李 進(jìn) 熊 彪 黃之偉 黃朝康

廣西欽州市正大司法鑒定中心，廣西 欽州 535000

短串聯(lián)重復(fù)序列（Short Tandem Repeat，STR）屬于人類遺傳中的重要標(biāo)記之一，在開展法醫(yī)學(xué)親子鑒定過程中其數(shù)據(jù)結(jié)果具有重要的作用，是判定兩者之間是否存在血緣關(guān)系的重要遺傳標(biāo)記之一［1］。同時(shí)，STR 相關(guān)數(shù)據(jù)對分析人體遺傳病具有重要的參考價(jià)值。在進(jìn)行親子鑒定過程中STR 基因座突變是一種普遍存在的現(xiàn)象。其中，STR 基因座突變中的突變主要包括一步突變和多步突變，一步突變只涉及一個(gè)基序的增加或者減少，在STR 基因座突變中發(fā)生一步突變的概率高達(dá)90%；多步突變主要是指發(fā)生多個(gè)序列突變，在STR 基因座突變中發(fā)生多步突變，最多四步突變的概率為10%［2］。當(dāng)STR 核心序列發(fā)生突變現(xiàn)象時(shí)，可能會導(dǎo)致法醫(yī)物證在進(jìn)行親子鑒定時(shí)出現(xiàn)誤判現(xiàn)象。因此，在開展親子鑒定時(shí)，要充分考慮有可能出現(xiàn)STR 基因座突變的現(xiàn)象。為有效避免因STR 基因座突變而導(dǎo)致鑒定結(jié)果不準(zhǔn)確，本文主要對二聯(lián)體親權(quán)鑒定中STR 異?，F(xiàn)象進(jìn)行分析。其中，研究報(bào)告如下：

一、資料與方法

（一）一般資料

本次研究采用回顧性分析的方式，在2019 年1 月至2023 年1 月期間，對2310 例STR 存在一步突變的基因開展聯(lián)體親權(quán)鑒定，其中有1749 例為父—子（女）二聯(lián)體鑒定，561 例為母—子（女）二聯(lián)體鑒定，在鑒定時(shí)對每個(gè)樣本采集末梢血，3μL。

（二）方法

1．儀器與試劑

在本次研究中采用的儀器分別為杭州博日科技有限公司生產(chǎn)的TC-96 擴(kuò)增儀以及美國ABI 3130XL 型基因分析儀。STR 基因座分型試劑為中德美聯(lián)生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的AGCU EX22熒光檢測試劑盒和AGCU EX21+1 熒光檢測試劑盒，江蘇蘇博生物醫(yī)學(xué)科技南京有限公司生產(chǎn)的YESU 21plex 熒光檢測試劑盒。

2．檢測方法

（1）對DNA 進(jìn)行提?。禾崛∷邪咐械难獦覦NA 樣本，提取方法為Chelex100 快速提取法；（2）PCR 擴(kuò)增：利用熒光復(fù)合擴(kuò)增技術(shù)，對AGCU EX22 的21 個(gè)STR 基因座進(jìn)行五色熒光標(biāo)記；（3）STR 基因座檢測：將PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物和去離子甲酰胺進(jìn)行一定比例的混勻，采用ABI 3130XL 型基因分析進(jìn)行毛細(xì)管電泳分型，并收集STR 基因座發(fā)出的熒光信號，采用GeneMapper ID-X 軟件進(jìn)行基因型分析。

3．STR 突變基因座判定方法

根據(jù)采用AGCU EX22 檢測試劑盒的檢測結(jié)果對不符合遺傳規(guī)律的樣本進(jìn)行篩選，同時(shí)對不符合遺傳規(guī)律的樣本采用YESU 21plex 試劑盒進(jìn)行復(fù)核，用AGCU EX21+1 試劑盒加測位點(diǎn)獲取其他基因座的遺傳信息。按照二聯(lián)體親權(quán)指數(shù)（PI）判斷親子關(guān)系，對不符合遺傳規(guī)律的基因座列為突變基因座。

4．統(tǒng)計(jì)突變率方法

采用直接計(jì)數(shù)法計(jì)算基因座突變率。

（三）統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用國標(biāo)《親權(quán)鑒定技術(shù)規(guī)范》（GB/T 37223-2018）以及公共安全行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《法庭科學(xué)DNA 實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)范》（GA/T 383-2014），結(jié)合我國漢族人群STR 基因座的等位基因頻率進(jìn)行對比研究［3］。

二、結(jié)果

（一）STR 突變基因座突變率

在本次研究分析的2310 例二聯(lián)體親權(quán)鑒中，有34 例存在STR 基因座異常現(xiàn)象，其中，在這34例中21 個(gè)STR 突變基因座突變具體情況如表1所示：

表1 21 個(gè)STR 突變基因座突變率

（二）在其他檢測方法復(fù)核下排除案例STR突變基因座信息

在本次研究中，通過對34 例STR 基因座異?，F(xiàn)象采用YESU 21plex 試劑盒進(jìn)行復(fù)核，用AGCU EX21+1 試劑盒進(jìn)行進(jìn)一步的二聯(lián)體鑒定，能夠確認(rèn)其中有30 例存在STR 一步突變，不能排除親子關(guān)系，4 例能排除親子關(guān)系。其中，排除案例STR 突變基因座信息如表2 所示：

表2 在其他檢測方法復(fù)核下排除案例STR 突變基因座信息

三、討論

短串聯(lián)重復(fù)序列具有多態(tài)性，能夠較快對個(gè)體進(jìn)行識別，且檢測方法具備簡便、快捷等特點(diǎn)，在目前已經(jīng)成為親子鑒定中最常采用的方法。在親子鑒定中常見的方法包括三聯(lián)體鑒定和二聯(lián)體鑒定，三聯(lián)體鑒定主要是對父—母—子（女）進(jìn)行鑒定，二聯(lián)體鑒定主要是通過父（母）—子（女）進(jìn)行鑒定，其中在二聯(lián)體鑒定中由于缺少其中一方親代遺傳的相關(guān)信息，導(dǎo)致在鑒定過程中可能會發(fā)生STR 基因座突變現(xiàn)象，從而導(dǎo)致親子鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性受到一定的影響［4］。近年來，親子鑒定的案例呈現(xiàn)出逐年遞增的情況，在開展親子鑒定工作過程中采用二聯(lián)體親子鑒定的比例越來越高。由于在進(jìn)行二聯(lián)體鑒定時(shí)只需要其中一方親屬參與鑒定，導(dǎo)致在鑒定過程中無法獲取另一方的遺傳信息，從而導(dǎo)致STR 基因座檢測的效率降低，會出現(xiàn)一定的異?，F(xiàn)象。目前在開展二聯(lián)體鑒定時(shí)，主要采用21 個(gè)STR 基因座進(jìn)行檢測，但是在檢測過程中會存在一定的風(fēng)險(xiǎn)現(xiàn)象，即可能發(fā)生漏排非父風(fēng)險(xiǎn)，因此為了能夠有效提高二聯(lián)體鑒定的準(zhǔn)確性，在開展二聯(lián)體鑒定過程中就要增加具有高多態(tài)性、穩(wěn)定性良好的遺傳標(biāo)記進(jìn)行檢測［5］。

所謂的突變主要是建立在認(rèn)定親權(quán)關(guān)系假設(shè)成立的基礎(chǔ)上，一般而言STR 基因座突變與遺傳多態(tài)性有一定聯(lián)系，STR 基因座發(fā)生突變主要是由于復(fù)制滑動(dòng)。當(dāng)出現(xiàn)復(fù)制滑動(dòng)現(xiàn)象時(shí)，STR 基因座等位基因重復(fù)單位會出現(xiàn)增加或者減少的情況，一般情況下序列結(jié)構(gòu)比較均一的基因座更加容易出現(xiàn)基因突變現(xiàn)象。同時(shí)，在等位基因中，當(dāng)含有不完全序列的基因座時(shí)發(fā)生突變的概率反而比較低，反觀擴(kuò)增片段較為明顯的STR 基因座反而更加容易出現(xiàn)突變情況，出現(xiàn)這種情況的原因主要是重復(fù)單位較多的基因座長度更長，導(dǎo)致多態(tài)性程度也更多，從而會增加STR 基因座突變的概率。此外，STR 基因座等位基因突變和性別有一定聯(lián)系，源于父親的基因突變比源于母親的基因突變更加明顯，其原因在于基因突變率和細(xì)胞分裂次數(shù)有關(guān)，男性的精原細(xì)胞會經(jīng)過多次分離才會形成精子，分裂次數(shù)大于女性卵原細(xì)胞分裂，導(dǎo)致DNA 復(fù)制時(shí)出現(xiàn)滑動(dòng)錯(cuò)配情況就更多，使得STR 基因座突變概率增加。

本次研究中，在21 個(gè)STR 基因座基礎(chǔ)上采用多種STR 基因座復(fù)合擴(kuò)增體系進(jìn)行檢測，在一步突變中，STR 基因座不符合相關(guān)遺傳規(guī)律的案例進(jìn)行分析，采用多種STR 基因座復(fù)合擴(kuò)增體系能夠有效提高親子鑒定的效率。在檢測過程中，當(dāng)確定一個(gè)STR 基因座出現(xiàn)突變現(xiàn)象時(shí)，就要采用不同的基因檢測系統(tǒng)進(jìn)行復(fù)核，采用不同引物基因座進(jìn)行檢測，能夠盡可能避免因?yàn)橐锝Y(jié)合區(qū)變異而出現(xiàn)的等位基因假突變現(xiàn)象，也就是學(xué)術(shù)中所指出的等位基因丟失。在采用AGCU EX22 試劑盒檢測時(shí)，可能會存在一定的風(fēng)險(xiǎn)現(xiàn)象，發(fā)生漏排非父風(fēng)險(xiǎn)，因此在檢測過程中引入YESU 21plex 試劑盒、AGCU EX21+1 試劑盒系統(tǒng)進(jìn)行二聯(lián)體鑒定時(shí)，能夠有效確保檢測的準(zhǔn)確性。在采用YESU 21plex 試劑盒檢測過程中，能夠起到與AGCU EX22 試劑盒相同的作用，有效對AGCU EX22 試劑盒結(jié)果進(jìn)行復(fù)核，從而排除在檢測過程中發(fā)生STR 基因座異?，F(xiàn)象。

在本次研究中，分析STR 基因座的突變率時(shí)通過對2310 例進(jìn)行二聯(lián)體親權(quán)鑒定，采用常規(guī)的AGCU EX22 試劑盒檢測時(shí)，共有34 例存在STR基因座異?，F(xiàn)象，突變率在0．04%～0．22%之間，在研究中發(fā)現(xiàn)，PentaD、D21S11 突變率較高，一般而言在親權(quán)鑒定中，計(jì)算遺傳標(biāo)記STR 的總突變率時(shí)一般不能高于0．2%，而在本次研究中PentaE、FGA 的基因座突變率較高，因此在開展法醫(yī)物證鑒定過程中要注意相關(guān)基因的突變問題，為避免基因突變率較高導(dǎo)致法醫(yī)物證鑒定結(jié)果不準(zhǔn)確等，要采用其他輔助方式進(jìn)行鑒定，從而有效降低誤判風(fēng)險(xiǎn)。在本次研究中，雖然開展了多個(gè)基因座檢測，但是基因座之間存在一定的連鎖不平衡情況，在開展研究時(shí)群體遺傳學(xué)數(shù)據(jù)有限，所檢測的結(jié)果只能當(dāng)作研究參考。

綜上所述，在進(jìn)行親權(quán)鑒定時(shí)，在檢測過程中，要注意發(fā)生STR 基因座異常的情況。通過檢測遺傳標(biāo)記能夠有效判斷認(rèn)定親權(quán)關(guān)系，但是也要注意發(fā)生STR 基因座突變現(xiàn)象。通過多種PCR試劑盒檢測，在AGCU EX22 試劑盒檢測基礎(chǔ)上開展YESU 21plex 試劑盒、AGCU EX21+1 試劑盒檢測，能夠相互證實(shí)突變結(jié)果，必要時(shí)，需要補(bǔ)充Y-STR 或X-STR 進(jìn)行分析檢測，能夠有效對親權(quán)關(guān)系進(jìn)行綜合判斷，從而有效排除各種干擾因素，避免發(fā)生錯(cuò)誤判斷的現(xiàn)象，提高鑒定效率，得到科學(xué)、全面、可靠的鑒定結(jié)果。因此，開展二聯(lián)體親權(quán)鑒定中STR 異?，F(xiàn)象分析在法醫(yī)物證工作中具有推廣和應(yīng)用意義。