2新疆維吾爾自治區(qū)口腔醫(yī)學(xué)研究所，新疆烏魯木齊 830054

顳下頜關(guān)節(jié)紊亂病(temporomandibular joint disease，TMD)中顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎(temporomandibular joint osteoarthritis， TMJOA) 多由結(jié)構(gòu)紊亂病(internal derangement，ID)發(fā)展而來[1]，其病理特征包括關(guān)節(jié)軟骨退化、骨贅生物形成、滑膜炎癥等[2-3]。對于TMD 的治療應(yīng)遵循規(guī)范[4]，但基于現(xiàn)有研究，尚無有效方法阻止骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)的進展[5-6]。關(guān)節(jié)慢性疼痛嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，因此探討疼痛機制對TMJOA的診治與療效具有重要意義。已有大量研究證實因素可作為獨立危險因素參與TMD的發(fā)展[7-8]?？陬M系統(tǒng)是處于咬合、神經(jīng)、咀嚼肌與關(guān)節(jié)支配下的統(tǒng)一整體，TMJOA的發(fā)生多歸因于顳下頜關(guān)節(jié)生物力學(xué)因素的變化[9]，通過三維有限元分析的研究也證實了錯畸形可誘導(dǎo)關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)的生物力變 化[10]。 大 鼠 單 側(cè) 前 牙 反(unilateral anterior crossbite，UAC)咬合紊亂動物模型，在異常力學(xué)刺激下誘導(dǎo)顳下頜關(guān)節(jié)形成經(jīng)典的OA[11-12]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，伴有錯的TMJOA患者顳下頜關(guān)節(jié)滑液中高表達白細(xì)胞介素(IL)-1β和IL-18[13]。前列腺素E2(PGE2)作為重要的炎性因子可刺激感覺神經(jīng)從而引起疼痛，在此過程中還可通過其EP2 受體(PTGER2)進行作用。PGE2 水平主要由環(huán)氧合酶2(COX2)的變化調(diào)節(jié)。PGE2、COX2 的水平增高與炎癥性疼痛的病理機制密切相關(guān)。有研究表明，COX2和PGE2表達水平升高參與了機械應(yīng)力引起的骨細(xì)胞早期變化[14]。巨噬細(xì)胞移動抑制因子(macrophage migration inhibitory factor，MIF)是一種多效細(xì)胞因子，可調(diào)節(jié)先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)。有研究發(fā)現(xiàn)，OA滑液中MIF的含量高于正?；海襇IF-/-小鼠OA骨質(zhì)破壞、滑膜炎癥及贅生物形成情況較野生型小鼠OA模型明顯減輕[15]。因此，研究關(guān)節(jié)中MIF、疼痛介質(zhì)的水平可為TMJOA 的靶向治療提供理論基礎(chǔ)。本研究初步探討在異常應(yīng)力的刺激下，滑膜對MIF、COX2和PGE2分泌的促進在TMJOA進展中的作用及意義，旨在為TMJOA的臨床治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑 36只6周齡雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，體重120～150 g，購自新疆醫(yī)科大學(xué) 動 物 實 驗 中 心。IL-1β、IL-18、MIF、COX2 和PTGER2購自美國Abcam 公司，MIF、COX2和PGE2 ELISA 試劑盒購自上海江萊生物科技有限公司，cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Thermo Fisher公司，實時定量PCR試劑盒購自德國QiaGen公司。

1.2 研究方法

1.2.1 臨床研究對象 收集2020 年1 月—2021 年12月就診于新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院顳下頜關(guān)節(jié)專病門診明確診斷為TMD且需行顳下頜關(guān)節(jié)盥洗術(shù)的60 例患者的資料，并根據(jù)?？茩z查及輔助檢查分為TMJID 組(n=30)與TMJOA 組(n=30)，TMJOA 組再根據(jù)分期將患者分為TMJOA Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期(n=10)。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)TMD中診斷為ID(關(guān)節(jié)盤可復(fù)性前移位、關(guān)節(jié)盤不可復(fù)性前移位)、OA(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期)的患者；(2)臨床?？茩z查和(或)影像學(xué)輔助檢查中存在個別牙錯的患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)確定診斷為兩種及以上的關(guān)節(jié)疾患；(2)顏面部外傷史；(3)骨骼不對稱；(4)全身系統(tǒng)性疾病、內(nèi)分泌系統(tǒng)疾??；(5)近期服用激素及免疫類藥物；(6)妊娠期及哺乳期；(7)急性或慢性感染期。本研究已獲新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(K201910-04)，所有患者均簽署知情同意書。

1.2.2 動物模型建立及分組 將SD大鼠隨機分為對照組及實驗組，每組18只。其中實驗組采用單側(cè)前牙反(unilateral anterior crossbite，UAC)模型[8]誘導(dǎo)大鼠顳下頜關(guān)節(jié)產(chǎn)生軟骨退行性改變。選取25號的牛通乳針切割分段為2.5 mm，作為左上頜中切牙的金屬“套筒”裝置，選取20 號牛通乳針截取8 mm分段，其中3.5 mm 處管腔閉合向唇側(cè)彎制形成平面導(dǎo)板，與剩余體部長軸呈135°，體部下端安裝在左側(cè)下頜金屬“套筒”裝置以形成UAC狀態(tài)。將實驗組分為UAC-4 周組、UAC-8 周組和UAC-12 周組(n=6)，對照組分為Ctrl-4 周組、Ctrl-8 周組和Ctrl-12 周組(為同等培養(yǎng)條件但無咬合干預(yù)，n=6)，并分別于4、8、12 周處死，左側(cè)顳下頜關(guān)節(jié)軟骨進行分子生物學(xué)檢測，右側(cè)顳下頜關(guān)節(jié)用作形態(tài)學(xué)檢測。

1.3 視覺模擬評分(visual analogue scale，VAS) 告知患者VAS 評分刻度代表含義(0 分表示無痛不適，10分表示疼痛劇烈)，根據(jù)患者感受自身疼痛情況評估后填寫咬合狀態(tài)下的關(guān)節(jié)VAS數(shù)值。

1.4 顳下頜關(guān)節(jié)盥洗收集滑液及透明質(zhì)酸鈉注射于顳下頜關(guān)節(jié)下腔注射2%利多卡因1 ml，麻醉盥洗，沖洗出關(guān)節(jié)腔中的免疫物質(zhì)，收集滑液盥洗物1 ml，以備行ELISA分析。隨后同一位點注射透明質(zhì)酸鈉1.5 ml以潤滑關(guān)節(jié)。

1.5 大鼠顳下頜關(guān)節(jié)滑液及血清收集及處理 大鼠麻醉后，取側(cè)臥位固定大鼠頭頸部，常規(guī)消毒，使用1 ml注射器抽取200 μl生理鹽水后進針入關(guān)節(jié)腔，

有落空感后回抽，無血性滲出物及回抽阻力時進行關(guān)節(jié)腔盥洗。使用做好標(biāo)記200 μl EP 管收集對應(yīng)分組的關(guān)節(jié)滑液，在-80 ℃低溫條件下歸檔保留，檢測前3000 r/min離心20 min。隨后取仰臥位固定大鼠前肢及左后肢，常規(guī)消毒后取腹部正中切口暴露腹主動脈血管鞘，使用一次性采血針及采血管收集動脈血，常溫環(huán)境下靜置30 min時血清血漿初步分離。將動脈血以3000 r/min 離心15 min 以分離血清及血漿。使用1.5 ml EP 管收集上層血清，注意避免吸入血漿，放入-80 ℃低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 髁突取材及Micro-CT掃描髁突及微結(jié)構(gòu)分析取耳前區(qū)切口，逐步分離組織后暴露顳下頜關(guān)節(jié)表面，打開關(guān)節(jié)囊暴露下頜骨髁突，充分游離并小心取下髁突組織，在體視顯微鏡下充分觀察顳下頜關(guān)節(jié)髁突的關(guān)節(jié)表面和滑膜組織，然后將其置于4%多聚甲醛溶液中固定，行Micro-CT 掃描檢測，分析微觀結(jié)構(gòu)骨的相關(guān)指標(biāo)[組織體積(tissue volume，TV)、骨表面積(bone surface，BS)、骨體積(bone volume，BV)、骨表面積/骨體積(bone surface/bone volume，BS/BV)和骨體積分?jǐn)?shù)(骨體積/組織體積，bone volume/tissue volume，BV/TV)]及骨小梁分析指標(biāo)[骨小梁厚度(trabecular thickness，Tb.Th)及骨小梁數(shù)(tabecular number，Tb.N)]，以觀察骨丟失與改建情況。

1.7 ELISA 檢測關(guān)節(jié)滑液或血清中MIF、COX2 和PGE2的表達情況 從室溫平衡60 min后的鋁箔袋中取出所需的板條，設(shè)置MIF 標(biāo)準(zhǔn)品孔、空白孔和樣本孔。標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的MIF 標(biāo)準(zhǔn)品50 μl。樣本孔中加待測樣本50 μl，空白孔加樣本稀釋液50 μl。每孔加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的檢測抗體100 μl，用封板膜封住反應(yīng)孔，37 ℃恒溫箱溫育60 min。棄去液體，吸水紙上輕輕拍干，每孔加350 μl洗滌液，靜置1 min后棄去洗滌液，重復(fù)5次。每孔分別加入底物A、B 液各50 μl，37 ℃避光孵育15 min。每孔加入終止液50 μl，于15 min 內(nèi)，在450 nm 波長處測定各孔的OD 值。采用同樣的方法檢測關(guān)節(jié)滑液或血清中COX2和PGE2的濃度。

1.8 大鼠源性滑膜成纖維樣細(xì)胞(fibroblast-like synoviocytes，F(xiàn)LSs)的提取及培養(yǎng) 于大鼠膝關(guān)節(jié)中線髕骨表面偏內(nèi)側(cè)垂直切開，逐層分離至滑膜組織，于雙側(cè)膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)腔取出滑膜組織，浸泡于含10%雙抗的高糖型DMEM(H-DMEM)中，冰盒低溫轉(zhuǎn)移入預(yù)先消毒完成的超凈工作臺。PBS沖洗5 min/次×3次，修剪滑膜組織達到1 mm×1 mm×1 mm 體積的塊狀碎片。使用等量的0.1% Ⅱ型膠原酶消化液混勻組織塊沉淀，置于37 ℃恒溫?fù)u床中，180 r/min條件下消化4 h。1000 r/min 離心5 min，吸棄上層混合液后僅留底層沉淀團塊。加入1 ml 完全培養(yǎng)基重懸組織細(xì)胞沉淀，經(jīng)過200 目銅網(wǎng)細(xì)胞篩過濾去除殘余未消化完全的組織塊。將過濾后細(xì)胞懸液接種到10 cm培養(yǎng)皿中，在37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)12 h 后置于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞貼壁情況，2～3 d首次更換上層完全培養(yǎng)基，而后根據(jù)細(xì)胞生長速度及狀態(tài)進行換液培養(yǎng)，最后得到原代FLSs。

1.9 循環(huán)流體流動剪切應(yīng)力(F F S S)裝置的構(gòu)建FFSS 循環(huán)裝置由蠕動泵、平板流動腔、細(xì)胞載片、連接管及雙口燒瓶組成。FFSS 干預(yù)組分別設(shè)定為：0 dyn/cm2(靜息狀態(tài))，1、3、5、10 dyn/cm2，干預(yù)1 h。取第3 代FLSs，按1×105個/ml 接種于載玻片上培養(yǎng)至90%貼壁率，連接流體剪切裝置，隨機按照以上分組進行干預(yù)。

1.10 實時定量PCR 檢測IL-1β、IL-18、MIF、COX2和PGE2mRNA 的表達情況 FLSs 按照FFSS 為0，1、3、5、10 dyn/cm2進行剪切應(yīng)力干預(yù)，用Trizol 裂解細(xì)胞并提取細(xì)胞內(nèi)總RNA，采用核酸定量儀對各組細(xì)胞總RNA進行定量，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。實時定量PCR引物序列見表1。反應(yīng)總體系為10 μl，其中正、反義引物各0.5 μl，2×SYBR Green 5 μl，cDNA 1 μl，無酶水3 μl。β-actin為內(nèi)參照基因，采用2-ΔΔCt法計算IL-1β、IL-18、MIF、COX2和PGE2mRNA相對表達水平。

1.11 Western blotting 檢 測IL-1β、 IL-18、 MIF、COX2和PGE2蛋白的表達情況 將實驗組分為UAC-4周組、UAC-8 周組和UAC-12 周組(n=6)，對照組分為Ctrl-4周組、Ctrl-8周組和Ctrl-12周組(為同等培養(yǎng)條件但無咬合干預(yù)，n=6)。大鼠分別于4、8、12 周各處死6只，用RIPA-蛋白抑制劑混合裂解液提取動物組織及細(xì)胞總蛋白，定量后行蛋白變性以維持其穩(wěn)定性，-80 ℃保存。將等量的各組總蛋白電泳分離后，電轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，用一抗(IL-1β 抗體1:1000、IL-18 抗體1:1000、MIF 抗體1:1000、COX2 抗體1:500和PTGER2 抗體1:500)4 ℃孵育過夜，用辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG 孵育1.5 h，然后采用化學(xué)發(fā)光顯色方法對PVDF膜進行曝光、顯影。

1.12 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 23.0 軟件進行統(tǒng)計分析，采用GraphPad Prism 8.0 軟件繪圖。計數(shù)資料以例(%)表示，僅進行統(tǒng)計描述。計量資料以±s表示，滿足正態(tài)性及方差齊性時，多組間比較采用單因素方差分析；不符合正態(tài)性及方差齊性時，多組間比較采用獨立樣本Mann-WhitneyU檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 TMJOA 組與TMJID 組患者一般資料比較 60例患者中，女38例，男22例，女性占比明顯高于男性。在TMJOA 組中，男10 例，女20 例，男女比例為1:2，年齡(37.7±8.9)歲，咬合檢查可見個別牙反患者占16.7%(5/30)，個別牙鎖患者占23.3%(7/30)，伴有其他錯的患者18 例。在TMJID 組中，女18例，男12例，年齡(29.5±7.0)歲，咬合檢查可見個別牙反患者占10.0%(3/30)，個別牙鎖患者占20.0%(6/30)，伴有其他錯的患者21例。?？撇轶w發(fā)現(xiàn)，TMJOA組患者在咬合狀態(tài)時均伴有關(guān)節(jié)疼痛，且11例伴張口受限；TMJID 組中23例患者伴有咬合狀態(tài)時疼痛不適，9例伴張口受限(表2)。

表2 TMJID患者與TMJOA患者一般資料比較(n=30)Tab.2 Comparison of general data of TMJID and TMJOA patients (n=30)

2.2 TMJOA Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期與TMJID 患者的VAS 評分比較 TMJOA Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ期患者的VAS評分高于TMJID組，且在TMJOA Ⅰ期(P＜0.0001)和TMJOA Ⅱ期(P＜0.0001)時差異有統(tǒng)計學(xué)意義(圖1)。

圖1 TMJOA Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期患者與TMJID 患者VAS 評分比較Fig.1 Comparison of VAS scores between TMJOA Ⅰ, Ⅱ, Ⅲstage patients and TMJID patients

2.3 患者顳下頜關(guān)節(jié)腔滑液MIF、PGE2和COX2的表達差異 ELISA 檢測結(jié)果顯示，與TMJID組比較，TMJOA組患者關(guān)節(jié)滑液MIF、PGE2和COX2表達水平明顯升高(P＜0.05，圖2)。此外，TMJOA Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期關(guān)節(jié)滑液中MIF、PGE2 和COX2 表達水平也明顯高于TMJID 組(P＜0.05，其中TMJOA Ⅱ期表達水平最高(圖3)。

圖2 TMJOA組與TMJID組患者關(guān)節(jié)腔滑液中MIF、COX2和PGE2的表達Fig.2 Expression of MIF, COX2 and PGE2 in synovial fluid of TMJOA and TMJID patients

圖3 TMJOA不同分期組與TMJID組滑液中MIF、COX2和PGE2的表達Fig.3 Expression of MIF, COX2 and PGE2 in synovial fluid between TMJOA Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ stage patients and TMJID patients

2.4 UAC對各組大鼠顳下頜關(guān)節(jié)微觀結(jié)構(gòu)的影響體視顯微鏡下可見，對照組髁突軟骨組織表面連續(xù)、平整未見明顯凹陷及缺損；與對照組比較，UAC 各干預(yù)組可見軟骨組織出現(xiàn)不同程度的凹陷變薄、充血，伴有裂隙甚至缺損，滑膜組織腫脹增厚伴有不同程度的充血。Micro-CT 掃描后可見隨著干預(yù)時間的延長，髁突體積逐漸縮小，骨小梁數(shù)量減少、間隙變寬，在UAC-12周組中可見髁突軟骨下骨表面凹陷缺損(圖4A)。與Ctrl-4 周、Ctrl-8 周和Ctrl-12 周相應(yīng)對照組比較，UAC-4 周、UAC-8 周和UAC-12 周組中的BV/TV(%)明顯降低(P＜0.01)；UAC-4周、UAC-8周和UAC-12周組中BS/BV均有所增加，但僅UAC-4周與Ctrl-4組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)；UAC-4周、UAC-8 周和UAC-12 周組中髁突骨質(zhì)的Tb.Th 有減少趨勢，但僅UAC-12周組較Ctrl-12周明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)；UAC-4周、UAC-8周組中髁突Tb.N 較對照組明顯降低(P＜0.05 或P＜0.01)，但UAC-12周組并無此趨勢(圖4B)。

2.5 TMJOA 大鼠模型血清及顳下頜關(guān)節(jié)腔滑液MIF、COX2 和PGE2 蛋白表達情況 ELISA 檢測顯示，UAC-4周、UAC-8周和UAC-12周組血清中MIF、COX2 和PGE2 的表達水平均高于相應(yīng)的對照組，其中僅UAC-8周組MIF、COX2與相應(yīng)對照組比較差異有 統(tǒng) 計 學(xué) 意 義(P＜0.05)，UAC-4 周、UAC-8 周 和UAC-12 周組血清中PGE2 與相應(yīng)對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。UAC-4 周、UAC-8 周和UAC-12周組關(guān)節(jié)腔滑液中的MIF、COX2 和PGE2 表達趨勢與血清中基本一致，與相應(yīng)對照組比較，UAC-8 周和UAC-12周組時MIF、COX2差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，UAC-4 周、UAC-8 周和UAC-12 周組關(guān)節(jié)滑液中PGE2 與相應(yīng)對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)(圖5)。

圖5 各組大鼠血清及顳下頜關(guān)節(jié)腔滑液MIF、COX2和PGE2表達水平比較(n=6)Fig.5 Comparison of MIF, COX2 and PGE2 expression levels in serum and synovial fluid of temporomandibular joint in each group(n=6)

2.6 各組顳下頜關(guān)節(jié)組織中IL-1β、IL-18、MIF、COX2 和PTGER2 表 達 情 況 Western blotting 檢 測 顯示，與Ctrl-4周組比較，UAC-4周組IL-1β、MIF表達水平明顯升高(P＜0.05)，COX2 蛋白表達水平明顯降低(P＜0.05)，而IL-18 及PTGER2 蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)；與Ctrl-8 周組比較，UAC-8周組IL-1β、IL-18、MIF、COX2及PTGER2蛋白表達水平均明顯升高(P＜0.05)；與Ctrl-12 周組比較，UAC-12周組IL-1β、IL-18、MIF及PTGER2蛋白表達水平升高(P＜0.05)，而COX2蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖6)。

圖6 各組關(guān)節(jié)組織中IL-1β、IL-18、MIF、COX2和PTGER2表達情況(n=6)Fig.6 Expression of IL-1β, IL-18, MIF, COX2 and PTGER2 in joint tissues of each group (n=6)

2.7 FFSS 對FLSs 形態(tài)的影響 以0、1、3、5 和10 dyn/cm2FFSS 干預(yù)FLSs 后，與0 dyn/cm2組比較，隨著FFSS負(fù)載增大，F(xiàn)LSs的形態(tài)發(fā)生明顯改變，表現(xiàn)為細(xì)胞腫脹，細(xì)胞膜不完整甚至破裂，細(xì)胞外可見碎片；FLSs 的數(shù)量也隨FFSS 負(fù)載增大而減少(圖7)。

2.8 FFSS 對FLSs 中IL-1β、IL-18、MIF、COX2和PGE2mRNA表達的影響 實時定量PCR檢測結(jié)果顯示，與0 dyn/cm2FFSS 組比較，1 dyn/cm2FFSS 組FLSs中的PGE2、IL-18、MIFmRNA水平明顯升高(P＜0.05)，而IL-1β、COX2mRNA 水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義；3 dyn/cm2FFSS 組FLSs 中IL-18、MIF及PGE2mRNA 水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，而IL-1β及COX2mRNA 水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)；5 dyn/cm2FFSS 組FLSs 中IL-1β、IL-18、MIF、PGE2mRNA 水平明顯升高(P＜0.05)，而COX2mRNA水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)；10 dyn/cm2FFSS組中FLSs 中 炎 性 因 子IL-1β、IL-18、MIF、COX2及PGE2mRNA水平均明顯升高(P＜0.05)(圖8)。

2.9 FFSS 對FLSs 中IL-1β、IL-18、MIF、COX2 和PTGER2 蛋白表達的影響 Western blotting 檢測顯示，與0 dyn/cm2組比較，各FFSS 干預(yù)組(1、3、5、10 dyn/cm2)的IL-1β、IL-18、MIF、COX2 及PTGER2蛋白表達水平均明顯升高(P＜0.05)。除外3 dyn/cm2組FLSs中的MIF，以及5 dyn/cm2組FLSs中的COX2、PTGER2，隨著FFSS 負(fù)載的增大，F(xiàn)LSs 中的IL-1β、IL-18、MIF、COX2 及PTGER2 蛋白表達水平逐漸增高(P＜0.05)(圖9)。

圖9 FFSS干預(yù)大鼠源性FLSs中的IL-1β、IL-18、MIF、COX2及PTGER2蛋白表達水平Fig.9 The protein expression of IL-1β, IL-18, MIF, COX2 and PTGER2 in rat FLSs under FFSS interferes

3 討 論

促炎細(xì)胞因子釋放引起的炎癥被認(rèn)為是OA患者疼痛的主要原因[9]。越來越多的證據(jù)表明，炎癥在TMJOA 的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用[16-17]?；ぱ装Y是較常見的早期發(fā)現(xiàn)的炎性疾病，通常會引起關(guān)節(jié)疼痛[18]。在OA中炎癥性滑膜中活化的滑膜細(xì)胞會產(chǎn)生分解代謝和促炎介質(zhì)，使分解軟骨的蛋白水解酶過量產(chǎn)生，從而導(dǎo)致軟骨基質(zhì)降解。釋放到滑液中的軟骨分解產(chǎn)物被滑膜細(xì)胞吞噬，從而形成正反饋回路加劇滑膜炎癥。MIF在體外可抑制巨噬細(xì)胞遷移，同時對單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、T細(xì)胞和B細(xì)胞也具有趨化活性[19-20]。研究發(fā)現(xiàn)，MIF可調(diào)節(jié)IL-1家族蛋白(IL-1α、IL-1β 和IL-18)的表達與釋放[21]，本課題組前期發(fā)現(xiàn)TMJOA 組患者關(guān)節(jié)滑液中高表達IL-1β 和IL-18[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，與TMJID 組比較，TMJOA 組MIF、COX2和PGE2表達水平明顯升高，且在TMJOA Ⅱ期患者滑液中的表達水平最高，與VAS評分趨勢一致，提示MIF、COX2和PGE2表達水平與TMJOA疼痛評分呈正相關(guān)。近來有研究發(fā)現(xiàn)，PGE2在成骨細(xì)胞系中大量分泌[22]，并作為疼痛介質(zhì)可通過感覺神經(jīng)的信號傳遞作用反饋調(diào)節(jié)骨代謝的平衡穩(wěn)態(tài)[14,22]。本研究還發(fā)現(xiàn)TMJOA Ⅲ期患者滑液中MIF、COX2和PGE2的表達水平較Ⅱ期患者降低，后續(xù)將繼續(xù)關(guān)注MIF參與COX2-PGE2信號通路促進TMJOA發(fā)展的潛在作用機制。

近年來，多數(shù)研究將咬合作為TMD的主要危險因素，且發(fā)現(xiàn)第三磨牙伸長、早接觸、鎖[23]和反[24]可促進TMD的發(fā)生。關(guān)節(jié)在生理條件下受到各種生物力學(xué)(壓縮應(yīng)力、拉伸應(yīng)力、FFSS等)刺激[25]。異常咬合形成過大的應(yīng)力可直接影響關(guān)節(jié)組織的結(jié)構(gòu)和功能。目前，UAC 誘導(dǎo)模型已廣泛用于嚙齒類動物OA的研究中，如關(guān)節(jié)盤退變[26]、咬肌萎縮[27]、軟骨中異常礦物沉積[8]、軟骨下骨丟失[28]、軟骨細(xì)胞自噬與凋亡[29]等。本研究發(fā)現(xiàn)，UAC 干預(yù)形成的異常應(yīng)力會導(dǎo)致關(guān)節(jié)髁突軟骨下骨的吸收及病理性退行性變，且UAC誘導(dǎo)TMJOA大鼠模型的血清和關(guān)節(jié)滑液中MIF、COX2 和PGE2 表達水平升高，其中關(guān)節(jié)滑液局部的MIF水平是血清中的6～8倍，提示MIF可作為TMJOA 的生物標(biāo)記物。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，UAC 形成的異常應(yīng)力作用于顳下頜關(guān)節(jié)組織后可引起無菌性炎癥，并促進MIF 和疼痛介質(zhì)COX2 和PGE2的釋放，提示異常應(yīng)力可上調(diào)上述因子，并參與TMJOA的進展及疼痛。

FLSs 可分泌多種可溶性炎性介質(zhì)和細(xì)胞因子，并在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[30]。顳下頜關(guān)節(jié)的生理功能與咬合因素之間的生物應(yīng)力關(guān)系密切，為了模擬生物應(yīng)力的刺激，本研究將FLSs暴露于不同F(xiàn)FSS條件下刺激以形成OA細(xì)胞模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)LSs暴露于FFSS后出現(xiàn)損傷，且IL-1β、IL-18和COX2、PGE2(PTGER2)的mRNA 和蛋白的表達水平均明顯升高，促進了炎癥的發(fā)生。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，MIF 與疼痛相關(guān)介質(zhì)COX2及PGE2在伴有錯畸形的TMJOA滑液中高表達，異常流體流動剪切應(yīng)力下FLSs分泌MIF、COX2和PGE2參與關(guān)節(jié)微環(huán)境炎癥和疼痛。但本研究仍存在一定的局限性：未在異常應(yīng)力的干預(yù)下敲低MIF來觀察TMJOA中疼痛介質(zhì)的動態(tài)改變。因此，在異常應(yīng)力的作用下，F(xiàn)LSs分泌MIF通過COX2-PGE2通路促進TMJOA進展的具體機制仍需進一步探討。