帕拉沙提·斯然 王濤 陳珂 周嘉懿 徐健蓉 李寧寧

1西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院（四川綿陽(yáng) 621010）；2中山大學(xué)附屬第七醫(yī)院托馬斯·林達(dá)爾諾獎(jiǎng)科學(xué)家實(shí)驗(yàn)室（廣東深圳 518107）

膠質(zhì)瘤作為原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，發(fā)病率高［1-3］。現(xiàn)行診斷標(biāo)準(zhǔn)主要依據(jù)IDH分型，治療以手術(shù)為主，輔以放化療，但匱乏靶向藥物［4］。在顱外腫瘤中，取得顯著療效的藥物受限于對(duì)膠質(zhì)瘤患者響應(yīng)亞群難以精準(zhǔn)識(shí)別的問(wèn)題［5-6］。因此，亟需新型精準(zhǔn)診斷判別體系，以輔助錨定高度響應(yīng)的患者。

在膠質(zhì)瘤惡性演進(jìn)過(guò)程中，壓力刺激可能會(huì)誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激應(yīng)答（ERS），重塑細(xì)胞表型，并促進(jìn)浸潤(rùn)性生長(zhǎng)［7］。但當(dāng)ERS超過(guò)負(fù)荷時(shí)，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［8］。這提示，靶向ERS可能成為膠質(zhì)瘤精準(zhǔn)診療的一種新思路。因此，本研究的目標(biāo)是建立基于ERS分級(jí)預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型，以精準(zhǔn)判別預(yù)后和惡性進(jìn)展表型，為膠質(zhì)瘤靶向藥物的研發(fā)提供新方向。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)集和數(shù)據(jù)收集從癌癥基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)庫(kù)（xena.ucsc.edu）和中國(guó)腦膠質(zhì)瘤基因組圖譜（CGGA）數(shù)據(jù)庫(kù)（www.cgga.org.cn/index.jsp）中，篩選和選取具有完整臨床信息的測(cè)序數(shù)據(jù)（TCGA，n=683；CGGA，n=517）。將TCGA數(shù)據(jù)（IDHmt：IDHwt=508：175）和CGGA數(shù)據(jù)（CGGA325：IDHmt：IDHwt=101：175；CGGA693：IDHmt：IDHwt=176：65）分別作為訓(xùn)練集和驗(yàn)證集。通過(guò)使用Limma數(shù)據(jù)包，進(jìn)行差異基因分析（|logFC|＞1.5，P＜0.005），并在與HALLMARK_UNFOLDED_PROTEIN_RESPONSE基因集交集中篩選顯著差異基因。接下來(lái)，運(yùn)用單基因生存期分析、蛋白互作、Lasso-Cox風(fēng)險(xiǎn)回歸分析和Spearman相關(guān)性分析，構(gòu)建一個(gè)包含7個(gè)ERS相關(guān)基因的膠質(zhì)瘤風(fēng)險(xiǎn)回歸模型。最后，通過(guò)Kaplan-Meier分析和ROC曲線，明確該模型對(duì)于高、低風(fēng)險(xiǎn)與患者生存期差異的相關(guān)性與預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性。

在表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行Log2和Z-score標(biāo)準(zhǔn)化后，明確7個(gè)ERS風(fēng)險(xiǎn)因子表達(dá)與經(jīng)典膠質(zhì)瘤病理分級(jí)、分子分型之間的相關(guān)性，并使用Pheatmap包和ggplot2包分別創(chuàng)建相關(guān)熱圖和箱圖展示這些相關(guān)性。

使用診斷性ROC分析，明確CD44（惡性進(jìn)展）或GPR158（有利預(yù)后）與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的相關(guān)性。在整合訓(xùn)練集和驗(yàn)證集的數(shù)據(jù)，采用ggplot2繪制點(diǎn)圖和熱圖分別展示CD44/GPR158與ERS風(fēng)險(xiǎn)因子表達(dá)的相關(guān)性。

1.2 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)?zāi)z質(zhì)瘤臨床樣本20例（IDHwt：IDHmt=10：10）取自中山大學(xué)附屬第七醫(yī)院和中山大學(xué)腫瘤防治中心，標(biāo)本通過(guò)病理學(xué)評(píng)估，并附有詳細(xì)的臨床病理資料。所有患者均簽署知情同意書，本課題由中山大學(xué)附屬第七醫(yī)院倫理研究委員會(huì)批準(zhǔn)（編號(hào)：KY-2021-065-01）。

膠質(zhì)瘤臨床標(biāo)本（IDHwt：IDHmt=5：5），進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量分析。檢測(cè)基因的引物序列見(jiàn)表1。同時(shí)，另外10例患者（IDHwt：IDHmt=5：5）標(biāo)本被制作成石蠟切片，并通過(guò)免疫組化方法檢測(cè)HSP90B1（Cell Signaling Technology，4874）、HSP5A（Cell Signaling Technology，3177）和CD44（Cell Signaling Technology，37295）的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)采用DAB染色，陽(yáng)性結(jié)果顯色為黃褐色。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法在本研究中，R語(yǔ)言和Graph Pad Prism 9.4.1作為統(tǒng)計(jì)分析工具。按中位風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分分類后，使用χ2檢驗(yàn)確定樣本間的臨床特征差異。t檢驗(yàn)被用于進(jìn)行組間比較。此外，Pearson相關(guān)分析用來(lái)評(píng)估相關(guān)性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 利用顯著高表達(dá)的7個(gè)ERS相關(guān)基因構(gòu)建膠質(zhì)瘤分級(jí)預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型首先，根據(jù)IDH基因型并利用TCGA轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行差異表達(dá)分析（|LogFC|＞1.5，P＜0.05），并與Hallmark_Unfolded_Protein_Response（UPR）基因集進(jìn)行交集分析，篩選出在IDHmt型膠質(zhì)瘤中顯著表達(dá)的41個(gè)UPR/ERS基因以及在IDHwt型膠質(zhì)瘤樣本中顯著高表達(dá)的50個(gè)UPR/ERS基因（圖1A）。接著，通過(guò)單變量Cox風(fēng)險(xiǎn)回歸分析，發(fā)現(xiàn)有33個(gè)UPR/ERS基因與膠質(zhì)瘤不良預(yù)后之間存在顯著相關(guān)性（圖1B）。最后，通過(guò)Lasso + Cox生存分析方法（圖1C和D）篩選出7個(gè)關(guān)鍵基因，用以構(gòu)建ERS分級(jí)預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型。風(fēng)險(xiǎn)系數(shù)計(jì)算公式為：風(fēng)險(xiǎn)系數(shù)=（0.128 4 *KDELR3）+（0.529 5 * SHC1）+（0.004 3 * DNAJC3）+（0.890 3 * PDIA6）+（-0.119 9 * CALR）+（0.496 4 *HSP90B1）+（-0.752 1 * HSPA5）（圖1C-D）。

圖1 構(gòu)建基于7個(gè)UPR基因的Cox風(fēng)險(xiǎn)模型以預(yù)測(cè)膠質(zhì)瘤的預(yù)后Fig.1 Characterization of 7 ERS risk signature genes to predict the prognosis of glioma

2.2 ERS模型風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的關(guān)聯(lián)分析及預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性評(píng)估Kaplan-Meier分析顯示，高風(fēng)險(xiǎn)組（高于中位風(fēng)險(xiǎn)分?jǐn)?shù)）的患者預(yù)后明顯不如低風(fēng)險(xiǎn)組患者（圖2A-B）。時(shí)間依賴性ROC曲線評(píng)估顯示，在1年時(shí)，預(yù)后的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性超過(guò)0.7（TCGA：0.74；CGGA：0.82），在3年時(shí)超過(guò)0.76（TCGA：0.77；CGGA：0.80），在5年時(shí)超過(guò)0.62（TCGA：0.63；CGGA：0.75）（圖2C-D）。這些結(jié)果表明，與ERS相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)因子在預(yù)測(cè)神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后方面表現(xiàn)出較高的準(zhǔn)確性。

圖2 評(píng)估ERS相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)因子預(yù)測(cè)預(yù)后的能力Fig.2 Assessment of the prognostic prediction ability of the ERS-related risk signature

2.3 ERS相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)因子與膠質(zhì)瘤經(jīng)典分子分型和病理級(jí)別的關(guān)聯(lián)性分析ERS相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)因子是否與神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的臨床病理分級(jí)存在關(guān)聯(lián)？針對(duì)訓(xùn)練集（TCGA）和驗(yàn)證集（CGGA）的數(shù)據(jù)分析顯示，以IDH基因型分組，這7個(gè)ERS風(fēng)險(xiǎn)基因在IDHwt組中呈現(xiàn)顯著高表達(dá)（圖3A-B）。進(jìn)一步，在根據(jù)WHO病理分級(jí)進(jìn)行的分組中，與Grade 2相比，這7個(gè)ERS相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)因子在Grade 3膠質(zhì)瘤中均呈現(xiàn)顯著高表達(dá)（圖3C-D）。通過(guò)上述分析結(jié)果的驗(yàn)證，ERS相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)因子能夠有效區(qū)分不同膠質(zhì)瘤患者的經(jīng)典分子分型和病理分級(jí)特征。

圖3 ERS相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)因子在膠質(zhì)瘤患者中根據(jù)WHO分級(jí)劃分的診斷價(jià)值Fig.3 Diagnostic values of ERS risk signature genes in glioma patients based on WHO grade classification.

2.4 ERS相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)因子與膠質(zhì)瘤惡性進(jìn)展表型的關(guān)聯(lián)性分析在膠質(zhì)瘤惡性進(jìn)展過(guò)程中，CD44在促進(jìn)細(xì)胞間質(zhì)亞型轉(zhuǎn)化方面發(fā)揮著重要作用，并與膠質(zhì)瘤的病理分級(jí)和預(yù)后密切相關(guān)［9-12］。Pearson相關(guān)性分析顯示，CD44與ERS風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分顯著正相關(guān)（圖4A）。此外，箱圖顯示，在ERS高風(fēng)險(xiǎn)組中CD44表達(dá)顯著升高（圖4B）。進(jìn)一步分析顯示，在將患者根據(jù)CD44表達(dá)的中位數(shù)分為高表達(dá)組和低表達(dá)組后，ERS相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)因子在CD44低表達(dá)的患者中也呈現(xiàn)低表達(dá)（圖4C和D）。

圖4 ERS相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)因子與膠質(zhì)瘤惡性進(jìn)展表型的關(guān)系Fig.4 The correlation between ERS-related risk signatures and malignant phenotypes of glioma.

G蛋白偶聯(lián)受體GPR158的表達(dá)隨膠質(zhì)瘤級(jí)別升高而逐級(jí)顯著降低，可作為分級(jí)預(yù)后標(biāo)志物；此外，GPR158的高表達(dá)能夠有效抑制膠質(zhì)瘤的惡性進(jìn)展［13-14］。為進(jìn)一步驗(yàn)證ERS風(fēng)險(xiǎn)模型對(duì)膠質(zhì)瘤級(jí)別和惡性進(jìn)展表型評(píng)估的獨(dú)立性，研究根據(jù)GPR158的表達(dá)中位數(shù)將TCGA和CGGA數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，然后比較這兩組中ERS風(fēng)險(xiǎn)因子的表達(dá)趨勢(shì)。熱圖分析顯示，在GPR158低表達(dá)組中，ERS高風(fēng)險(xiǎn)因子的表達(dá)水平顯著增加（圖4E-F）。此外，Pearson相關(guān)性分析結(jié)果提示GPR158與ERS風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分之間呈顯著負(fù)相關(guān)（圖4G）。最后，診斷性ROC曲線顯示，ERS風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分預(yù)測(cè)膠質(zhì)瘤惡性進(jìn)展表型的準(zhǔn)確性超過(guò)0.7（圖4H）。綜上所述，這些研究結(jié)果強(qiáng)調(diào)了ERS風(fēng)險(xiǎn)因子在準(zhǔn)確預(yù)測(cè)膠質(zhì)瘤惡性進(jìn)展表型方面的重要能力。

2.5 ERS風(fēng)險(xiǎn)因子在不同IDH基因型臨床膠質(zhì)瘤樣本中的表達(dá)差異分析經(jīng)臨床樣本的qRT-PCR分析顯示，在IDHwt膠質(zhì)瘤樣本中，7個(gè)ERS相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)因子的表達(dá)顯著高于IDHmt樣本（IDHwt∶IDHmt=10 ∶ 10），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖5A）。鑒于DNAJC3、CALR、PDIA6、SHC1和KDELR3缺乏適用于免疫組化級(jí)別的抗體，因此選取ERS風(fēng)險(xiǎn)因子（HSP90B1和HSPA5）與惡性表型標(biāo)志物（CD44）一同作為免疫組化實(shí)驗(yàn)的指標(biāo)（圖5B）。免疫組化結(jié)果表明，在IDHwt膠質(zhì)瘤樣本中，風(fēng)險(xiǎn)因子HSP90B1和HSPA5以及CD44的表達(dá)明顯高于IDHmt膠質(zhì)瘤樣本（IDHwt∶IDHmt=5∶5），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖 5C）。

圖5 ERS相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)因子因子在不同IDH基因型臨床膠質(zhì)瘤樣本中的表達(dá)比較Fig.5 Comparison of the expression of UPR risk signature factors in clinical glioma samples with different IDH genotypes

3 討論

本研究基于美中兩國(guó)公共膠質(zhì)瘤數(shù)據(jù)庫(kù)（TCGA和CGGA）的RNA-seq數(shù)據(jù)，成功篩選出7個(gè)ERS相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)基因，并建立了一個(gè)具備病理分級(jí)和預(yù)后預(yù)測(cè)功能的風(fēng)險(xiǎn)回歸模型。該模型在預(yù)測(cè)膠質(zhì)瘤患者的短期生存期（1年和3年）方面表現(xiàn)出較高的準(zhǔn)確性（AUC＞0.74）。此外，通過(guò)生物信息學(xué)分析和臨床樣本驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)ERS高風(fēng)險(xiǎn)組與膠質(zhì)瘤惡性進(jìn)程標(biāo)志物CD44呈顯著正相關(guān)，而與代表有利預(yù)后的前神經(jīng)元標(biāo)志物GPR158之間呈顯著負(fù)相關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)提示，該模型能夠較為準(zhǔn)確地指征膠質(zhì)瘤的惡性進(jìn)展表型。

目前，現(xiàn)行的臨床診斷體系分類器在與膠質(zhì)瘤靶向藥物相匹配方面存在挑戰(zhàn)，例如，盡管IDH突變抑制劑在急性髓細(xì)胞性白血病的靶向治療中取得顯著療效［15］，但在膠質(zhì)瘤治療方面仍處于臨床試驗(yàn)階段［16-18］。這可能是由于IDHmt以及代謝產(chǎn)物D2HG對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的表觀遺傳調(diào)控以及代謝重編程產(chǎn)生重要影響，使得精確的靶向治療變得困難［19］。同樣，針對(duì)膠質(zhì)瘤的治療嘗試了多種與現(xiàn)行臨床診斷分類系統(tǒng)相對(duì)獨(dú)立的靶向策略［20-23］和免疫療法［24-25］。然而，由于缺乏適應(yīng)于臨床診斷分類的準(zhǔn)確分類器，上述努力均難以確定高度響應(yīng)的患者亞群。這也成為當(dāng)前膠質(zhì)瘤靶向治療和未來(lái)特異性靶向藥物開(kāi)發(fā)所面臨的重要限制因素。

在新版的《Hallmarks of Cancer：New Dimensions》一文中，表型可塑性被提升為腫瘤標(biāo)志性事件之一，強(qiáng)調(diào)了深入探索和驗(yàn)證其機(jī)制的重要性［26］，也提示未來(lái)在研究腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)以及耐藥時(shí)，需要從基因型和細(xì)胞表型的綜合角度進(jìn)行考慮。當(dāng)腫瘤細(xì)胞受到內(nèi)部或微環(huán)境壓力刺激時(shí)，會(huì)觸發(fā)ERS，從而改變轉(zhuǎn)錄、翻譯和表觀修飾水平，重新塑造腫瘤細(xì)胞表型，以適應(yīng)潛在的致死性壓力，增強(qiáng)其浸潤(rùn)性生長(zhǎng)能力［7］。因此，推測(cè)ERS或是調(diào)控腫瘤表型可塑性的重要源頭途徑。有學(xué)者［27-28］證實(shí)ERS可以驅(qū)動(dòng)結(jié)直腸癌細(xì)胞表型可塑性；同時(shí)，WANG等［29］發(fā)現(xiàn)IDH突變介導(dǎo)的ERS調(diào)控膠質(zhì)瘤微環(huán)境中腫瘤相關(guān)小膠質(zhì)細(xì)胞極性可塑性。這些研究提示，ERS信號(hào)通路元件可能是調(diào)控膠質(zhì)瘤實(shí)質(zhì)及其微環(huán)境表型可塑性的關(guān)鍵組分。因此，在本研究中，構(gòu)建了一個(gè)ERS風(fēng)險(xiǎn)回歸模型，并通過(guò)生物信息學(xué)分析和臨床樣本驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)該模型高風(fēng)險(xiǎn)組與惡性進(jìn)展表型標(biāo)志物如CD44呈顯著正相關(guān)，與良好預(yù)后標(biāo)志物GPR158呈顯著負(fù)相關(guān)。這些結(jié)果提示，ERS風(fēng)險(xiǎn)特征能準(zhǔn)確預(yù)測(cè)膠質(zhì)瘤惡性進(jìn)展表型，為未來(lái)臨床靶向治療提供新的方向。

ERS是腫瘤細(xì)胞應(yīng)對(duì)外界和內(nèi)在壓力的重要調(diào)控通路，對(duì)腫瘤生長(zhǎng)、存活、分化和蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)提供關(guān)鍵保障［16-18］。然而，它是一個(gè)雙刃劍，壓力過(guò)度亦會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡。多項(xiàng)研究表明，IDHmt提高膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)于ERS的敏感性，激活PERK/ATF4信號(hào)軸，從而抑制腫瘤的增殖和侵襲能力，促進(jìn)凋亡［8，30-31］。例如，JOHNSON等［32］發(fā)現(xiàn)ERS誘導(dǎo)劑毒胡蘿卜素（Thapsigargin）可以促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡。Hallahan團(tuán)隊(duì)也報(bào)道ERS增強(qiáng)GBM對(duì)于放療敏感性［33］。近期，WANG等［29］發(fā)現(xiàn)激活膠質(zhì)瘤細(xì)胞PERK通路推動(dòng)腫瘤相關(guān)小膠質(zhì)瘤細(xì)胞抗癌極化激活?；谶@種機(jī)制，針對(duì)ERS進(jìn)行靶向治療可能成為一種新的方法，通過(guò)殺傷膠質(zhì)瘤細(xì)胞來(lái)抑制腫瘤的惡性進(jìn)程，為開(kāi)發(fā)全新的藥物靶向策略提供了潛在的方向。

綜上所述，本研究建立了一套新型的腦膠質(zhì)瘤（除GBM外）分級(jí)預(yù)后體系，不僅能夠準(zhǔn)確識(shí)別膠質(zhì)瘤惡性進(jìn)展表型，還能有效地橋接現(xiàn)行腦膠質(zhì)瘤臨床分子診斷體系與靶向治療所涉及的內(nèi)在分子機(jī)制。前期報(bào)道指出IDHwt和IDHmt這兩類膠質(zhì)瘤本質(zhì)上屬于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激耐受和敏感型腫瘤，基于這一發(fā)現(xiàn)，本研究中合理猜測(cè)：未來(lái)設(shè)計(jì)和開(kāi)發(fā)與ERS相關(guān)的靶向藥物可能會(huì)從這個(gè)新型風(fēng)險(xiǎn)模型中受益，從而彌補(bǔ)IDH分子分型無(wú)法精準(zhǔn)鎖定響應(yīng)患者亞群的不足。此外，還認(rèn)為：圍繞分子靶點(diǎn)或信號(hào)通路開(kāi)展的靶向藥物設(shè)計(jì)或可借鑒本研究的模型方法，即構(gòu)建臨床診斷體系與待開(kāi)發(fā)靶向機(jī)制的融合模型，從而更為有效地提高靶向藥物的適配度。