賈英民,張軼斐,劉鵬,李長新,常靜,戴浩然,劉偉敬,劉寶利

慢性腎病(chronic kidney diseases,CKD)是由于各種腎臟疾病導(dǎo)致自身腎功能不可逆轉(zhuǎn)的下降,我國和世界范圍內(nèi)CKD的發(fā)病率逐年增加,已成為嚴(yán)重危害人類健康的全球性公共衛(wèi)生問題。腎臟容易受到氧化還原失衡和氧化應(yīng)激的影響。氧化應(yīng)激在腎臟疾病進(jìn)展中發(fā)揮著重要作用,與水鈉潴留、腎血流量變化、蛋白尿、腎組織纖維化密切相關(guān),大量研究表明,氧化應(yīng)激水平升高可引起腎功能惡化,導(dǎo)致腎臟內(nèi)皮細(xì)胞損傷。細(xì)胞磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine, PS)是一種主要位于內(nèi)膜小葉中帶負(fù)電荷的氨基磷脂,暴露在質(zhì)膜外小葉上的PS可對(duì)各種刺激作出反應(yīng),或在囊泡生成過程中參與各種疾病的進(jìn)展,與炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。當(dāng)疾病進(jìn)展到CKD 第5期時(shí),此階段由于腎功能的降低或缺失會(huì)出現(xiàn)體液潴留、貧血、骨礦物質(zhì)代謝紊亂、血脂異常和蛋白質(zhì)能量營養(yǎng)不良等并發(fā)癥,又被稱為終末期腎病(end-stage renal disease, ESRD),臨床中常需要依賴腎臟替代治療以維持生命。目前我國大多數(shù)ESRD患者需要進(jìn)行腹膜或血液透析(hemodialysis, HD)治療,其中建立自體動(dòng)靜脈內(nèi)瘺(native arteriovenous fistula, AVF)是ESRD患者進(jìn)行長期血液透析的首選方式[1-2]。CKD5期患者血管內(nèi)皮損傷對(duì)于AVF的建立、成熟和臨床應(yīng)用影響重大。研究發(fā)現(xiàn)[3],氧化應(yīng)激反應(yīng)可加重血管內(nèi)皮損傷,同時(shí)可觀察到細(xì)胞PS外翻增加。因此,本研究探討CKD患者中PS外翻、氧化應(yīng)激與血管內(nèi)皮損傷的表達(dá),分析其相關(guān)性,有助于了解CKD患者病情程度并判斷預(yù)后,對(duì)于血液透析患者則有利于減少AVF的臨床并發(fā)癥及延長AVF使用時(shí)間,報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 參照“腎臟病預(yù)后質(zhì)量倡議”(KDOQI)和“改善全球腎臟病預(yù)后”(KDIGO)工作組制定的CKD指南的診斷標(biāo)準(zhǔn)[4-5],選取2019年1月—2021年12月在北京中醫(yī)醫(yī)院順義醫(yī)院門診及病房診斷為CKD 2～5期患者88例。其中男 50例,女 38例,年齡33～75(54.59±20.71歲);原發(fā)病:糖尿病腎病38例(43.18%),慢性腎小球腎炎19例(21.59%),高血壓腎病19例(21.59%),慢性腎盂腎炎、梗阻性腎病、缺血性腎病、心腎綜合征、多囊腎、淀粉樣變腎病各2例(各占2.27%);根據(jù)估算的腎小球?yàn)V過率(eGFR)將其腎功能損傷的病情分為重、中、輕度3組,符合CKD 5期(重度)患者(eGFR<15 ml·min-1·1.73m-2)53例、CKD 4期(中度)患者(15

1.2 病例納入及排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn):(1)血清組:①符合慢性腎臟病診斷標(biāo)準(zhǔn),CKD分期2～5期患者;②年齡在18～75歲。(2)AVF手術(shù)組:①符合慢性腎衰竭臨床診斷標(biāo)準(zhǔn);②年齡在18～75歲;③GFR<30 ml·min-1·1.73m-2,決定選擇HD治療;④eGFR<15 ml·min-1·1.73m-2、血清肌酐>528 μmol/L或糖尿病腎病患者eGFR<25 ml/(min·1.73m2)、血清肌酐>352 μmol/L,預(yù)計(jì)6個(gè)月內(nèi)需進(jìn)入HD治療;⑤尿毒癥癥狀明顯,支持治療難以控制者;⑥ESRD已經(jīng)進(jìn)入規(guī)律血液透析患者;⑦血管條件符合動(dòng)靜脈內(nèi)瘺手術(shù)條件者。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn):(1)心力衰竭未能控制;(2)血管條件差,中心靜脈或近心端大靜脈存在嚴(yán)重狹窄等;(3)凝血功能嚴(yán)重異常;(4)手術(shù)部位有感染及燒燙傷等;(5)前臂Allen試驗(yàn)陽性;(6)患者預(yù)期存活不超過6個(gè)月;(7)其他不能配合手術(shù)者。

1.3 觀察指標(biāo)與方法

1.3.1 血生化指標(biāo)檢測(cè):采集患者空腹外周靜脈血4 ml,室溫靜置30 min,后3 000 r/min離心10 min,收集上層血清,全自動(dòng)生化儀檢測(cè)血清肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)及尿酸(UA)水平。

1.3.2 氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè):上述血清,運(yùn)用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定血清中超氧化物歧化酶(supero-xide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GPx)(購自北京聚合美生物科技有限公司),內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)等氧化應(yīng)激反應(yīng)指標(biāo)。試驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒(購自英國abcam)說明書步驟操作。

1.3.3 血液血管內(nèi)皮功能檢測(cè):上述血清運(yùn)用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)和PS的表達(dá)。試驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒(購自英國abcam)說明書步驟操作。

1.3.4 靜脈血管內(nèi)皮功能檢測(cè):采集自體動(dòng)靜脈內(nèi)瘺制作手術(shù)中所修剪的靜脈血管和肢體外傷患者及肢體外科手術(shù)中所取得的靜脈血管,將這些靜脈血管固定、石蠟包埋后進(jìn)行免疫組化處理。小鼠抗人VEGF、血管內(nèi)皮生長因子受體2(VEGFR2)、SOD-1、GPx-1/2單克隆抗體購自Santa Cruz公司,PV8000染色試劑盒(內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑、超氧酶標(biāo)山羊抗鼠/兔IgG聚合物、DAB濃縮液、DAB稀釋液購自北京中杉金橋公司)。采用PV-8000通用型二步免疫組化法:將蠟塊切片,72℃烤片,常規(guī)脫蠟至水,高壓EDTA 8.0修復(fù)2.5 min,PBS清洗,3% H2O2阻斷15 min,PBS清洗,加適量稀釋的一抗(VEGF 1∶50、VEGFR2 1∶50、SOD-1 1∶50、GPx-1/2 1∶25),37℃孵育1 h,加二抗37℃孵育20 min,DAB顯色約3 min,蘇木素復(fù)染,脫水透明,中性樹膠封片。以PBS代替一抗設(shè)立陰性對(duì)照,以人VEGF、VEGFR2、SOD-1、GPx-1/2陽性的未伴有腎臟病肢體外傷及肢體外科手術(shù)患者為陽性對(duì)照。對(duì)SOD-1、GPx、VEGF、VEGFR2(購自北京聚合美生物)表達(dá)進(jìn)行檢測(cè),以陽性細(xì)胞數(shù)量為觀察指標(biāo),對(duì)細(xì)胞的染色深淺程度及著色數(shù)量進(jìn)行評(píng)估。

2 結(jié) 果

2.1 各組CKD患者年齡、病程和腎功能指標(biāo)比較 在各項(xiàng)臨床資料信息中,3組患者的年齡、病程和血清SCr、BUN、UA等隨病情嚴(yán)重而升高,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見表1。

表1 3組CKD患者一般資料及腎功能指標(biāo)比較

2.2 各組CKD患者血清氧化應(yīng)激指標(biāo)比較 3組患者的MDA、eNOS水平隨病情嚴(yán)重而升高,SOD、GPx表達(dá)隨病情進(jìn)展而下降,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或0.05),見表2。

表2 各組CKD患者氧化應(yīng)激、PS外翻和VEGF表達(dá)情況比較

2.3 各組患者血清VEGF、 PS外翻結(jié)果比較 3組患者血清VEGF、PS隨病情加重而升高,組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見表2。

2.4 AVF組與正常對(duì)照組靜脈組織中SOD-1、GPx、VEGF、VEGFR2的免疫組化染色表達(dá)比較 血管內(nèi)皮細(xì)胞免疫組化染色后,細(xì)胞核染呈藍(lán)色,胞膜和胞漿染根據(jù)染色強(qiáng)度呈黃色或棕褐色。通過光鏡下觀察陽性細(xì)胞著色數(shù)量及程度進(jìn)行評(píng)判,在正常對(duì)照組中SOD-1、GPx、VEGF、VEGFR2均呈弱表達(dá)(見圖1);在進(jìn)行AVF手術(shù)的ESRD患者中,SOD-1、GPx、VEGF、VEGFR2表達(dá)點(diǎn)主要位于細(xì)胞漿,部分還定位于胞膜(見圖1),SOD-1、GPx、VEGF、VEGFR2均呈高表達(dá)。

2.5 CKD-5期患者氧化應(yīng)激因素與PS外翻及血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷之間的線性回歸分析 將血清標(biāo)本中CKD-5期所測(cè)得的PS暴露水平與MDA、SOD、GPx、eNOS水平進(jìn)行多元線性回歸分析,將PS暴露水平及4個(gè)氧化應(yīng)激指標(biāo)與VEGF表達(dá)水平進(jìn)行單因素回歸分析,結(jié)果表明PS暴露水平與SOD、GPx表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(P<0.01),與MDA、eNOS表達(dá)呈正相關(guān)(P<0.01);VEGF表達(dá)與MDA、eNOS表達(dá)呈正相關(guān),與SOD、GPx表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(P<0.01);PS暴露水平與VEGF表達(dá)呈正相關(guān)(P<0.01),見表3。

表3 PS外翻水平與氧化應(yīng)激因素及血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的相關(guān)性分析

2.6 氧化應(yīng)激指標(biāo)與內(nèi)皮細(xì)胞損傷對(duì)PS外翻的預(yù)測(cè)價(jià)值 以PS未外翻患者作為陰性樣本,PS外翻陽性患者作為陽性樣本,繪制ROC曲線,結(jié)果表明SOD、GPx、MDA、eNOS、VEGF預(yù)測(cè)PS外翻的AUC分別為0.819、0.818、0.735、0.824、0.892,見表4、圖2。

圖2 CKD患者血清SOD、GPx、MDA、eNOS、VEGF預(yù)測(cè)PS外翻的ROC曲線Fig.2 ROC curve of serum SOD, GPx, MDA, eNOS, and VEGF predicting PS valgus in CKD patients

表4 SOD、GPx、MDA、eNOS、VEGF預(yù)測(cè)PS外翻相關(guān)模型AUC比較

3 討 論

在我國CKD的發(fā)病率呈現(xiàn)持續(xù)上升趨勢(shì),約有10.8%成年人患有CKD,其中每年約1%的患者進(jìn)入ESRD階段,需要通過腎臟替代治療才能維持生命[6-7]。研究表明[8],氧化應(yīng)激與腎小球?yàn)V過率呈負(fù)相關(guān),進(jìn)展到ESRD階段的患者,其腎功能伴隨著氧化應(yīng)激狀態(tài)的增強(qiáng)而惡化,其氧化應(yīng)激的產(chǎn)生與慢性炎性反應(yīng)增加,抗氧化能力減弱,晚期糖基化引起的腎小球穩(wěn)態(tài)紊亂,透析治療引起補(bǔ)體途徑激活及中性粒細(xì)胞活化等因素有關(guān)。而氧化應(yīng)激使活性氧(reactive oxygen species, ROS)聚集,可通過多條通路加劇腎臟炎性反應(yīng),促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)沉積,增加血管通透性,改變腎臟血流狀態(tài),引起小管上皮細(xì)胞凋亡,小管間質(zhì)纖維化以及足細(xì)胞、系膜細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞的損傷等病理改變,進(jìn)而加重腎臟病情[9]。CKD患者的氧化應(yīng)激狀態(tài)又表現(xiàn)為多種氧化損傷標(biāo)志物水平的增加以及抗氧化防御能力的平行降低。MDA是脂質(zhì)過氧化標(biāo)志物之一,當(dāng)自由基等氧化劑攻擊脂質(zhì)時(shí)可出現(xiàn)增高。GPx、SOD作為重要的抗氧化酶,可阻止羥自由基的產(chǎn)生并抵消脂質(zhì)過氧化的毒性作用,當(dāng)機(jī)體氧化應(yīng)激水平增高時(shí),二者表達(dá)下降[10]。本研究同樣發(fā)現(xiàn),CKD患者血清氧化應(yīng)激水平隨著病情程度的加重而顯著增強(qiáng),其中既包括過氧化產(chǎn)物MDA明顯升高,還包括抗氧化的SOD和GPx水平降低。

在腎臟替代治療中,AVF被認(rèn)為是最理想的永久性血液通路,故血管內(nèi)皮細(xì)胞(vascular endothelial cells, VECs)與ESRD關(guān)系密切[11]。VECs由單層扁平細(xì)胞或多角形細(xì)胞構(gòu)成,是位于血流與血管平滑肌細(xì)胞之間的屏障。血管作為高代謝率器官,VECs具有調(diào)節(jié)血管張力、炎性反應(yīng)修復(fù)、抗凝促纖等作用,可感應(yīng)血流中氧氣含量、剪切應(yīng)力、滲透壓和炎性反應(yīng)激素等局部微環(huán)境的變化而發(fā)生改變。VECs作為循環(huán)系統(tǒng)的重要組成部分,氧化應(yīng)激可引起VECs功能障礙,研究表明[12]接受替代治療的患者中,心血管疾病是導(dǎo)致死亡的主要原因,占該類患者死亡人數(shù)的40%以上。eNOS主要存在于內(nèi)皮細(xì)胞中,具有降低VECs黏附性,調(diào)節(jié)血管張力的作用[13],病理狀態(tài)下,eNOS結(jié)構(gòu)解偶聯(lián)并與氧分子相互作用生成超氧陰離子,引起ROS增多,使氧化應(yīng)激增強(qiáng)并引發(fā)內(nèi)皮功能障礙,二者可互相加重[14]。VEGF具有促進(jìn)VECs增殖、增加血管通透性、刺激新生血管形成的作用,正常人中VEGF 水平較低,而在透析患者中出現(xiàn)高表達(dá)。本研究同樣得出eNOS與VEGF均可隨著病情加重而增高的結(jié)論,表明終末期腎臟病患者內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂,而Pearson相關(guān)性分析亦證實(shí)氧化應(yīng)激增強(qiáng)則是引起血管內(nèi)皮損傷的重要機(jī)制。

PS由磷脂酰膽堿或磷脂酰乙醇胺通過Ca2+依賴性堿基交換反應(yīng)合成,其中預(yù)先存在的磷脂的極性頭部基團(tuán)被絲氨酸取代[15]。PS作為細(xì)胞質(zhì)膜重要的磷脂成分之一,廣泛存在于紅細(xì)胞、血小板、內(nèi)皮細(xì)胞等真核細(xì)胞當(dāng)中[16]。生理?xiàng)l件下,質(zhì)膜中的PS在能量依賴機(jī)制作用下,通過P4-ATP酶(PS翻轉(zhuǎn)酶)的調(diào)節(jié)將PS從外質(zhì)集中到細(xì)胞質(zhì)內(nèi)小葉中,而磷脂干擾酶則可將細(xì)胞膜內(nèi)外的磷脂進(jìn)行非特異性轉(zhuǎn)運(yùn),二者共同維持磷脂的這種不對(duì)稱分布[17]。在細(xì)胞凋亡或胞內(nèi)出現(xiàn)ATP供能不足、Ca2+水平升高等病理?xiàng)l件時(shí),細(xì)胞膜的這種不對(duì)稱性發(fā)生了破壞,導(dǎo)致了質(zhì)膜PS外翻[18]。PS外翻在細(xì)胞凋亡中優(yōu)先作為吞噬細(xì)胞的識(shí)別信號(hào)[19],又能作為引信信號(hào)成為趨化因子的適配器[20],可以說PS外翻是凋亡細(xì)胞的普遍特征。研究表明[21],PS可作為細(xì)胞色素C(cytochrome C,Cyt C)的靶標(biāo)參與細(xì)胞凋亡,在凋亡過程中Cyt c從線粒體上分離,并伴有細(xì)胞內(nèi)電子傳遞的中斷,從而使細(xì)胞凋亡常伴隨著ROS的產(chǎn)生?，F(xiàn)已證實(shí)[21],由氧化劑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡可導(dǎo)致不同類型的磷脂和PS氧化,可以說PS的氧化修飾是凋亡程序的一個(gè)組成部分[22],所以在細(xì)胞凋亡過程中PS的氧化和外翻相互協(xié)作,均是細(xì)胞凋亡程序的內(nèi)在特征,其中PS氧化先于PS外翻并促進(jìn)PS外翻[21],氧化的PS可增強(qiáng)巨噬細(xì)胞對(duì)PS外翻細(xì)胞的吞噬[23-24]。本研究結(jié)果同樣發(fā)現(xiàn),SOD、GPx、MDA、eNOS與PS外翻具有較強(qiáng)相關(guān)性,表明CKD中氧化應(yīng)激增強(qiáng)可引起PS外翻。同時(shí)PS 還是凝血啟動(dòng)的重要信號(hào)分子,血小板活化可引起PS外翻,PS外翻加速了凝血因子FX激活和凝血酶生成,從而激活凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)[25-26]。研究表明[27-28],通過PS與CXCL16/SRPSO的相互作用,可促進(jìn)紅細(xì)胞表面的PS與內(nèi)皮細(xì)胞黏附,結(jié)合在內(nèi)皮上的紅細(xì)胞可干擾微循環(huán),阻礙正常血運(yùn),而外翻的紅細(xì)胞PS可進(jìn)一步與血小板結(jié)合,同樣內(nèi)皮細(xì)胞的PS外翻也可成為與白細(xì)胞結(jié)合位點(diǎn),使凝血酶原復(fù)合物形成,從而進(jìn)一步導(dǎo)致血栓、炎性反應(yīng)等級(jí)聯(lián)反應(yīng)。此外,PS還可由膜微粒(membrane microparticles, MPs)表達(dá),MPs是在細(xì)胞活化和細(xì)胞凋亡時(shí)由內(nèi)皮細(xì)胞和血細(xì)胞脫落而形成的膜囊泡。CKD患者引起氧化應(yīng)激介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡,導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞微粒釋放[28],內(nèi)皮微粒增多既增強(qiáng)PS暴露,還是內(nèi)皮功能障礙的標(biāo)志[29],符合本研究得出的PS外翻與血管內(nèi)皮細(xì)胞的損害具有較強(qiáng)正相關(guān)的結(jié)果。

綜上所述,PS外翻可損傷內(nèi)皮細(xì)胞,加重細(xì)胞凋亡,并促進(jìn)血栓形成和炎性反應(yīng)等病理作用。CKD患者普遍存在高氧化應(yīng)激狀態(tài),過多的ROS聚集可損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞,增強(qiáng)PS外翻,對(duì)于ESRD患者,可影響其AVF功能,造成AVF血栓形成導(dǎo)致AVF失功,從而加重腎損害。因此,探討氧化應(yīng)激、血管內(nèi)皮損傷與PS外翻相關(guān)性的研究,可為進(jìn)一步延長ESRD患者AVF使用壽命、減少心血管事件、降低患者死亡率提供新的治療思路。

(致謝:感謝中日友好醫(yī)院李平教授對(duì)論文研究思路及修改方面提出的意見與建議)

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

賈英民:設(shè)計(jì)研究方案,實(shí)施研究過程,分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)、論文撰寫、修改;張軼斐:分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,論文修改;劉鵬:設(shè)計(jì)研究方案、論文修改;李長新:病理資料分析;常靜、戴浩然:臨床資料整理;劉偉敬、劉寶利:提出研究思路,指導(dǎo)實(shí)施研究過程