林佩儀,梁 宇,侯展鵬,王金輝,王海悅,張續(xù)勐,江丹莉,李婉雁,劉文俊,曹 楠,許丹寧,田允波,黃運(yùn)茂,李秀金,付新亮

(仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院 動(dòng)物科技學(xué)院 廣東省水禽健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 廣州 510225)

隨著現(xiàn)代集約化禽類養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展,飼養(yǎng)密度成為重要的環(huán)境和管理因素之一[1]。增加飼養(yǎng)密度可以在一定程度上提高產(chǎn)量,但這會(huì)對(duì)家禽的生產(chǎn)性能和健康等方面產(chǎn)生負(fù)面影響[2-3],如生長性能降低、氧化應(yīng)激以及腸道微生物菌群失調(diào)等[4]。研究表明,高飼養(yǎng)密度顯著降低肉雞的平均體質(zhì)量和肉品質(zhì)[5-6];隨著飼養(yǎng)密度的增加,鵪鶉的產(chǎn)蛋率下降,羽毛評(píng)分降低,免疫器官指數(shù)下降,血清免疫和生化指標(biāo)受負(fù)面影響[7];研究結(jié)果顯示,12只/m2的飼養(yǎng)密度可增強(qiáng)北京鴨黏膜免疫的代償反應(yīng),刺激呼吸道黏膜,提高黏膜中分泌型IgA的含量,降低腸道消化酶的活性,并引起機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)[8]。此外,增大飼養(yǎng)密度還會(huì)引起蛋鴨機(jī)體應(yīng)激反應(yīng),降低機(jī)體的抗氧化能力并影響免疫功能[9]。山麻鴨是我國福建省的一個(gè)小體型蛋用鴨種,主要分布在我國福建、江西、廣東和浙江等地,飼養(yǎng)量達(dá)2.5億～3億只,約占蛋鴨飼養(yǎng)量的1/2,具有早熟、產(chǎn)蛋量高等特點(diǎn)[10-11]。長期以來,對(duì)飼養(yǎng)密度的探究多以肉雞和肉鴨為模型,關(guān)于飼養(yǎng)密度對(duì)山麻鴨等蛋鴨腸道健康和菌群結(jié)構(gòu)影響的報(bào)道較少,且規(guī)?；B(yǎng)殖的適宜飼養(yǎng)密度范圍尚沒有統(tǒng)一的參數(shù)[12-13]。本試驗(yàn)通過分析不同飼養(yǎng)密度下育成期山麻鴨的腸道黏膜組織學(xué)變化、炎性損傷、消化酶活性以及盲腸微生物菌群結(jié)構(gòu),探究飼養(yǎng)密度對(duì)腸道健康的影響,為山麻鴨的集約化養(yǎng)殖提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物試驗(yàn)設(shè)計(jì)及日糧180只體質(zhì)量大小基本一致的56日齡健康育成期山麻鴨,隨機(jī)分為LSD(低密度,n=30)、MSD(中密度,n=60)和HSD(高密度,n=90)3組,每組3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。舍內(nèi)分布如下,鴨舍∶運(yùn)動(dòng)場(chǎng)∶水池=6 m2∶6 m2∶3 m2,即低密度、中密度、高密度3個(gè)試驗(yàn)組的舍內(nèi)密度分別為5,10,15只/m2(飼養(yǎng)密度按照鴨舍面積計(jì)算,運(yùn)動(dòng)場(chǎng)與水池面積不計(jì)入在內(nèi)[3])。試驗(yàn)期間嚴(yán)格按照生產(chǎn)日糧飼喂,基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平見表1,其他條件均按常規(guī)飼養(yǎng)規(guī)程執(zhí)行。

1.2 樣品采集每組隨機(jī)選取6只鴨,分別于試驗(yàn)第3,6和9周進(jìn)行采樣,采樣前禁飼12 h。使用無菌采血管翅下靜脈采血(2 mL/只),室溫下靜置2 h后3 000 r/min離心5 min,取血清于-20℃凍存?zhèn)溆谩２杉漳c組織樣品,一份用4%多聚甲醛固定,用于組織形態(tài)學(xué)檢查;另一份液氮速凍后轉(zhuǎn)移到-80℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?。無菌采集各組盲腸內(nèi)容物樣品于滅菌凍存管中,液氮速凍后轉(zhuǎn)移到-80℃冰箱保存,用于16S rDNA擴(kuò)增子測(cè)序。

1.3 血清內(nèi)毒素、炎性因子水平和腸道消化酶活性測(cè)定白細(xì)胞介素1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素8(IL-8)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)測(cè)定試劑盒均購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司,按照試劑盒說明書通過ELISA方法測(cè)定山麻鴨血清中的IL-1β、IL-8和TNF-α含量。LPS測(cè)定試劑盒、腸道α-淀粉酶、蔗糖酶和糜蛋白酶活性測(cè)定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所,根據(jù)試劑盒說明書通過比色法測(cè)定血清中LPS水平;用生理鹽水沖洗空腸3次除去食糜后,刮取腸道粘液,根據(jù)試劑盒操作說明書通過比色法分別對(duì)α-淀粉酶、蔗糖酶和糜蛋白酶活性進(jìn)行測(cè)定。

1.4 空腸組織基因表達(dá)水平測(cè)定利用TRIzol法從空腸組織中提取總RNA,并通過PrimeScriptTM反轉(zhuǎn)錄試劑試劑盒(TaKaRa,Da Lian)將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以β-actin為內(nèi)參,進(jìn)一步通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-Time qPCR)分別測(cè)定各組空腸組織中的炎性因子(IL-8和TNF-α)和相關(guān)通路(TLR-4、MyD88和NF-κB)的基因表達(dá)水平,以及腸道組織緊密連接蛋白(OCLN和ZO1)的基因表達(dá)水平,引物序列如表2所示,引物由華大基因合成。

表2 引物序列信息

1.5 盲腸內(nèi)容物16S rDNA 擴(kuò)增子測(cè)序分別提取各組盲腸內(nèi)容物總基因組DNA,對(duì)16S rDNA的V3-V4區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,通過瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化和回收。使用TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒進(jìn)行文庫構(gòu)建,構(gòu)建好的文庫經(jīng)質(zhì)檢合格后,使用Illumina NovaSeq平臺(tái)進(jìn)行上機(jī)測(cè)序。對(duì)測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)(raw data)進(jìn)行拼接、過濾,得到樣本有效數(shù)據(jù)(clean data),并根據(jù)測(cè)序結(jié)果中的有效數(shù)據(jù)進(jìn)行OTUs(operational taxonomic units)聚類分析和物種分類分析。盲腸內(nèi)容物16S rDNA 擴(kuò)增子測(cè)序送由北京諾禾致源科技股份有限公司完成。

2 結(jié)果

2.1 不同飼養(yǎng)密度對(duì)生長性能的影響飼養(yǎng)密度對(duì)山麻鴨生長性能的影響如表3所示,在試驗(yàn)第3,6和9周,LSD組的山麻鴨體質(zhì)量均顯著高于MSD和HSD組(P<0.05),但MSD和HSD兩組之間鴨的體質(zhì)量無顯著差異。以上結(jié)果顯示,飼養(yǎng)密度過大會(huì)影響山麻鴨的生長性能。

表3 不同飼養(yǎng)密度對(duì)山麻鴨生長性能的影響

2.2 不同飼養(yǎng)密度對(duì)空腸組織結(jié)構(gòu)和物理屏障的影響由圖1可知,試驗(yàn)第6,9周HSD組山麻鴨平均空腸絨毛長度顯著低于LSD和MSD組(P<0.01)(圖1A);而試驗(yàn)第3,6和9周,HSD組鴨空腸的隱窩深度均高于LSD和MSD組,但無顯著性差異(圖1B)。絨隱比作為衡量腸道功能的重要指標(biāo),HSD組在試驗(yàn)第9周鴨空腸組織絨隱比顯著低于LSD組(P<0.05)(圖1C),與LSD和MSD組相比,HSD組在試驗(yàn)第3,6周鴨空腸組織絨隱比低于LSD和MSD組,但差異不顯著(P>0.05)?？漳c組織緊密連接蛋白基因表達(dá)水平測(cè)定結(jié)果顯示,試驗(yàn)第3,6周各組鴨空腸組織OCLN和ZO1基因的mRNA表達(dá)水平無顯著差異(P>0.05),但試驗(yàn)第9周,HSD組鴨空腸組織OCLN和ZO1基因的mRNA表達(dá)水平顯著低于LSD和MSD組(P<0.001)(圖2)。以上結(jié)果表明,長期高飼養(yǎng)密度條件下可引起山麻鴨空腸絨毛長度和絨隱比,以及空腸組織緊密連接蛋白基因表達(dá)水平顯著降低,影響腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)和物理屏障功能受損。

A.空腸絨毛長度統(tǒng)計(jì);B.空腸隱窩深度統(tǒng)計(jì);C.空腸絨隱比統(tǒng)計(jì) *表示差異顯著(P<0.05),**(P<0.01)和***(P<0.001)表示差異極顯著。下同

圖2 不同飼養(yǎng)密度對(duì)山麻鴨空腸組織中OCLN、ZO1基因表達(dá)水平的影響

2.3 不同飼養(yǎng)密度對(duì)空腸組織中消化酶活性的影響由圖3可知,試驗(yàn)第9周HSD和MSD組山麻鴨空腸組織α-淀粉酶活性均顯著低于LSD組(P<0.001),且第6周HSD組空腸α-淀粉酶活性也顯著低于MSD組(P<0.05)(圖3A); HSD和MSD組鴨空腸糜蛋白酶活性在試驗(yàn)第3,6和9周均顯著低于LSD組(P<0.01)(圖3B);HSD組鴨空腸蔗糖酶活性在試驗(yàn)第3周顯著低于LSD組(P<0.05),但試驗(yàn)第6,9周3個(gè)試驗(yàn)組鴨的空腸蔗糖酶活性無顯著變化(圖3C)。以上結(jié)果表明,飼養(yǎng)密度過高可引起山麻鴨空腸組織α-淀粉酶、糜蛋白酶和蔗糖酶的消化酶活性降低。

A.空腸淀粉酶活性變化;B.空腸糜蛋白酶活性變化;C.空腸蔗糖酶活性變化

2.4 不同飼養(yǎng)密度對(duì)血清LPS和炎性細(xì)胞因子水平的影響由圖4可知,HSD組山麻鴨在試驗(yàn)第6,9周時(shí),血清LPS水平均顯著高于MSD和LSD組(P<0.05)(圖4A);并且HSD組在試驗(yàn)第6周時(shí),鴨血清中IL-1β、IL-8和TNF-α 3種炎性細(xì)胞因子的水平均顯著高于LSD組(P<0.05),但在第3,9周3個(gè)試驗(yàn)組鴨血清中的炎性細(xì)胞因子水平均無顯著變化(圖4B、C、D)。以上結(jié)果表明,高飼養(yǎng)密度可引起山麻鴨血清LPS和炎性細(xì)胞因子水平升高,可能對(duì)機(jī)體造成炎性損傷。

A.血清LPS濃度變化;B.血清TNF-α濃度變化;C.血清IL-1β濃度變化;D.血清IL-8濃度變化

2.5 不同飼養(yǎng)密度對(duì)空腸組織TLR4/NF-κB信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)的影響由圖5可知,試驗(yàn)第3,6和9周HSD組山麻鴨空腸組織中IL-8基因mRNA表達(dá)水平顯著高于LSD和MSD組(P<0.01)(圖5A),并且在試驗(yàn)第3周HSD組鴨空腸組織TNF-α基因mRNA表達(dá)水平也顯著高于LSD和MSD組(P<0.001)(圖5B);對(duì)鴨空腸組織TLR-4、MyD88和NF-κB基因的mRNA表達(dá)水平測(cè)定結(jié)果顯示,試驗(yàn)第3周,HSD組鴨3種基因的mRNA表達(dá)水平均顯著高于LSD和MSD組(P<0.01),但試驗(yàn)第6,9周無顯著變化(圖5C、D、E)?？漳c組織炎性因子分析結(jié)果表明,飼養(yǎng)密度過大可誘導(dǎo)TLR-4炎性因子通路的激活,導(dǎo)致山麻鴨空腸組織炎性因子表達(dá)量升高,可能誘導(dǎo)空腸組織的炎性損傷。

A.空腸IL-8基因表達(dá)水平變化;B.空腸TNF-α基因表達(dá)水平變化;C.空腸TLR-4基因表達(dá)水平變化;D.空腸MyD88基因表達(dá)水平變化;E.空腸NF-κB基因表達(dá)水平變化

2.6 不同飼養(yǎng)密度對(duì)山麻鴨盲腸微生物菌群的影響OTUs分析結(jié)果(圖6)顯示,試驗(yàn)第3,6周各組山麻鴨盲腸微生物的OTUs數(shù)目無顯著變化,但試驗(yàn)第9周,MSD和HSD組盲腸微生物的OTUs數(shù)目低于LSD組(圖6A),表明長期高飼養(yǎng)密度條件下可導(dǎo)致山麻鴨腸道微生物的多樣性降低。另外,分別在門(phylum)和屬(genus)水平上對(duì)各組鴨盲腸微生物豐度排名前10的物種進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)擬桿菌門(Bacteroidetes)和厚壁菌門(Firmicutes)為各組共同的優(yōu)勢(shì)菌門(圖6B),而在屬水平上,擬桿菌屬(Bacteroides)和梭桿菌屬(Fusobacterium)為各試驗(yàn)組的優(yōu)勢(shì)菌屬(圖6C)。通過LEfSe對(duì)各試驗(yàn)組鴨盲腸微生物的主要差異菌群進(jìn)行分析,結(jié)果顯示,在試驗(yàn)第3,9周時(shí)HSD組的盲腸微生物中厚壁菌門的相對(duì)豐度顯著下降(P<0.05),而試驗(yàn)第6周時(shí)HSD組的盲腸微生物中擬桿菌門的相對(duì)豐度在顯著下降(P<0.05);此外,在試驗(yàn)第3,6和9周時(shí),HSD組的盲腸微生物中梭桿菌門(Fusobacteruota)的相對(duì)豐度顯著高于LSD和MSD組(P<0.05)(圖6D)。在屬水平上,試驗(yàn)第3周HSD組的盲腸微生物中擬桿菌門的普雷沃菌屬(Prevotellaceae_Ga6A1_group)和理研菌屬(Rikenellaceae_RC9_gut_group)的相對(duì)豐度顯著降低(P<0.05)(圖6D)。盲腸微生物菌群分析結(jié)果表明,飼養(yǎng)密度過大會(huì)使山麻鴨盲腸中有益菌的相對(duì)豐度減少,而梭桿菌屬等有害菌群的豐度增加,導(dǎo)致腸道微生物菌群失衡。

3 討論

飼養(yǎng)密度對(duì)于家禽生長發(fā)育和繁殖至關(guān)重要,低密度飼養(yǎng)有利于青年蛋鴨的生長和性成熟,而高密度飼養(yǎng)顯著影響了青年蛋鴨增重,降低生長速度,推遲產(chǎn)蛋日齡[3]。研究表明,高飼養(yǎng)密度會(huì)引起肉雞采食量減少從而導(dǎo)致出欄體質(zhì)量下降[1,14],但也有學(xué)者認(rèn)為高密度飼養(yǎng)并不能引起生產(chǎn)性能的顯著下降,可能與不同研究中鴨的品種、飼養(yǎng)條件和飼養(yǎng)管理水平等存在差異有關(guān)[12]。

家禽的腸道屏障結(jié)構(gòu)主要包括物理屏障、化學(xué)屏障、免疫屏障和微生物屏障4個(gè)方面。家禽在生長過程中容易受環(huán)境應(yīng)激和營養(yǎng)等多種因素的影響,引起腸道屏障功能受損以及腸道菌群紊亂,進(jìn)而引發(fā)各種疾病和生產(chǎn)性能降低,甚至導(dǎo)致死亡[15]。研究表明,較高的飼養(yǎng)密度可通過破壞腸道物理屏障(緊密連接蛋白)、化學(xué)屏障(黏蛋白和消化酶等)、免疫屏障(腸黏膜分泌型IgA)和微生物屏障(腸道微生物組成)來影響動(dòng)物的腸道健康,導(dǎo)致腸道的組織結(jié)構(gòu)受損,消化、吸收和黏膜免疫功能降低以及腸道微生物菌群紊亂[8,16]。

腸道的組織結(jié)構(gòu)形態(tài)如小腸絨毛高度、隱窩深度以及絨隱比可以一定程度上反映出腸道的健康情況[14,17]。絨毛高度下降表明吸收面積減少,而隱窩深度加深則表明小腸黏膜絨毛萎縮,吸收消化下降[18]。相關(guān)研究表明,在高飼養(yǎng)密度下(16只/m2)肉雞十二指腸、空腸和回腸的絨毛高度顯著減短,十二指腸絨隱比顯著降低,但對(duì)其隱窩深度無顯著影響[19]。本試驗(yàn)結(jié)果表明,高飼養(yǎng)密度會(huì)顯著降低山麻鴨的空腸絨毛高度及絨隱比,而空腸隱窩深度無顯著變化,這與以往研究結(jié)果一致。有學(xué)者提出腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的損傷有可能是因?yàn)槟c道微生物菌群結(jié)構(gòu)失調(diào)導(dǎo)致絨毛上皮細(xì)胞過度凋亡所致[20]。緊密連接蛋白的表達(dá)水平降低是腸道物理屏障功能受損的直接分子證據(jù)[21],本試驗(yàn)中我們測(cè)定了OCLN和ZO1等部分緊密連接蛋白在山麻鴨空腸組織中的基因表達(dá)水平。結(jié)果顯示,高飼養(yǎng)密度使山麻鴨空腸組織中OCLN和ZO1的基因表達(dá)水平顯著下降,降低了空腸黏膜緊密連接的完整性,這與以往的研究結(jié)果一致[1]。

相關(guān)研究報(bào)道,在高飼養(yǎng)密度條件下,北京鴨腸道黏膜中蔗糖酶、糜蛋白酶、堿性磷酸酶的活性顯著降低,而淀粉酶和脂肪酶的活性在不同飼養(yǎng)密度下無顯著變化[8]。與之相似,在本試驗(yàn)中,高飼養(yǎng)密度會(huì)導(dǎo)致山麻鴨空腸組織中的α-淀粉酶和糜蛋白酶活性顯著降低,本試驗(yàn)結(jié)果提示較高的飼養(yǎng)密度可能會(huì)影響山麻鴨腸道的消化功能。

目前,我國鴨主要養(yǎng)殖模式以地面平養(yǎng)與水養(yǎng)相結(jié)合為主,在高密度飼養(yǎng)條件下極易導(dǎo)致鴨舍和水體糞便污染嚴(yán)重,鴨群直接接觸病原促使大量病原菌進(jìn)入其腸道,細(xì)菌內(nèi)毒素LPS誘導(dǎo)鴨腸道上皮細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng),對(duì)鴨腸道免疫屏障造成一定的損傷[22-23]。TLR-4可特異性識(shí)別LPS并激活MyD88/NF-κB炎癥信號(hào)通路,誘導(dǎo)促炎因子(IL-1β、TNF-α等)的產(chǎn)生,引起機(jī)體的炎性損傷[24,25]。相關(guān)研究表明,LPS能引起肉雞血清中TNF-α、IL-2、IL-6和IFN-γ的細(xì)胞因子水平顯著升高[26],并導(dǎo)致雛鵝盲腸黏膜組織中TLR-4、MyD88、NF-κB、IL-1β和TNF-α基因的mRNA表達(dá)水平顯著升高,進(jìn)而造成腸道的炎性損傷[20,24]。在本試驗(yàn)中,高飼養(yǎng)密度組山麻鴨血清中IL-1β、IL-8和TNF-α濃度以及空腸組織中IL-8、TNF-α、TLR-4、MyD88和NF-κB基因的mRNA表達(dá)水平均顯著升高,結(jié)果提示高飼養(yǎng)密度可能對(duì)鴨空腸組織造成一定的炎性損傷。而炎性因子水平升高的原因可能是在高飼養(yǎng)密度下環(huán)境中的LPS升高,進(jìn)而在鴨體內(nèi)累計(jì)引起TLRs/NF-κb等信號(hào)通路激活誘導(dǎo) IL-1β和IL-8等炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生[14]。腸道組織受損、腸黏膜通透性升高以及腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)失調(diào)導(dǎo)致的細(xì)菌移位也可能與機(jī)體炎性因子水平升高有關(guān)[27]。

腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定對(duì)于維持腸道屏障功能至關(guān)重要[28-29]。擬桿菌門和厚壁菌門作為本研究中山麻鴨腸道微生物屏障的主要優(yōu)勢(shì)菌,前者在降解非纖維性碳水化合物方面發(fā)揮了重要作用,而后者主要在降解纖維物質(zhì)方面發(fā)揮作用;在擬桿菌門中,普雷沃菌屬參與淀粉、多糖的分解和蛋白質(zhì)代謝[30-31],與理研菌屬在鴨腸道屏障完整性和腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著重要作用[32],兩者相對(duì)豐度的下降是山麻鴨腸道微生物居群失調(diào)的特征[33]。另外,梭桿菌門中主要的梭桿菌屬與腸道疾病密切關(guān)系[34]。本試驗(yàn)結(jié)果表明,在高飼養(yǎng)密度下山麻鴨腸道擬桿菌門和厚壁菌門的豐度降低,并且普雷沃菌屬和理研菌屬等有益菌豐度也顯著降低,而梭桿菌屬等有害菌群豐度的豐度顯著增加,這與以往研究結(jié)果相符[13]。也有研究表明,高飼養(yǎng)密度對(duì)山麻鴨腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)的影響有可能是因?yàn)閼?yīng)激或糞便增多導(dǎo)致的病原體增加、定植率升高所致[35,36]。

本試驗(yàn)通過研究不同飼養(yǎng)密度下育成期山麻鴨的空腸黏膜組織學(xué)變化、屏障結(jié)構(gòu)功能、消化酶活性、炎性因子表達(dá)水平及盲腸微生物菌群結(jié)構(gòu),探究飼養(yǎng)密度對(duì)山麻鴨腸道健康及功能的影響,可為山麻鴨的集約化養(yǎng)殖提供理論參考。

本試驗(yàn)結(jié)果表明,15只/m2試驗(yàn)組山麻鴨空腸黏膜組織結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著改變,空腸組織消化酶活性降低,腸道屏障結(jié)構(gòu)受損,并引起盲腸微生物菌群結(jié)構(gòu)紊亂,而5,10只/m22個(gè)試驗(yàn)組各項(xiàng)指標(biāo)無顯著變化。在本試驗(yàn)條件下,鴨舍內(nèi)適宜飼養(yǎng)密度推薦為5～10只/m2。