何幼芹 高鴻 種朋貴 劉艷秋 佟睿 吳學(xué)艷

1貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院麻醉科（貴陽 550003）；2中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院貴州醫(yī)院（貴陽 550025）；3貴州醫(yī)科大學(xué)麻醉學(xué)院（貴陽 550004）

再灌注心律失常（RA）是心肌缺血-再灌注損傷的特征性表現(xiàn)之一［1］，房性心律失常為RA中的常見類型，以房顫較為常見［2］。復(fù)極時程在心律失常的發(fā)生與維持中發(fā)揮著重要作用，表現(xiàn)為復(fù)極時程延長，心律失常發(fā)生風(fēng)險顯著增加［3］。本課題組前期研究［4］揭示，低溫全心缺血-再灌注后房性心律失常心房肌復(fù)極時程顯著延長。內(nèi)向整流鉀電流（Ik1）內(nèi)向整流特性對維持心肌細胞的長平臺期和3期復(fù)極具有重要作用；當(dāng)Ik1的活動降低，動作電位復(fù)極延長。構(gòu)成Ik1的主要成分為內(nèi)向整流鉀通道2.1（Kir2.1）［5］，其表達下調(diào)可致動作電位復(fù)極時程延長，增加房性心律失常的發(fā)生風(fēng)險［6］。亦有研究揭示，Ca2+/CaM依賴激酶Ⅱ（CaMKⅡ）表達增加可引起蘭尼堿受體2（ryanodine receptor 2，RyR2）磷酸化加重，進一步導(dǎo)致心肌跨室壁復(fù)極離散度（TDR）增加，從而增加心律失常發(fā)生的風(fēng)險［7-9］。然而，低溫全心缺血-再灌注房性心律失常心房肌復(fù)極時程延長是否與Kir2.1和CaMKⅡ的表達改變有關(guān)，目前尚無研究報道。故本實驗擬用Langendorff離體大鼠心臟灌注模型研究再灌注后房性心律失常心房肌中Kir2.1和CaMKⅡ的表達，以探討其復(fù)極時程延長的可能分子機制。

1 材料與方法

1.1 Langendorff離體大鼠心臟灌注模型的制備將體質(zhì)量為320～380 g的健康成年雄性SD大鼠（貴州醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供）成功制備為Langendorff離體大鼠心臟灌注模型，具體操作步驟詳見以往的研究［10］。本研究已獲得貴州醫(yī)科大學(xué)動物倫理委員會審批。

1.2 模型分組與處理按照隨機數(shù)字表法將成功制備的langendorff離體大鼠心臟灌注模型16例隨機分為對照組（C組）和缺血-再灌注組（IR組），每組8例。根據(jù)是否發(fā)生再灌注房性心律失常，將IR組進一步細分為再灌注非房性心律失常亞組（R-NAA）和再灌注房性心律失常亞組（R-AA）。C組使用37 ℃ K-H液平衡灌注120 min。IR組使用37 ℃ K-H液平衡灌注30 min后停止，注射4 ℃Thomas液（20 mL/kg）使心臟停跳60 min，停跳30 min時使用半量4 ℃ Thomas液（10 mL/kg）對離體心臟進行復(fù)灌，停跳期間用低溫Thomas液（4 ℃）對心臟保護，后再次灌注37 ℃ K-H液30 min。

1.3 MAPD50和MAPD90的測量于右心房游離前臂放置自制的復(fù)合電極，用BL-420生物機能實驗系統(tǒng)（成都泰盟軟件有限公司）于平衡灌注30 min（T0）、平衡灌注105 min/再灌注15 min（T1）和平衡灌注120 min/再灌注30 min（T2）時記錄右心房心外膜單相動作電位（MAP），測量單相動作電位復(fù)極50%和90%的時程（MAPD50和MAPD90），記錄平衡灌注90 min/再灌注即刻后離體心臟房性心律失常發(fā)生情況。

1.4 Western blot檢測 Kir2.1和CaMKⅡ的表達分別取上述3組試驗后的適量心房肌組織，于其中加入一定比例的蛋白裂解液及蛋白酶抑制劑混合液，冰上勻漿并12 000 r/min離心15 min；BCA法進行樣品蛋白定量；將總蛋白/樣品加載到十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠進行電泳。聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)膜并封閉2 h，分別使用Ⅰ抗［（Kir2.1 抗體，1∶2 000稀釋）、（CaMKⅡ抗體，1∶1 000稀釋）］4℃孵育過夜。次日，TBST洗膜后分別使用辣根過氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗［（Kir2.1抗體，1∶8 000稀釋）、（CaMKⅡ抗體，1∶2 000稀釋）］室溫孵育2 h，TBST洗膜后加入ECL超敏試劑采用全自動凝膠成像分析系統(tǒng)（ZF-158）進行分析。使用Image J軟件測量各組帶強度，GAPDH蛋白印跡帶作為內(nèi)參進行量化，計算Kir2.1和CaMKⅡ蛋白相對含量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 27.0軟件進行分析，正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)比較采用重復(fù)測量資料的方差分析，計數(shù)資料比較采用Fisher確切概率法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 心律失常發(fā)生情況C組在整個灌注過程中均無房性心律失常發(fā)生。再灌注后IR組有2只發(fā)生房性早搏，有1只發(fā)生房顫，其房性心律失常發(fā)生率為37.5%，房顫發(fā)生率約為12.5%。

2.2 低溫缺血-再灌注對離體大鼠心房肌MAPD50和MAPD90的影響與T0時點比較，R-NAA組和R-AA組T1時MAPD50明顯延長，R-AA組T2時MAPD50明顯延長（P＜0.05）；與T0時點比較，R-NAA組和R-AA組T1、T2時MAPD90明顯延長（P＜0.05）；與C組比較，R-NAA組和R-AA組T1時MAPD50明顯延長，R-AA組T2時MAPD50明顯延長（P＜0.05）；與R-NAA組比較，R-AA組T1、T2時MAPD50明顯延長（P＜0.05）。與C組比較，R-NAA組和R-AA組T1、T2時MAPD90明顯延長（P＜0.05）；與R-NAA組比較，R-AA組T1、T2時MAPD90明顯延長（P＜0.05）。見表1。

表1 3組大鼠右心房不同時點MAPD50和MAPD90的比較Tab.1 Comparison of MAPD50 and MAPD90 at different time points in right atrium of rats in three groups ±s，ms

注：與C組比較，*P＜0.05；與R-NAA組比較，△P＜0.05；與T0比較，▲P＜0.05

項目T0 T1 T2 MAPD50 MAPD90組別C組R-NAA組R-AA組C組R-NAA組R-AA組n8 5 38 5 3 20.10 ± 2.23 21.69 ± 2.71 28.22 ± 3.37*△▲43.14 ± 3.74 47.58 ± 4.56*▲52.15 ± 4.99*△▲19.15 ± 2.03 19.21 ± 2.17 19.09 ± 2.51 42.26 ± 1.62 43.34 ± 2.46 43.48 ± 3.81 19.42 ± 1.99 23.95 ± 2.10*▲29.05 ± 3.81*△▲43.82 ± 2.85 48.76 ± 2.66*▲54.22 ± 3.85*△▲

2.3 低溫缺血-再灌注對離體大鼠心房肌Kir2.1和CaMKⅡ蛋白表達的影響Western blot 檢測結(jié)果顯示，R-NAA組和R-AA組Kir2.1表達明顯少于C組（P＜0.05），且R-AA組明顯少于R-NAA組（P＜0.05）；R-NAA組和R-AA組 CaMKⅡ表達較C組明顯增加（P＜0.05），且R-AA組 CaMKⅡ表達較R-NAA組明顯增加（P＜0.05）。見表2。

表2 3組大鼠心房肌Kir2.1和CaMKⅡ表達的比較Tab.2 Comparison of the expression of Kir2.1 and CaMKⅡ in atrial myocardium of rats in three groups ±s

注：與C組比較，*P＜0.05；與R-NAA組比較，△P＜0.05

組別C組R-NAA組R-AA組CaMKⅡ0.49 ± 0.15 1.14 ± 0.25*1.65 ± 0.30*△n8 5 3 Kir2.1 1.99 ± 0.44 1.30 ± 0.39*0.46 ± 0.23*△

3 討論

房性心律失常發(fā)生的病理改變主要包括心房電重構(gòu)和結(jié)構(gòu)重構(gòu)，而房性心律失常發(fā)生的早期主要表現(xiàn)為心房電重構(gòu)，包括電生理與離子通道的改變。再灌注房性心律失常是心房肌缺血-再灌注損傷的特征性表現(xiàn)之一。既往的研究［11］證實，復(fù)極時程延長、傳導(dǎo)速度減慢、L型Ca2+電流過度激活、心房早期后除極［12］、氧化應(yīng)激［13-14］等是已知引起房性心律失常的常見原因。盡管房性心律失常發(fā)生的分子機制已經(jīng)得到了廣泛研究，但在低溫全心缺血-再灌注時有關(guān)再灌注房性心律失常發(fā)生的信息卻十分有限。本課題組前期研究揭示，全心低溫缺血-再灌注后心房肌復(fù)極時程延長［4］，但其分子機制目前尚不清楚。

本次研究根據(jù)是否發(fā)生再灌注房性心律失常將IR組進一步細分為R-NAA組和R-AA組，更能準(zhǔn)確揭示再灌注房性心律失常心房肌復(fù)極時程延長的可能分子機制。MAPD主要反映心肌細胞動作電位0～3相復(fù)極；其中，MAPD50和MAPD90分別與心肌細胞動作電位復(fù)極2期和3期有關(guān)［15］。Ik1是心房肌細胞動作電位復(fù)極的關(guān)鍵電流；當(dāng)其活動降低，心肌動作電位復(fù)極時程延長；作為Ik1的主要構(gòu)成成分，Kir2.1蛋白由基因KCNJ2編碼，其表達下調(diào)可使心肌動作電位復(fù)極時程延長，增加房性心律失常的發(fā)生風(fēng)險［6，16-17］。LAMMERS等［18］的研究揭示，Kir2.1蛋白的表達與復(fù)極時程呈反向改變，即Kir2.1蛋白表達下調(diào)則復(fù)極時程延長。RyR2廣泛存在于肌漿網(wǎng)上，介導(dǎo)心肌興奮-收縮偶聯(lián)，當(dāng)其功能紊亂時，可引起Ca2+滲漏，使舒張期心肌細胞出現(xiàn)鈣超載，從而引發(fā)心律失常。作為RyR2的調(diào)控因子之一，CaMKⅡ?qū)τ诰S持RyR2一定的磷酸化發(fā)揮重要調(diào)控作用。當(dāng)缺血等病理狀態(tài)下CaMKⅡ表達增加，可使得RyR2的磷酸化加重，導(dǎo)致復(fù)極時程延長，進一步使心肌TDR增加，從而增加心律失常發(fā)生的風(fēng)險［7-9］。另有研究揭示，CaMKⅡ蛋白表達與復(fù)極時程呈正向改變；即CaMKⅡ蛋白表達增加，則心肌組織復(fù)極時程延長［7-8］。因此推斷，Kir2.1和CaMKⅡ蛋白表達改變與心肌復(fù)極時程密切相關(guān)。因此，檢測Kir2.1和CaMKⅡ蛋白表達對揭露低溫全心缺血-再灌注心房肌復(fù)極時程延長具有重要意義。故本研究觀察了低溫缺血-再灌注房性心律失常心房Kir2.1和CaMKⅡ蛋白表達的變化，從分子水平探討再灌注房性心律失常心房肌復(fù)極時程延長的可能分子機制。Kir2.1和CaMKⅡ基因的表達受多因素調(diào)控。例如：激素、體液、某些信號分子以及一些小分子RNA 可上調(diào)或下調(diào) Kir2.1和CaMKⅡ基因的表達，從而影響Kir2.1和CaMKⅡ的功能。本研究采用Langendorff大鼠心臟灌注模型，可以排除激素、體液等干擾因素。本次研究結(jié)果提示，R-AA組心房肌MAPD50和MAPD90較C組和R-NAA組明顯延長，與課題組前期研究結(jié)果一致。與此同時，Western blot結(jié)果顯示，R-AA組心房肌Kir2.1蛋白表達較其他兩組明顯下調(diào)，與XIA等［19］的研究結(jié)果相似。本次研究結(jié)果揭示，R-AA組心房肌CaMKⅡ蛋白表達較C組和R-NAA組明顯增加，與國外研究［7-8］結(jié)果一致。因此，我們有理由推斷，Kir2.1表達下調(diào)和CaMKⅡ表達增加可能與再灌注房性心律失常心房肌復(fù)極時程延長有關(guān)。

綜上所述，Kir2.1蛋白表達下調(diào)和CaMKⅡ蛋白表達增加可能與低溫全心缺血-再灌注后房性心律失常心房肌復(fù)極時程延長有關(guān)。