張定,孫悅,盧圻 ,吳雪銘

(1．右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科,廣西百色 533000;2．右江民族醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院,廣西百色 533000)

肝癌是世界上第六大常見惡性腫瘤,也是癌癥相關(guān)死亡的第三大原因,2020年全球新增病例約906 000例,死亡83萬例。肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是原發(fā)性肝癌中最常見的一種類型,占所有肝癌病例的75%～85%[1]。由于HCC缺乏早期篩查手段,大多數(shù)HCC病例確診時已是晚期,同時因為肝癌高復(fù)發(fā)率及耐藥等問題,即使患者接受正規(guī)治療,整體預(yù)后依舊很差。腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment,TME)是腫瘤細胞生存的細胞環(huán)境,由多種細胞成分和非細胞成分構(gòu)成,與腫瘤細胞的生長、增殖、免疫逃逸和耐藥有關(guān)。腫瘤干細胞(cancer stem cells,CSCs)是腫瘤中的一個小亞群,具有自我更新和無限增殖的特點。既往研究表明CSCs具有高度的致瘤性、轉(zhuǎn)移性、耐藥性,與腫瘤復(fù)發(fā)密切相關(guān),而這些與肝癌TME對肝癌干細胞(liver cancer stem cells,LCSCs)的特殊調(diào)節(jié)方式密不可分。近年隨著研究技術(shù)的進步,研究人員又發(fā)現(xiàn)了一些新的分子機制。因HCC是肝癌中最常見的類型,故本文將以HCC為代表總結(jié)近年來肝癌TME對LCSCs作用的研究進展,以期為肝癌治療提供新思路。

1 肝癌干細胞

CSCs首次在急性髓系白血病中發(fā)現(xiàn),隨后在實體性腫瘤如肺癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌、宮頸癌、肝癌等中均證實了其存在。2006年美國癌癥研究協(xié)會(AACR)明確提出了CSCs的定義,認為CSCs是腫瘤組織內(nèi)一群具有自我更新能力并能影響腫瘤細胞形成多種異質(zhì)譜系的細胞群,其具有高度的致瘤性和侵襲性,能夠驅(qū)動腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)[2]。雖然距CSCs定義的提出已有十余年,但CSCs的鑒定與篩選至今仍是一大難題。目前篩選CSCs的方法主要利用CSCs表面的特殊標志物,應(yīng)用熒光活化細胞或磁性活化細胞分選技術(shù)進行篩選,但這些方法自身都存在著一定局限性。對于LCSCs而言,目前比較成熟的標志物有EpCAM、CD133、CD90、CD44、CD24、CD13以及OV6等[3]。此外,關(guān)于LCSCs的起源目前也存在著多種看法,有學(xué)者認為LCSCs可能由成熟的肝細胞/膽管細胞通過突變及去分化過程轉(zhuǎn)化而來[4],也有學(xué)者認為LCSCs是正常肝干細胞成熟受阻后異常分化的結(jié)果[5],但近年有研究表明肝細胞譜系內(nèi)任何階段的細胞都具有成為LCSCs的潛力[6]。據(jù)此筆者猜測,LCSCs可能與其他CSCs類似[7],可來源于多種非CSCs,其本身處于CSCs和非CSCs之間相互轉(zhuǎn)化的動態(tài)平衡過程中。

2 腫瘤微環(huán)境與肝癌干細胞

近年研究表明TME的內(nèi)在成分可通過多種分子信號通路協(xié)助腫瘤細胞獲得CSC特性,提示TME對CSC的形成有著不可或缺的作用。TME是腫瘤細胞生存的直接環(huán)境,由細胞成分(如成纖維細胞、免疫細胞亞群、血管內(nèi)皮細胞)和非細胞成分(如細胞外基質(zhì)、細胞因子、生長因子及激素)構(gòu)成,具有低氧、低pH等特點。TME和腫瘤細胞之間存在著復(fù)雜的相互作用。一方面,適宜的微環(huán)境促進了腫瘤的生長、增殖、免疫逃逸以及耐藥等行為的發(fā)生;另一方面,腫瘤細胞可通過分泌多種細胞因子,促進成纖維細胞的募集、免疫細胞的遷移、基質(zhì)的重塑以及血管網(wǎng)絡(luò)的形成,構(gòu)成適合其生存的微環(huán)境。在TME中,CSCs生態(tài)位是CSCs生存的一種特殊的微環(huán)境,其通過細胞-細胞接觸和分泌因子的形式來調(diào)控CSCs[8]。目前,多項研究表明肝癌TME不同成分在促進LCSCs表型轉(zhuǎn)變及維持其干性等方面發(fā)揮著重要作用。

2.1 腫瘤相關(guān)成纖維細胞和肝癌干細胞腫瘤相關(guān)成纖維細胞(tumor-associated fibroblasts,CAFs)是腫瘤間質(zhì)中重要的組成成分,其分泌的生長因子、炎癥介質(zhì)以及胞外基質(zhì)蛋白對腫瘤的進展起著重要作用。αSMA在很多腫瘤中被認為是CAFs的細胞分子標志物,而活化的肝星狀細胞可增加αSMA的表達[9],據(jù)此有學(xué)者推測肝星狀細胞可能是CAFs的來源之一,但目前尚缺乏譜系追蹤分析的證據(jù)支持。隨著對CAFs研究的不斷深入,人們發(fā)現(xiàn)肝癌中CAFs在LCSCs的轉(zhuǎn)化、自我更新等方面存在著一定影響。LI等人[10]的實驗證實了CAFs可通過旁分泌的形式分泌肝細胞生長因子和IL-6,這兩種細胞因子將激活CD24+HCC細胞內(nèi)STAT3磷酸化,從而增強其干性。相繼地,LOH等人[11]的實驗證明肝癌中CAFs分泌的FSTL1可促進肝癌細胞形成干細胞樣特性。除了通過分泌細胞因子的方式影響LCSCs外,CAFs還可通過這種細胞-細胞直接接觸的方式,促進LCSCs中組蛋白去甲基化酶(LSD1)脫乙?；?進而激活Notch信號通路依賴的自我更新,促進腫瘤的生長[12]。

2.2 腫瘤相關(guān)巨噬細胞和腫瘤干細胞腫瘤組織中的腫瘤相關(guān)巨噬細胞(tumor-associated macrophages,TAMs)存在兩種來源,一是長期定居在組織周圍的巨噬細胞,二是因局部炎癥刺激從血管壁中游出的單核-巨噬細胞。在TME中,這些TAMs常處于一種激活的狀態(tài),其比例在不同類型腫瘤中也不盡相同。TAMs和LCSCs之間的作用是復(fù)雜且相互的。LCSCs產(chǎn)生的一些細胞因子可促進巨噬細胞的遷移與募集[13]。而TAMs也通過分泌一些信號分子作用于LCSCs,最終促進HCC細胞形成CSC特性,如miR-27a-3p、TNF、TGFβ1[14-16]。但TAMs除了經(jīng)典的促腫瘤作用外,在特定條件下也可表現(xiàn)出抗腫瘤的作用。CHAO等人[17]研究發(fā)現(xiàn)阻斷HCC中CD47與SIRPα的聯(lián)系可促使腫瘤組織中的巨噬細胞吞噬腫瘤細胞。因此,通過抗體阻斷CD47-SIRPα信號有希望成為靶向針對LCSCs的一種方法。

2.3 腫瘤浸潤淋巴細胞和肝癌干細胞腫瘤浸潤淋巴細胞(tumor-infifiltrating lymphocytes,TILs)是一類從血液中游出然后進入腫瘤組織內(nèi)的特殊淋巴細胞群,是構(gòu)成腫瘤微環(huán)境的重要細胞組成。其主要由T細胞、B細胞、自然殺傷細胞(natural killer cell,NK)、樹突狀細胞(dendritic cell,DC)、巨噬細胞(macrophage,Mφ)和髓系來源抑制細胞(myeloid-derived suppressor cells,MDSCs)等組成,以T細胞成分為主。其中,T細胞包括輔助性T細胞(T helper,Th)、細胞毒性T細胞(cytotoxic T cells,CTLs)和調(diào)節(jié)性T細胞(T-regulatory cells,Tregs)。近年的研究表明TILs與多種CSCs密切相關(guān)。膠質(zhì)母細胞瘤干細胞可分泌腱糖蛋白-C(tenascin-C)抑制T細胞的活性[18]。SOX2過表達的乳腺癌干細胞可通過NF-κB-CCL信號通路募集Treg細胞,從而促進腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移與耐藥[19]。而在肝癌中,LCSCs對TILs也存在著一定影響,在缺氧的條件下,LCSCs可分泌趨化因子CCL28促進肝癌TME招募Treg細胞[20]。此外有研究發(fā)現(xiàn)LCSCs也可表達調(diào)節(jié)因子SOX2,促進PD-L1轉(zhuǎn)錄[21],間接影響TILs發(fā)揮抗腫瘤作用。

2.4 腫瘤血管和肝癌干細胞腫瘤的生長、維持、進展離不開腫瘤血管的生成。目前已發(fā)現(xiàn)的腫瘤血管生成方式包括以下4種：出芽式再生、套疊式再生、血管擬態(tài)生成、血管內(nèi)皮祖細胞募集和血管新生。此外,目前研究已表明CSCs在一定條件下可轉(zhuǎn)化成血管內(nèi)皮細胞或血管平滑肌樣細胞[22-24],從而促進腫瘤血管生成。YANG等人[25]選擇3組HCC患者的肝切除標本,檢測14個與肝癌干/祖細胞(HSC/HPC)或腫瘤血管生成相關(guān)的標志物,發(fā)現(xiàn)肝癌干/祖細胞生物標志物高表達與HCC血管生成以及不良預(yù)后有關(guān)。間接說明LCSCs與腫瘤血管生成之間可能存在某些相互作用,這些相互作用對患者的預(yù)后具有不良影響。盡管目前關(guān)于腫瘤血管生成和LCSCs之間的研究少之又少,但肝癌作為一種高度血管化的腫瘤,腫瘤血管生成與其之間應(yīng)存在某些聯(lián)系,未來需要人們進行更進一步的探索。

2.5 細胞外基質(zhì)硬度和肝癌干細胞細胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)是由蛋白質(zhì)與糖類等生物大分子構(gòu)成的復(fù)雜三維非細胞的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),可為腫瘤提供結(jié)構(gòu)上的支持并促進癌細胞的一系列生物學(xué)行為?；|(zhì)硬度作為ECM的重要物理屬性,與HCC的發(fā)展密切相關(guān)。臨床資料表明,肝硬度增加是HCC進展的重要危險因素,超過80%的HCC患者都具有肝硬化或肝纖維化的背景。腫瘤細胞和CAFs可分泌基質(zhì)蛋白,并促進這些基質(zhì)蛋白聚集、收縮、交聯(lián),從而使HCC基質(zhì)硬度增加。增硬后的基質(zhì)將觸發(fā)機械-化學(xué)信號轉(zhuǎn)導(dǎo),將胞外機械信號(如基質(zhì)硬度)轉(zhuǎn)為胞內(nèi)化學(xué)信號,通過特定轉(zhuǎn)錄因子(如YAP/TAZ、NF-κB等)來促使癌癥的進展[26],但ECM硬度與LCSCs的關(guān)系目前尚不明確,TIAN等人[27]的研究小組通過使用可調(diào)節(jié)聚丙烯酰胺(PA)水凝膠模擬不同階段肝組織ECM的硬度來探究其對LCSCs的影響,結(jié)果表明在軟基質(zhì)處理后HCC細胞群表達更多的CSCs標記,并且自身具有更強的克隆增殖能力。但LI 等人[28]的研究表明,ECM硬度的增加將引起HCC細胞群中干細胞標志物表達比例升高,而這也許和YAP激活的下游信號通路有關(guān)。

2.6 低氧和肝癌干細胞由于肝癌生長迅速,肝癌TME常呈缺氧的狀態(tài),缺氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)是使肝癌細胞在缺氧中存活的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,由穩(wěn)定的HIF-1β亞基和氧敏感亞基HIF-1α組成。低氧會引起脯氨酰羥化酶失活,導(dǎo)致細胞內(nèi)羥基化過程減少,進而引起HIF-1α水解減少,使其在細胞核中積累,積累的HIF-1α與HIF-1β二聚化后可激活多種靶基因的轉(zhuǎn)錄,從而促進腫瘤血管生成、異常葡萄糖代謝、癌細胞增殖與侵襲等過程的發(fā)生。與此同時,多項研究表明HIF-1還可以通過引發(fā)一系列代謝反應(yīng)促進HCC耐藥[29]。一直以來,缺氧與癌細胞干性的形成密切相關(guān),近期的一些研究則更進一步證明了這一事實。XIAO等人[30]的研究表明缺氧將引起肝癌細胞中雄激素受體(AR)的低表達,進而可能通過AR/miR-520f-3p/SOX9信號通路促進肝癌細胞形成干細胞特性。CUI等人[31]證實了在缺氧條件下HCC的干性依賴于HIF-1α的調(diào)控,HIF-1α可直接調(diào)控SENP1的轉(zhuǎn)錄,與此同時,缺氧條件下的SENP1通過去SUMO化過程穩(wěn)定HIF-1α亞基的轉(zhuǎn)錄活性,二者之間存在正反饋。通過這種正反饋,放大了SENP1促HCC干性基因表達的作用,體外實驗和異種移植模型試驗證明,特異性下調(diào)SENP1將顯著抑制由缺氧導(dǎo)致的相關(guān)癌細胞干性的形成。LING等人[32]發(fā)現(xiàn),敲低泛素特異性蛋白酶22(USP22)基因可抑制CSC干性相關(guān)基因的表達。而在缺氧條件下,HIF-1α可促進USP22的轉(zhuǎn)錄,另一方面,USP22又可通過去泛素化穩(wěn)定HIF-1α。二者通過正反饋回路促進了缺氧誘導(dǎo)的HCC干性形成。

3 治療

傳統(tǒng)的肝癌藥物治療主要針對腫瘤組織內(nèi)快速增殖的腫瘤細胞,并未重視LCSCs這一細胞亞群,為腫瘤的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移留下了隱患。要想根除腫瘤就必須根除腫瘤內(nèi)的CSCs細胞亞群,而CSCs受TME調(diào)控,所以針對CSCs的治療可從TME入手,目前部分針對肝癌TME的靶向藥物已經(jīng)進入臨床,如抗PD-1/PD-L1以及抗VEGFR治療,其他類型藥物(如靶點為微環(huán)境內(nèi)的CAFs或TAMs)也在體內(nèi)、體外實驗中獲得成功。雖然目前直接針對LCSCs的藥物尚未投入臨床使用,但已有不少體外實驗證明這些藥物是安全且有效的。針對LCSCs的治療靶點可分為針對其表面標記分子和特定的調(diào)節(jié)信號通路兩大類。NGR是一種能與CD13特異性結(jié)合的多肽,NGR-LDP-AE是一種靶向CD13細胞的合成蛋白,由NGR肽和腫瘤抗生素力達霉素組成,對LCSCs和血管生成內(nèi)皮細胞均有效,該藥物有可能成為一種針對肝癌的雙靶向治療藥物[33]。TONG等人[34]發(fā)現(xiàn),ANXA3/JNK信號通路可以促進HCC的增殖以及LCSCs的自我更新和生長,通過單克隆抗體中和ANXA3不僅可以抑制HCC的增殖,同時可以清除CD133+的LCSCs亞群。但這些直接針對LCSCs的藥物都面臨著一個難題：正常肝干細胞和LCSCs具有許多相同的分子標記和信號通路,在治療LCSCs的過程中難免會影響到正常肝干細胞,從而可能抑制正常的肝再生導(dǎo)致肝功能衰竭,這是未來研究所必須解決的一個難題。

4 小結(jié)

TME不僅為腫瘤細胞提供了合適的生存環(huán)境,其內(nèi)在組分也在不同方面影響著腫瘤細胞,其中就包括CSCs這一重要亞群。既往的治療方式往往只針對腫瘤組織內(nèi)的腫瘤細胞,卻忽視了CSCs,結(jié)果必將影響腫瘤治療的療效。近年隨著TME和CSCs成為腫瘤領(lǐng)域的兩個熱點話題,大量相關(guān)的研究也接踵而至?，F(xiàn)有的研究結(jié)果已證明二者均可促進肝癌的發(fā)生與進展,且肝癌TME可通過多種途徑參與對LCSCs的調(diào)節(jié),在促進LCSCs轉(zhuǎn)化及維持LCSCs干性表型等方面發(fā)揮著重要作用。這些發(fā)現(xiàn)推動了針對肝癌TME和LCSC的靶向治療藥物的研發(fā)。目前部分針對TME的藥物(如抗PD-1/抗PD-L1)已投入臨床使用,而針對LCSC的藥物也在如期地進行臨床試驗。雖然在LCSCs領(lǐng)域仍有許多難題,但筆者相信隨著研究的不斷深入,這些難題終將得到解決。這將在幫助人類理解TME與CSC二者之間的作用的同時,為肝癌的治療提供新的思路,對改善絕大多數(shù)肝癌患者的不良預(yù)后有著不可或缺的作用。