■ 文｜廣東省農(nóng)業(yè)技術推廣中心 姚東林 朱靜璇 羅文范 何元文

清遠市農(nóng)業(yè)科技推廣服務中心 王超

華南農(nóng)業(yè)大學海洋學院 謝少林

鯉（Cyprinus carpiolinnaeus）是中國最常見的鯉屬魚類，伍獻文先生將中國的鯉分為四個亞種，其中華南鯉是鯉在華南地區(qū)亞種，分布于珠江水系及其南部包括海南島在內(nèi)的華南地區(qū)，華南鯉是華南地區(qū)分布最為廣泛的鯉屬魚類，遍布于華南地區(qū)各水系。三角鯉（Cyprinus multitaeniatapellegrin et chevey）分類上為鯉屬、中鯉亞屬（Mesocyprinus Fang），又名黃板鯽、黃鯽和江鯽，其分布范圍很小，主要分布于我國廣西珠江水系支流的西江流域，據(jù)資料記載在越南的紅河也有少量分布。尖鰭鯉（Cyprinus acutidorsalisWang）分類上為鯉屬、鯉亞屬（Cyprinus linnaeus,s.Str.），又名海鯉、海鯽，是我國特有的生活于咸淡水中的鯉科魚類，目前僅在我國的廣西欽江出?？谟邪l(fā)現(xiàn)分布。須鯽（Carassioidescantonensis Heincke）屬于鯉亞科須鯽屬（Carassioides Oshima），又名黃鯽、江鯽，據(jù)報道僅在在我國珠江流域和海南島等少數(shù)地方有分布，且數(shù)量較少。目前已知須鯽分布范圍小，且相關報道很少。2013年有研究報道我國云南地區(qū)也有須鯽的發(fā)現(xiàn)。除此之外于《中國鯉科魚類志》和《海南島淡水及河口魚類志》等文獻中也有報道。

細胞線粒體的COⅠ基因序列（細胞色素c氧化酶I）作為分子標記具有諸多優(yōu)勢：有相對保守而又有足夠的變異、序列長度合適、可用通用引物擴增和測序等，COⅠ分子標記作為DNA條形碼可以快速鑒定物種，近年來被廣泛地應用于物種鑒定。

因此，本研究選取了華南地區(qū)5個水系作為采樣點，采集了華南鯉、尖鰭鯉、三角鯉和須鯽共6個地理種群，其中包括：華南鯉的海南萬泉河種群、珠江水系主干河流網(wǎng)的高明河（肇慶）種群和廣東東部榕江種群；廣西欽江水系的尖鰭鯉種群；廣西珠江水系西江的三角鯉種群；海南萬泉河水系的須鯽種群。

一、材料與方法

1.儀器

超凈工作臺；立式電熱壓力蒸汽滅菌器；超純水系統(tǒng)；PCR儀；RDY-SPIZ瓊脂糖水平電泳儀；小型高速冷凍離心機；漩渦震蕩器；臺式恒溫振蕩箱，電熱恒溫水浴鍋；ALPHA IMAGER 2200凝膠成像分析系統(tǒng)；JY600+型雙恒電泳儀；-80℃超低溫冰箱；-20℃冰箱；電子分析天平；微量移液器等。

2.實驗試劑與試劑盒

無水乙醇，75%乙醇，去離子水，雙蒸水，瓊脂糖、TIANGEN蛋白酶K（20mg/mL）、瓊脂糖、Tris平衡酚、苯酚、氯仿、異戊醇、核酸染色劑EB（溴化乙錠）、6×Loading buffer上樣品緩沖液、DL2000DNAmarker、TIANGENDNA 提取試劑盒、TIANGEN普通瓊脂凝膠DNA回收試劑盒、2×TAQPCRMAasterMIX等。

3.自配實驗試劑

50×TAE電泳緩沖液；1×TAE電泳緩沖液；苯酚：氯仿：異戊醇（25∶24∶1）；組織細胞裂解液；E緩沖液（pH8.0）等。

4.樣品采集與處理

樣品采集地點和種類如表1所示。將采集的魚取一小塊鰭條或者肌肉組織，放置于裝有無水乙醇的5mL離心管中保存待測。

表1 樣品采集地點和種類

5.DNA提取和檢測

提?。罕狙芯緿NA提取分為兩種，分別為自配試劑提取和試劑盒提取，試劑盒提取按照TIANGEN試劑盒說明書操作。

檢測：取5μL已提取的DNA樣品液并加入1μL的 6×Loading buffer上樣品緩沖液混勻，用移液槍逐個加入凝膠點樣孔中，同時保留一孔點上DL2000的DNAmarker，設置電壓120V進行恒定電壓電泳，定時30min，取出凝膠放入凝膠成像系統(tǒng)，打開電腦軟件進行觀察，拍照并記錄DNA提取情況。

6.引物設計和PCR擴增

本研究根據(jù)已經(jīng)報道的鯉科目魚類相關序列， 線粒體C OⅠ序列引物采用引物：FishF1：5'-TCAACCAACCACAA AGACATTGGCAC-3'，F(xiàn)ishR1：5'-TAGACTTCTGGGTGGCCAA AGAATCA-3'。

線粒體COⅠ序列引物FishF1/FishR1PCR擴增程序：94.0℃預變性4min；94.0℃變性30s，60℃退火30s，72.0℃延伸1min，35個循環(huán)；最后72.0℃延伸5min，4℃保存。

7.DNA序列測定

將PCR所得產(chǎn)物PCR直接進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，將檢測所得DNA條帶的產(chǎn)物送往上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司廣州測序部進行DNA序列測序。

8.數(shù)據(jù)處理

采用Chromas軟件查看序列的測序效果，并以此為依據(jù)判斷測序是否準確。使用MEGA6.06軟件的ClustalW功能進行序列比對，并進行人工矯正，去除受干擾序列片段后計算堿基組成比例、平均堿基數(shù)、簡約信息位點等數(shù)值。使用DNASP軟件進行中性假說檢驗（Fu's Fs-test和Tajima's D算法）和核苷酸分析，并計算平均核苷酸差異值和核苷酸多樣性。使用Allequin V3.5.1.3軟件分析單倍型多樣性和單倍型組成等。

二、結果

1.PCR擴增結果

獲得清晰的條帶，如圖1、2所示。

圖1 COⅠ序列FishF1/FishR1引物的PCR擴增結果，從左邊數(shù)起：1～3三角鯉，4～6為尖鰭鯉，7～9為須鯽，10為mark。

圖2 COⅠ標記FishF1/FishR1的PCR擴增結果，從左邊數(shù)起：1為mark，2～4為海南鯉，5～7為珠江鯉，8～10為榕江鯉。

2.COⅠ序列結構和變異

一共獲得COⅠ序列共109個，其中：海南鯉19個；珠江鯉16個；榕江鯉17個；須鯽18個；尖鰭鯉18個；三角鯉21個。利用MEGA6.0比對線粒體控制區(qū)序列，并去除兩端不準確的序列，獲得610bp的序列（珠江鯉有一個序列多出一個堿基，為611bp）。各種群COⅠ序列的A+T平均含量（54.09±0.56）高于C+G的平均含量（45.92±0.56）。在六個種群中，須鯽的A+T比例最高，為54.76%，而三角鯉最低，為53.12%，而海南鯉、珠江鯉、榕江鯉和尖鰭鯉分別為53.99%、54.34%、54.37%、53.94%，可見六個種群COⅠ序列的堿基組成差異不大。

3.基于線粒體COⅠ的遺傳多樣性分析

根據(jù)表3和表4，可以發(fā)現(xiàn)COⅠ序列總樣本間的簡約信息位點為92個，平均核苷酸差異值為31.094，核苷酸多樣性值為0.05097，單倍型多樣性為0.884。在六個群體中，珠江鯉的簡約信息位點數(shù)目（ZL）最多，為5個，而其次依次為：海南鯉、榕江鯉都為4個，而須鯽、尖鰭鯉和三角鯉沒有簡約信息位點。基于COⅠ序列，珠江鯉簡約信息位點數(shù)目，核苷酸多樣性和單倍型多樣性等指標最大，這從一定程度上說明了珠江鯉的COⅠ序列多樣性最大，其次分別是海南鯉和榕江鯉，而須鯽、尖鰭鯉和三角鯉COⅠ序列的多樣性非常小，明顯小于三個鯉群體，其中尖鰭鯉沒有COⅠ序列變異，而須鯽和三角鯉分別只有一個單點突變位點，沒有簡約信息位點。

表3 CO Ⅰ序列位點信息和多樣性分析

表4 CO Ⅰ序列單倍型在各種群間的分布

在六個群體109個COⅠ序列中共有17種單倍型，其中海南鯉、珠江鯉和榕江鯉有兩種三者共有的單倍型，為Hd1和Hd4。而海南鯉和珠江鯉除了Hd1和Hd4外沒有其他共同單倍型。珠江鯉和榕江鯉除了Hd1和Hd4外，還有Hd6為共同單倍型。此外，海南鯉有3種特有單倍型，為Hd2、Hd3、Hd5；珠江鯉有4種特有單倍型，分別為Hd7～Hd10；須鯽有兩種單倍型，都為特有單倍型，其中Hd13單倍型有17個個體，而Hd14單倍型的個體僅為1個；尖鰭鯉只有一種單倍型，為特有單倍型；三角鯉有兩種單倍型，都為特有單倍型，其中Hd16為20個個體，而Hd17僅為一個個體。

4.種群動態(tài)分析和中性檢驗

由表5 可得，而在基于COⅠ的遺傳距離中三個華南鯉種群的遺傳距離在0.0024～0.0035之間，而須鯽、尖鰭鯉和三角鯉的內(nèi)部遺傳則接近于0，說明華南鯉三個種群基于COⅠ序列的種內(nèi)差異水平大致相同，而須鯽、尖鰭鯉和三角鯉種群內(nèi)的COⅠ序列則幾乎沒有差距。

表5 各種群內(nèi)部基于線粒體CO Ⅰ的Kimura 雙參數(shù)模型遺傳距離和標準差

根據(jù)表6，基于線粒體COⅠ序列的Tajima's D和Fu's Fs statistic值中，當以所有群體為對象時，中性檢測數(shù)值為正數(shù)且有顯著性差異（P＜0.05），說明了在以所有種群線粒體COⅠ為檢驗對象時，群體間變異符合中性假說，且可以認為在種群間在較近歷史內(nèi)沒有發(fā)生較大的種群擴張。

表6 基于線粒體CO Ⅰ序列的中性檢驗

三、討論

三個華南鯉種群在COⅠ序列上存在共同單倍型，其中基于線粒體的三個種群共同單倍型只有一個，而海南鯉和珠江鯉兩者之間共同單倍型為5個，珠江鯉和榕江鯉兩者的共同單倍型為3個。此外，海南鯉和榕江鯉并沒有共同單倍型，這也說明了珠江鯉可能是海南鯉和榕江鯉的發(fā)源地，通過冰期或者地貌運動等原因分別進入到不同流域。基于總?cè)后wTajima's D和Fu's Fs statistic的中性檢測值符合中性學說，說明群體內(nèi)的簡約位點和單點突變等多數(shù)突變是中性的，且近期并沒有較大的自然選擇壓力。此外，本研究發(fā)現(xiàn)尖鰭鯉、三角鯉和須鯽三者沒有出現(xiàn)共同單倍型，由此可見，三者之間在短期內(nèi)沒有出現(xiàn)種群交流，同時說明彼此間種群分化較大。而三角鯉和須鯽與華南鯉之間也沒有共同單倍型，這也說明了三角鯉和須鯽在較近的歷史內(nèi)沒有和華南鯉有基因交流，且物種分離的歷史比較久遠。

單倍型多樣性和核苷酸多樣性是衡量種群遺傳多樣性（Genetic diversity）的重要指標，可以作為物種保護的重要參考。本研究表明，基于線粒體COⅠ標記的單倍型多樣性中，珠江鯉遺傳多樣性最高，為0.867，其次為榕江鯉和海南鯉種群，分別為0.735和0.708，而核苷酸多樣性珠江鯉（0.00351）和榕江鯉（0.00351）一致，高于海南鯉（0.00313），這說明了海南鯉雖然具備較高的單倍型多樣性，但是沒有足夠的時間積累核苷酸多樣性，單倍型之間的核苷酸差異小于珠江鯉和榕江鯉。此外，須鯽、尖鰭鯉和三角鯉種群基于COⅠ序列的核苷酸多樣性較低，核苷酸多樣性分別為0.00018、0和0.00016；而基于COⅠ序列的單倍型多樣性分別為0.111、0和0.095，其多樣性指標遠低于華南鯉的三個種群。這表明須鯽、尖鰭鯉和三角鯉的COⅠ序列上還沒積累足夠的變異。由于須鯽、尖鰭鯉和三角鯉種群的中性檢測Tajima's D和Fu's Fs statistic值都沒有出現(xiàn)具有顯著差異性的負值，因此不能證明其在短期內(nèi)經(jīng)歷過種群擴張。本研究認為須鯽、尖鰭鯉和三角鯉種群基于COⅠ序列多態(tài)性低的可能原因有兩個：一是須鯽、尖鰭鯉和三角鯉都是分布范圍很小的地方性品種，且受到時間、空間等因素影響，本研究采樣的種群多樣性也受到限制，容易出現(xiàn)近緣個體，也可能是遺傳多樣性較小的原因之一。二是地方特有種往往生存競爭力較低，容易受到外來入侵物種和外界環(huán)境的干擾而導致種群規(guī)模大量減少，當種群規(guī)?；謴秃笃浞N群容易出現(xiàn)同質(zhì)性高而多樣性低的特點，且COⅠ序列的堿基突變速率相對于線粒體控制區(qū)較慢，而須鯽、尖鰭鯉和三角鯉的線粒體COⅠ序列上還沒積累足夠多的變異。