周鑫洋, 饒 盈, 夏國(guó)華, 馬丹丹, 陳濤梅, 姚熠涵

(1. 浙江農(nóng)林大學(xué)林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院 浙江省森林芳香植物康養(yǎng)功能研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 浙江 杭州 311300; 2. 浙江省杭州市臨安區(qū)天目山林場(chǎng), 浙江 杭州 311311; 3. 浙江農(nóng)林大學(xué)暨陽(yáng)學(xué)院, 浙江 紹興 311800)

堇葉紫金?！睞rdisiaviolacea(T. Suzuki) W. Z. Fang et K. Yao〕隸屬于報(bào)春花科(Primulaceae)紫金牛屬(ArdisiaSw.),僅分布于浙江、臺(tái)灣和安徽[1],其種群呈島嶼狀間斷分布,是中國(guó)特有的瀕危植物[2]。因果實(shí)紅艷、掛果時(shí)間長(zhǎng),堇葉紫金牛具有很高的觀賞和應(yīng)用價(jià)值。此外,堇葉紫金牛對(duì)研究中國(guó)大陸和臺(tái)灣植物區(qū)系演化、紫金牛屬的分組及系統(tǒng)發(fā)育具有重要的科研價(jià)值;該種還是紫金牛屬植物栽培育種及品種改良的野生基因庫(kù),對(duì)維持紫金牛屬植物的遺傳多樣性具有重要意義。但由于生境片斷化以及自身的生理生態(tài)學(xué)特性,堇葉紫金牛野生居群更新受到嚴(yán)重干擾,居群數(shù)量急劇減少,因此,對(duì)其開展保護(hù)生物學(xué)研究已迫在眉睫。目前,對(duì)堇葉紫金牛瀕危機(jī)制的研究主要集中在種群結(jié)構(gòu)特征[3-5]、繁殖技術(shù)[6-8]以及生理生態(tài)[9-10]方面,而關(guān)于遺傳結(jié)構(gòu)方面的研究尚未見報(bào)道。

基因分型測(cè)序(genotyping by sequencing,GBS)技術(shù)是一種簡(jiǎn)化基因組測(cè)序技術(shù)。雖然GBS技術(shù)不能深度覆蓋全基因組,但其具有測(cè)序通量高、成本低等優(yōu)點(diǎn)[11-12]。GBS技術(shù)自2011年在玉米(ZeamaysLinn.)和大麥(HordeumvulgareLinn.)研究中首次應(yīng)用以來[13],已經(jīng)廣泛應(yīng)用于資源分類、遺傳分析及基因定位等領(lǐng)域,在不實(shí)野燕麥(AvenasterilisLinn.)[14]、茶〔Camelliasinensis(Linn.) O. Ktze.〕[15]、稻(OryzasativaLinn.)[16]、硬粒小麥〔Triticumturgidumsubsp.durum(Desfontaines) Husnot〕[17]等植物中得到了應(yīng)用。GBS技術(shù)結(jié)合全基因組關(guān)聯(lián)分析,有助于發(fā)現(xiàn)植物的新性狀及其相關(guān)變異來源,對(duì)后續(xù)優(yōu)良品種的選育和改良具有指導(dǎo)意義[18]。

遺傳多樣性高低對(duì)瀕危植物能否長(zhǎng)期存活具有重要影響[19],因此對(duì)瀕危植物遺傳多樣性的研究有助于了解物種遺傳背景,揭示物種瀕危機(jī)制。為此,本研究采用GBS技術(shù)對(duì)堇葉紫金牛13個(gè)野生居群77份樣本進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)位點(diǎn)挖掘,在此基礎(chǔ)上,對(duì)各居群的遺傳多樣性、系統(tǒng)發(fā)育樹、親緣關(guān)系等進(jìn)行了分析,以期為堇葉紫金牛的物種保護(hù)和利用及種質(zhì)資源保存提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

根據(jù)堇葉紫金牛野生資源的分布狀況和居群大小,以相鄰植株間隔超過20 m作為劃分居群的依據(jù),在堇葉紫金牛全分布區(qū)內(nèi)13個(gè)野生居群中共采集77份樣本,每個(gè)居群選取健康的成年植株,每株采集2～3枚健康幼嫩的葉片,液氮速凍后于-80 ℃保存、備用。各居群基本信息見表1。

表1 堇葉紫金牛13個(gè)居群的基本信息Table 1 Basic information of 13 populations of Ardisia violacea (T. Suzuki) W. Z. Fang et K. Yao

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取與GBS文庫(kù)構(gòu)建 采用Axyprep DNA提取試劑盒〔康寧生命科學(xué)(吳江)有限公司〕提取堇葉紫金牛DNA,采用質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)2%的瓊脂糖凝膠電泳分析DNA完整性,采用Qubit 2.0熒光定量?jī)x(美國(guó)賽默飛世爾科技公司)精確定量DNA濃度;用RsaⅠ和HaeⅢ將檢驗(yàn)合格的DNA樣品酶切消化處理成小片段,小片段經(jīng)過末端修復(fù)、加A尾、加測(cè)序接頭、純化、PCR擴(kuò)增等過程完成GBS文庫(kù)制備。根據(jù)預(yù)設(shè)方案對(duì)文庫(kù)進(jìn)行質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)2%的瓊脂糖凝膠電泳后割膠純化,選擇目標(biāo)區(qū)間內(nèi)相應(yīng)的文庫(kù)進(jìn)入后續(xù)測(cè)序。文庫(kù)質(zhì)檢合格后上機(jī)進(jìn)行高通量測(cè)序,測(cè)序平臺(tái)為Illumina Nova 6000,測(cè)序模式為PE150。

1.2.2 基因組SNP位點(diǎn)挖掘 采用FastP 0.20.0軟件對(duì)測(cè)序得到的所有read進(jìn)行質(zhì)控,去除接頭,去除含有無法確定堿基信息的比例大于5%的read,去除低質(zhì)量read(質(zhì)量值Q小于等于10的堿基占比在20%以上),統(tǒng)計(jì)原始測(cè)序量、有效測(cè)序量、錯(cuò)誤率在1%以下的堿基占比(Q20)、錯(cuò)誤率在0.1%以下的堿基占比(Q30)、GC含量,并進(jìn)行綜合評(píng)價(jià),過濾后獲得clean data。之后對(duì)所有樣本的read進(jìn)行聚類,將聚在一起的read作為1個(gè)標(biāo)簽,并生成一致性序列。采用BWA 0.7.13軟件進(jìn)行序列一致性比對(duì),并使用GATK 3.8.1軟件和Samtools軟件共同進(jìn)行SNP檢測(cè)。按照最小等位基因頻率大于0.05、數(shù)據(jù)完整度大于60%(即不超過40%個(gè)體基因型缺失)的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)檢測(cè)到的SNP進(jìn)行過濾。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用R語(yǔ)言擴(kuò)展包Genepop v1.0.5計(jì)算觀測(cè)雜合度、多態(tài)信息含量、居群間的遺傳距離和遺傳分化系數(shù);采用vcftools v0.1.14軟件計(jì)算核苷酸多樣性指數(shù)、Tajima’s D值、Shannon’s多樣性指數(shù);采用MEGA 5.0軟件的Neighbor-joining法基于p-distance模型構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,自展重復(fù)抽樣次數(shù)為1 000次;采用Admixture 1.3.0軟件分析群體結(jié)構(gòu);采用EIENSOFT 6.0.1軟件進(jìn)行主成分分析;采用SPAeDi 1.4軟件進(jìn)行親緣關(guān)系分析;采用TreeMix v1.01軟件進(jìn)行基因流分析。

2 結(jié)果和分析

2.1 SNP位點(diǎn)挖掘

分析結(jié)果顯示:77份堇葉紫金牛樣本共獲得421.37 G有效高質(zhì)量測(cè)序數(shù)據(jù),平均每份樣本獲得5.47 G有效數(shù)據(jù),有效數(shù)據(jù)率98.9%。Q20值為96.0%～98.1%,均值為97.5%,Q30值為89.6%～94.0%,均值為92.7%;GC含量為40.5%～46.0%,均值為43.1%,表明測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量較高,可以用于后續(xù)分析。77份樣本中獲得高質(zhì)量序列最多的是浙江省杭州市臨安區(qū)順溪塢的1個(gè)居群(HLS2)的第1份樣本,有54 816 017條序列,最少的是安徽省黃山市祁門縣牯牛降(HQG)居群的第3份樣本,有21 527 449條序列。平均每份樣本獲得高質(zhì)量序列36 557 933條,平均比對(duì)率為99.1%。

對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,共獲得有效SNP位點(diǎn)246 307個(gè),每份樣本檢測(cè)到SNP位點(diǎn)1 154～3 789個(gè)(均值為3 199)。浙江省杭州市臨安區(qū)順溪塢的另1個(gè)居群(HLS1)的平均SNP位點(diǎn)數(shù)最多,有3 652個(gè),浙江省舟山市定海區(qū)蔡家岙(ZDC)居群的平均SNP位點(diǎn)數(shù)最少,僅有2 138個(gè)。77份樣本中有效SNP位點(diǎn)的雜合率為11.7%～37.0%,均值為26.6%;有效SNP位點(diǎn)的純合率為63.0%～88.3%,均值為73.5%。

2.2 遺傳多樣性分析

對(duì)篩選獲得的SNP位點(diǎn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,評(píng)價(jià)不同居群的遺傳多樣性,結(jié)果見表2。結(jié)果顯示:13個(gè)居群的觀測(cè)雜合度為0.156 9～0.428 9,均值為0.353 7,表明堇葉紫金?；蛘w穩(wěn)定性較差;13個(gè)居群的多態(tài)信息含量為0.078 5～0.324 4,均值為0.263 4;核苷酸多樣性指數(shù)為0.000 2～0.000 7,均值為0.000 3,表明堇葉紫金牛的核苷酸多樣性較低;13個(gè)居群的Tajima’s D值為0.224 7～1.093 6,均大于0,表明堇葉紫金牛各居群受平衡選擇程度較高;13個(gè)居群的Shannon’s多樣性指數(shù)為0.217 5～0.664 9,均值為0.549 4,其中安徽省黃山市祁門縣牯牛降(HQG)、浙江省舟山市定海區(qū)蔡家岙(ZDC)和浙江省寧波市象山縣屠家園村(NXT)居群的Shannon’s多樣性指數(shù)較大,表明這3個(gè)居群的遺傳多樣性相對(duì)較高?？傮w來看,堇葉紫金牛遺傳多樣性水平偏低,各居群間遺傳多樣性存在一定差異。

2.3 系統(tǒng)發(fā)育樹分析

利用鑒定到的高質(zhì)量SNP對(duì)堇葉紫金牛13個(gè)居群77份樣本進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹分析,結(jié)果見圖1。結(jié)果顯示:77份樣本可分為6組,Ⅰ組包含浙江省杭州市臨安區(qū)順溪塢的2個(gè)居群(HLS1、HLS2)和浙江省杭州市西湖區(qū)云棲竹徑的2個(gè)居群(HXY1、HXY2)的所有樣本;Ⅱ組包含浙江省舟山市定海區(qū)蔡家岙(ZDC)居群的第1和第4份樣本及浙江省金華市永康市方山口村(JYF)居群的所有樣本;Ⅲ組包含安徽省黃山市祁門縣牯牛降(HQG)居群的所有樣本;Ⅳ組包含浙江省建德市壽昌林場(chǎng)(JSL)居群、浙江省杭州市淳安縣向陽(yáng)村(HCX)居群和浙江省寧波市寧?？h歸云洞(NNG)居群的所有樣本;Ⅴ組包含浙江省舟山市定海區(qū)毛陳周(ZDM)居群的所有樣本;Ⅵ組包含浙江省寧波市象山縣屠家園村(NXT)居群和臺(tái)灣省臺(tái)北市北投區(qū)陽(yáng)明山(TBY)居群的所有樣本及ZDC居群的第2、第3、第5份樣本。其中HCX、JSL、NNG、HQG、ZDC和TBY居群內(nèi)樣本間的親緣關(guān)系較近,均能聚在一起;HLS1、HLS2居群間的個(gè)別樣本有嵌套,但作為一個(gè)整體,這2個(gè)居群的樣本也能聚在一起。ZDC居群5份樣本中的3份與NXT和TBY居群的樣本聚在一起,而ZDC居群的另2份樣本與JYF居群的樣本聚在一起,說明ZDC居群內(nèi)遺傳分化比較大。

HLS: 浙江省杭州市臨安區(qū)順溪塢Shunxiwu, Lin’an District, Hangzhou City, Zhejiang Province; HXY: 浙江省杭州市西湖區(qū)云棲竹徑Bamboo-lined path at Yunqi, Xihu District, Hangzhou City, Zhejiang Province; JSL: 浙江省建德市壽昌林場(chǎng)綠荷塘林區(qū)Lühetang Forest District, Shouchang Forest Farm, Jiande City, Zhejiang Province; HCX: 浙江省杭州市淳安縣向陽(yáng)村Xiangyang Village, Chun’an County, Hangzhou City, Zhejiang Province; HQG: 安徽省黃山市祁門縣牯牛降Guniujiang, Qimen County, Huangshan City, Anhui Province; JYF: 浙江省金華市永康市方山口村Fangshankou Village, Yongkang City, Jinhua City, Zhejiang Province; NNG: 浙江省寧波市寧?？h歸云洞Guiyun Cave, Ninghai County, Ningbo City, Zhejiang Province; NXT: 浙江省寧波市象山縣屠家園村Tujiayuan Village, Xiangshan County, Ningbo City, Zhejiang Province; ZDC: 浙江省舟山市定海區(qū)蔡家岙Caijia’ao, Dinghai District, Zhoushan City, Zhejiang Province; ZDM: 浙江省舟山市定海區(qū)毛陳周Maochenzhou, Dinghai District, Zhoushan City, Zhejiang Province; TBY: 臺(tái)灣省臺(tái)北市北投區(qū)陽(yáng)明山Y(jié)angmingshan, Beitou District, Taipei City, Taiwan Province. 括號(hào)中數(shù)字為樣本編號(hào)The numbers in brackets are sample numbers.圖1 堇葉紫金牛13個(gè)居群77份樣本的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.. 1 Phylogenetic tree of 77 samples from 13 populations of Ardisia violacea (T. Suzuki) W. Z. Fang et K. Yao

2.4 主成分分析

基于SNP的主成分分析結(jié)果獲得堇葉紫金牛13個(gè)居群77份樣本的聚類情況,結(jié)果見圖2。結(jié)果顯示:根據(jù)PC1、PC2和PC3這3個(gè)主成分,可以將77份堇葉紫金牛樣本分為6組,浙江省杭州市臨安區(qū)順溪塢2個(gè)居群(HLS1、HLS2)和浙江省杭州市西湖區(qū)云棲竹徑2個(gè)居群(HXY1、HXY2)的所有樣本為一組;安徽省黃山市祁門縣牯牛降(HQG)居群的所有樣本和浙江省舟山市定海區(qū)蔡家岙(ZDC)居群的2份樣本為一組;浙江省金華市永康市方山口村(JYF)、浙江省建德市壽昌林場(chǎng)綠荷塘林區(qū)(JSL)、浙江省寧波市象山縣屠家園村(NXT)居群的樣本各單獨(dú)為一組;浙江省寧波市寧海縣歸云洞(NNG)、浙江省杭州市淳安縣向陽(yáng)村(HCX)、浙江省舟山市定海區(qū)毛陳周(ZDM)和臺(tái)灣省臺(tái)北市北投區(qū)陽(yáng)明山(TBY)居群的所有樣本及ZDC居群的3份樣本為一組。這與系統(tǒng)發(fā)育樹分析結(jié)果相近,但也存在一定的差異。

: HQG; : HCX; : HXY1; : HXY2; : JSL; : HLS1; : HLS2; : NNG; : TBY; : NXT; : JYF; : ZDC; : ZDM.HLS: 浙江省杭州市臨安區(qū)順溪塢Shunxiwu, Lin’an District, Hangzhou City, Zhejiang Province; HXY: 浙江省杭州市西湖區(qū)云棲竹徑Bamboo-lined path at Yunqi, Xihu District, Hangzhou City, Zhejiang Province; JSL: 浙江省建德市壽昌林場(chǎng)綠荷塘林區(qū)Lühetang Forest District, Shouchang Forest Farm, Jiande City, Zhejiang Province; HCX: 浙江省杭州市淳安縣向陽(yáng)村Xiangyang Village, Chun’an County, Hangzhou City, Zhejiang Province; HQG: 安徽省黃山市祁門縣牯牛降Guniujiang, Qimen County, Huangshan City, Anhui Province; JYF: 浙江省金華市永康市方山口村Fangshankou Village, Yongkang City, Jinhua City, Zhejiang Province; NNG: 浙江省寧波市寧?？h歸云洞Guiyun Cave, Ninghai County, Ningbo City, Zhejiang Province; NXT: 浙江省寧波市象山縣屠家園村Tujiayuan Village, Xiangshan County, Ningbo City, Zhejiang Province; ZDC: 浙江省舟山市定海區(qū)蔡家岙Caijia’ao, Dinghai District, Zhoushan City, Zhejiang Province; ZDM: 浙江省舟山市定海區(qū)毛陳周Maochenzhou, Dinghai District, Zhoushan City, Zhejiang Province; TBY: 臺(tái)灣省臺(tái)北市北投區(qū)陽(yáng)明山Y(jié)angmingshan, Beitou District, Taipei City, Taiwan Province.圖2 基于SNP主成分分析結(jié)果的堇葉紫金牛13個(gè)居群77份樣本的聚類Fig.. 2 Clustering of 77 samples from 13 populations of Ardisia violacea (T. Suzuki) W. Z. Fang et K. Yao based on SNP principal component analysis result

2.5 遺傳結(jié)構(gòu)分析

遺傳結(jié)構(gòu)分析結(jié)果(圖3)顯示:K=6時(shí),交叉驗(yàn)證誤差最小,且此時(shí)77份樣本的遺傳結(jié)構(gòu)聚類清晰,表明堇葉紫金牛13個(gè)居群77份樣本的最優(yōu)分組數(shù)為6。

HLS: 浙江省杭州市臨安區(qū)順溪塢Shunxiwu, Lin’an District, Hangzhou City, Zhejiang Province; HXY: 浙江省杭州市西湖區(qū)云棲竹徑Bamboo-lined path at Yunqi, Xihu District, Hangzhou City, Zhejiang Province; JSL: 浙江省建德市壽昌林場(chǎng)綠荷塘林區(qū)Lühetang Forest District, Shouchang Forest Farm, Jiande City, Zhejiang Province; HCX: 浙江省杭州市淳安縣向陽(yáng)村Xiangyang Village, Chun’an County, Hangzhou City, Zhejiang Province; HQG: 安徽省黃山市祁門縣牯牛降Guniujiang, Qimen County, Huangshan City, Anhui Province; JYF: 浙江省金華市永康市方山口村Fangshankou Village, Yongkang City, Jinhua City, Zhejiang Province; NNG: 浙江省寧波市寧?？h歸云洞Guiyun Cave, Ninghai County, Ningbo City, Zhejiang Province; NXT: 浙江省寧波市象山縣屠家園村Tujiayuan Village, Xiangshan County, Ningbo City, Zhejiang Province; ZDC: 浙江省舟山市定海區(qū)蔡家岙Caijia’ao, Dinghai District, Zhoushan City, Zhejiang Province; ZDM: 浙江省舟山市定海區(qū)毛陳周Maochenzhou, Dinghai District, Zhoushan City, Zhejiang Province; TBY: 臺(tái)灣省臺(tái)北市北投區(qū)陽(yáng)明山Y(jié)angmingshan, Beitou District, Taipei City, Taiwan Province. 括號(hào)中數(shù)字為樣本編號(hào)The numbers in brackets are sample numbers.圖3 堇葉紫金牛13個(gè)居群77份樣本的分組(A)及K=6時(shí)的遺傳結(jié)構(gòu)分析(B)Fig.. 3 Cluster(A) and genetic structure analysis when K=6 (B) of 77 samples from 13 populations of Ardisia violacea (T. Suzuki) W. Z. Fang et K.

2.6 親緣關(guān)系分析

堇葉紫金牛77份樣本間的親緣關(guān)系分析結(jié)果見圖4。顏色越紅代表樣本間的親緣關(guān)系越近,同一居群內(nèi)多個(gè)樣本間熱圖呈紅色說明這些樣本可能構(gòu)成了一個(gè)親緣關(guān)系緊密的家系群體;反之,顏色越藍(lán)說明樣本間的親緣關(guān)系越遠(yuǎn)。結(jié)果顯示:堇葉紫金牛居群內(nèi)個(gè)體間的親緣關(guān)系較近。其中安徽省黃山市祁門縣牯牛降(HQG)居群內(nèi)樣本間的親緣關(guān)系最近,浙江省寧波市象山縣屠家園村(NXT)、臺(tái)灣省臺(tái)北市北投區(qū)陽(yáng)明山(TBY)、浙江省建德市壽昌林場(chǎng)綠荷塘林區(qū)(JSL)、浙江省舟山市定海區(qū)毛陳周(ZDM)居群內(nèi)樣本間的親緣關(guān)系較近,而浙江省杭州市西湖區(qū)云棲竹徑2個(gè)居群(HXY1、HXY2)和浙江省杭州市臨安區(qū)順溪塢2個(gè)居群(HLS1、HLS2)居群內(nèi)樣本間的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。居群間的親緣關(guān)系與地理距離有一定的相關(guān)性,HLS1、HLS2、HXY1、HXY2居群間的親緣關(guān)系較近,但這4個(gè)居群與地理位置鄰近的HQG、浙江省杭州市淳安縣向陽(yáng)村(HCX)、JSL居群的親緣關(guān)系均較遠(yuǎn)。NXT、TBY和浙江省舟山市定海區(qū)蔡家岙(ZDC)居群間親緣關(guān)系較近;HCX居群與TBY、JYF和ZDC居群間親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

HLS: 浙江省杭州市臨安區(qū)順溪塢Shunxiwu, Lin’an District, Hangzhou City, Zhejiang Province; HXY: 浙江省杭州市西湖區(qū)云棲竹徑Bamboo-lined path at Yunqi, Xihu District, Hangzhou City, Zhejiang Province; JSL: 浙江省建德市壽昌林場(chǎng)綠荷塘林區(qū)Lühetang Forest District, Shouchang Forest Farm, Jiande City, Zhejiang Province; HCX: 浙江省杭州市淳安縣向陽(yáng)村Xiangyang Village, Chun’an County, Hangzhou City, Zhejiang Province; HQG: 安徽省黃山市祁門縣牯牛降Guniujiang, Qimen County, Huangshan City, Anhui Province; JYF: 浙江省金華市永康市方山口村Fangshankou Village, Yongkang City, Jinhua City, Zhejiang Province; NNG: 浙江省寧波市寧海縣歸云洞Guiyun Cave, Ninghai County, Ningbo City, Zhejiang Province; NXT: 浙江省寧波市象山縣屠家園村Tujiayuan Village, Xiangshan County, Ningbo City, Zhejiang Province; ZDC: 浙江省舟山市定海區(qū)蔡家岙Caijia’ao, Dinghai District, Zhoushan City, Zhejiang Province; ZDM: 浙江省舟山市定海區(qū)毛陳周Maochenzhou, Dinghai District, Zhoushan City, Zhejiang Province; TBY: 臺(tái)灣省臺(tái)北市北投區(qū)陽(yáng)明山Y(jié)angmingshan, Beitou District, Taipei City, Taiwan Province. 括號(hào)中數(shù)字為樣本編號(hào)The numbers in brackets are sample numbers.圖4 堇葉紫金牛13個(gè)居群77份樣本間的親緣關(guān)系熱圖Fig.. 4 Heat map of genetic relationship between 77 samples from 13 populations of Ardisia violacea (T. Suzuki) W. Z. Fang et K. Yao

2.7 遺傳分化和基因流分析

結(jié)果(表3)顯示:堇葉紫金牛13個(gè)居群間的遺傳距離為0.059 0～0.393 8,遺傳分化系數(shù)為0.000 0～0.423 0,且大部分(80.8%)居群間的遺傳分化系數(shù)大于0.250 0,表明大部分居群間存在較高的遺傳分化。浙江省杭州市西湖區(qū)云棲竹徑2個(gè)居群(HXY1和HXY2)間及浙江省杭州市臨安區(qū)順溪塢2個(gè)居群(HLS1和HLS2)間的遺傳分化系數(shù)較小,遺傳距離較近,可能是由于這2個(gè)居群間的地理距離較小;而HXY1和HXY2居群與地理距離較遠(yuǎn)的臺(tái)灣省臺(tái)北市北投區(qū)陽(yáng)明山(TBY)居群和安徽省黃山市祁門縣牯牛降(HQG)居群間的遺傳分化系數(shù)均較大(均大于0.400 0),遺傳距離也較遠(yuǎn)。說明堇葉紫金牛居群間遺傳分化系數(shù)與地理距離存在一定的相關(guān)性。

表3 堇葉紫金牛居群間的遺傳距離和遺傳分化系數(shù)1)Table 3 Genetic distance and genetic differentiation coefficient between populations of Ardisia violacea (T. Suzuki) W. Z. Fang et K. Yao1)

基因流分析結(jié)果(圖5)表明:浙江省寧波市象山縣屠家園村(NXT)、浙江省舟山市定海區(qū)毛陳周(ZDM)和浙江省舟山市定海區(qū)蔡家岙(ZDC)居群聚為一支;HXY1、HXY2和HLS2等居群聚為另一支;TBY和HQG居群間及浙江省寧波市寧?？h歸云洞(NNG)和浙江省杭州市淳安縣向陽(yáng)村(HCX)居群間的遺傳關(guān)系較近。各居群間存在一定程度的基因交流。在NNG居群分化過程中向HXY2居群產(chǎn)生了基因遷移事件;在NNG和HCX居群分化形成的過程中,NXT居群與二者存在基因交流,此基因遷移事件的權(quán)重最大;并且在NXT、HLS2和ZDC居群形成的過程中也均受到外界基因遷移事件的影響。

HLS: 浙江省杭州市臨安區(qū)順溪塢Shunxiwu, Lin’an District, Hangzhou City, Zhejiang Province; HXY: 浙江省杭州市西湖區(qū)云棲竹徑Bamboo-lined path at Yunqi, Xihu District, Hangzhou City, Zhejiang Province; JSL: 浙江省建德市壽昌林場(chǎng)綠荷塘林區(qū)Lühetang Forest District, Shouchang Forest Farm, Jiande City, Zhejiang Province; HCX: 浙江省杭州市淳安縣向陽(yáng)村Xiangyang Village, Chun’an County, Hangzhou City, Zhejiang Province; HQG: 安徽省黃山市祁門縣牯牛降Guniujiang, Qimen County, Huangshan City, Anhui Province; JYF: 浙江省金華市永康市方山口村Fangshankou Village, Yongkang City, Jinhua City, Zhejiang Province; NNG: 浙江省寧波市寧?？h歸云洞Guiyun Cave, Ninghai County, Ningbo City, Zhejiang Province; NXT: 浙江省寧波市象山縣屠家園村Tujiayuan Village, Xiangshan County, Ningbo City, Zhejiang Province; ZDC: 浙江省舟山市定海區(qū)蔡家岙Caijia’ao, Dinghai District, Zhoushan City, Zhejiang Province; ZDM: 浙江省舟山市定海區(qū)毛陳周Maochenzhou, Dinghai District, Zhoushan City, Zhejiang Province; TBY: 臺(tái)灣省臺(tái)北市北投區(qū)陽(yáng)明山Y(jié)angmingshan, Beitou District, Taipei City, Taiwan Province.圖5 堇葉紫金牛13個(gè)居群間的基因流分析Fig.. 5 Analysis on gene flow among 13 populations of Ardisia violacea (T. Suzuki) W. Z. Fang et K. Yao

3 討論和結(jié)論

影響物種遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性的因子有很多,如生長(zhǎng)環(huán)境[20]、分布區(qū)域[21]、種群數(shù)量以及繁殖系統(tǒng)特性[22]等,這些因子會(huì)影響物種對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力[23]。本研究發(fā)現(xiàn)堇葉紫金牛的群體遺傳多樣性較低。蔡超男等[24]在研究瀕危植物海南風(fēng)吹楠(HorsfieldiahainanensisMerr.)時(shí)發(fā)現(xiàn),由于自身更新能力弱及受過度人為活動(dòng)的影響,海南風(fēng)吹楠群體呈現(xiàn)出遺傳多樣性低的現(xiàn)狀;桃兒七〔Sinopodophyllumhexandrum(Royle) Ying〕[25]、長(zhǎng)序榆(UlmuselongataL. K. Fu et C. S. Ding)[26]、領(lǐng)春木(EupteleapleiospermaJ. D. Hooker et Thomson)[27]等瀕危植物也有類似規(guī)律。而對(duì)伯樂樹(BretschneiderasinensisHemsl.)的研究發(fā)現(xiàn),伯樂樹具有較豐富的遺傳多樣性[28],這可能與其分布范圍較廣、種群數(shù)量相對(duì)較多有關(guān)。相關(guān)研究表明:同屬的瀕危物種遺傳多樣性通常低于廣域分布種,如普陀鵝耳櫪(CarpinusputoensisCheng)遺傳多樣性低于疏花鵝耳櫪〔C.laxiflora(Siebold et Zucc.) Blume〕[29-30],五小葉槭(AcerpentaphyllumDiels)遺傳多樣性低于青榨槭(A.davidiiFranch.)[31-32]。本研究中,堇葉紫金牛13個(gè)居群整體遺傳多樣性偏低,同屬?gòu)V域分布種朱砂根(ArdisiacrenataSims)遺傳多樣性相對(duì)較高[33-34]。由此推斷遺傳多樣性低可能與瀕危植物分布范圍小、種群數(shù)量少有關(guān),這可能是瀕危植物的共有特征。

遺傳分化系數(shù)是用于衡量居群間遺傳分化程度的重要指標(biāo)[35]。一般而言,當(dāng)遺傳分化系數(shù)大于0.25時(shí),群體間遺傳分化程度高;遺傳分化系數(shù)小于0.05時(shí),群體間遺傳分化程度低[36]。本研究中,堇葉紫金牛居群間遺傳分化系數(shù)多數(shù)大于0.25,說明堇葉紫金牛居群間遺傳分化程度較高。瀕危植物觀光木〔Micheliaodora(Chun) Nooteboom et B. L. Chen〕和金鐵鎖(PsammosilenetunicoidesW. C. Wu et C. Y. Wu)的遺傳分化系數(shù)(分別為0.375 2和0.452 9)[37-38]與堇葉紫金牛相近。瀕危植物遺傳分化程度通常高于廣域分布種,如紅砂〔Reaumuriasoongorica(Pall.) Maxim.〕和麻花秦艽(GentianastramineaMaxim.)的遺傳分化系數(shù)(分別為0.088和0.114)[39-40]明顯低于上述瀕危植物,相對(duì)于廣域分布種,瀕危植物的生境片段化現(xiàn)象較為嚴(yán)重,居群間存在地理隔離,受異質(zhì)化生境的影響而產(chǎn)生分化。

堇葉紫金牛系統(tǒng)發(fā)育樹和主成分分析結(jié)果表明:整體表現(xiàn)為各居群內(nèi)的樣本聚在一起,這主要是因?yàn)檩廊~紫金牛果實(shí)較大,主要通過重力傳播,難以傳播到較遠(yuǎn)的地方[5],因而居群間基因交流相對(duì)較少[41]。同時(shí)堇葉紫金牛也存在距離較遠(yuǎn)的居群間的基因交流,浙江省杭州市臨安區(qū)順溪塢2個(gè)居群(HLS1、HLS2)和浙江省杭州市西湖區(qū)云棲竹徑2個(gè)居群(HXY1、HXY2)間的親緣關(guān)系較近,但相較于地理距離較遠(yuǎn)的浙江省金華市永康市方山口村(JYF)和浙江省舟山市定海區(qū)蔡家岙(ZDC)居群,HLS1、HLS2、HXY1、HXY2居群與浙江省杭州市淳安縣向陽(yáng)村(HCX)、安徽省黃山市祁門縣牯牛降(HQG)、浙江省建德市壽昌林場(chǎng)綠荷塘林區(qū)(JSL)居群間的地理距離更近,但親緣關(guān)系卻相對(duì)更遠(yuǎn);此外,浙江省寧波市象山縣屠家園村(NXT)和ZDC居群均與臺(tái)灣省臺(tái)北市北投區(qū)陽(yáng)明山(TBY)居群存在較遠(yuǎn)的地理距離,但這3個(gè)居群間親緣關(guān)系較近;HCX居群與TBY、JYF、ZDC居群有較近的親緣關(guān)系,推測(cè)這可能是由鳥類取食并傳播其種子所致。吸引鳥類傳播的果實(shí)(種子)通常具有成熟時(shí)顏色鮮艷、體積較小、數(shù)量較多、果期長(zhǎng)等特點(diǎn)[42-43],如圓葉相思樹(AcaciacyclopsA. Cunn. ex G. Don)成熟時(shí)肉質(zhì)假種皮橙紅色[44],紅豆杉〔Taxuschinensis(Pilger) Rehd.〕肉質(zhì)假種皮紅色[45],而紅色、橙色等顏色對(duì)鳥類具有視覺吸引的效果[46],這些顏色的果實(shí)通常是鳥類取食的偏好對(duì)象。堇葉紫金牛果實(shí)顏色紅艷,掛果時(shí)間10月至12月,符合鳥類秋冬季取食的偏好特征,因此可能存在鳥類傳播擴(kuò)散種子的現(xiàn)象。

堇葉紫金牛居群面積0.01～0.80 hm2,各居群間地理距離較遠(yuǎn),生境片段化現(xiàn)象較為嚴(yán)重,加劇了居群內(nèi)個(gè)體數(shù)量的減少,導(dǎo)致居群內(nèi)近交幾率增加,從而使遺傳多樣性降低。雖然堇葉紫金牛居群間存在較遠(yuǎn)距離的基因遷移,對(duì)居群間遺傳多樣性的提高具有一定作用,但對(duì)于堇葉紫金牛居群衰退的現(xiàn)狀難以起到較大的影響。因此,針對(duì)堇葉紫金牛遺傳多樣性降低,應(yīng)優(yōu)先保護(hù)HQG、NXT和ZDC這3個(gè)遺傳多樣性較高的居群,建立優(yōu)先保護(hù)單元;應(yīng)制定相應(yīng)的原地保存與遷地保存策略,減少人為干擾,保護(hù)現(xiàn)有野生群體;開展堇葉紫金牛相關(guān)的繁育工作,通過人工輔助的手段來維持并擴(kuò)大居群數(shù)量,從而更好地保護(hù)其遺傳多樣性。