胡馨月，孫悅，李懿，呂萍，張慧，李晶，梁成罡

目的 使用超高效液相色譜-四極桿串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜法（UPLC-Q-TOF MS）對脂肪酸修飾型胰高血糖素-1（GLP-1）類似物利拉魯肽和司美格魯肽一級結(jié)構(gòu)進行測定。

方法 分別在完整分子和酶切肽段水平上檢測，采用ACQUITY UPLC peptide BEH C18（2.1 mm × 100 mm，30 nm，1.7 μm）色譜柱，流動相 A 為 0.1% 甲酸-水溶液，流動相 B 為 0.1% 甲酸-乙腈溶液，梯度洗脫，流速0.3 ml/min；采用正離子 ESI+ 離子源和 MSE 采集模式進行數(shù)據(jù)采集。

結(jié)果 分別從完整分子和肽段水平準確測定了兩種脂肪酸修飾型 GLP-1 類似物一級完整序列結(jié)構(gòu)信息，并對修飾側(cè)鏈位點進行準確定位。肽段覆蓋率為 100%，且專屬性強、重復(fù)性好。

結(jié)論 液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)快速、靈敏、準確，可用于 GLP-1 類似物一級結(jié)構(gòu)的表征分析。

胰高血糖素-1（glucagon like peptide-1，GLP-1）是由腸道 L 細胞分泌的促進胰島素分泌的多肽激素，能夠調(diào)節(jié)或刺激胰島素的分泌，減慢胃腸道排空，抑制食欲[1]。生理性的 GLP-1 是親水性多肽，幾乎無法透過血腦屏障，在體內(nèi)會被二肽基態(tài)酶（DPP-4）迅速滅活，半衰期很短，僅為 1～2 min[2]。隨著重組 DNA 技術(shù)的發(fā)展，通過改變 GLP-1 天然結(jié)構(gòu)，減緩藥物的吸收和分布，延長體內(nèi)半衰期，減少病人的給藥次數(shù)。GLP-1 類似物具有改善血糖[3]、降低體重[4]和降低心血管風(fēng)險[5]等功能。GLP-1 類似物的開發(fā)策略，主要分為 3 種：①改變氨基酸：通過改變第 8 位氨基酸，從而阻止DPP-4 的剪切；②通過引入脂肪酸鏈，提高藥物與白蛋白的結(jié)合能力，延長在血漿中的存留時間，或者通過 GLP-1 與白蛋白或 Fc 等融合，依賴于 pH的 FcRn 介導(dǎo)的再循環(huán)機制，逃避內(nèi)吞進入溶酶體降解，延長半衰期[6]，或與 PEG 共價結(jié)合，從而減緩腎消除；③通過皮下緩釋劑型來維持血藥濃度[7]。

利拉魯肽和司美格魯肽是利用了以上第 1 和第 2 種策略。在結(jié)構(gòu)方面，利拉魯肽與天然 GLP-1（7～37）分子相比，34 位賴氨酸被精氨酸取代，26 位賴氨酸上增加一個谷氨酸介導(dǎo)的 16 碳棕櫚酰脂肪酸側(cè)鏈（圖1A）[8-9]；司美格魯肽與 GLP-1（7～37）相比有兩個氨基酸的差異，除了 34 位賴氨酸被精氨酸取代外，8 位丙氨酸被非天然氨基酸2-氨基異丁酸（Aib）取代，抵抗 DPP-4 的降解，26 位賴氨酸增加一個脂肪二酸長鏈（圖1B）[10-11]，進一步延長其在體內(nèi)的半衰期。脂肪酸側(cè)鏈除了可以與賴氨酸上的側(cè)鏈 NH2進行?；磻?yīng)外，還可能與利拉魯肽和司美格魯肽 N 端 His 上的 α 氨基和近 C 端兩個 Arg 上的胍基反應(yīng)，因此需要對其?；稽c進行確證。

圖1 利拉魯肽（A）和司美格魯肽（B）結(jié)構(gòu)Figure 1 Liraglutide (A) and semaglutide (B) structure

氨基酸序列（一級結(jié)構(gòu)）決定了蛋白高級結(jié)構(gòu)及所發(fā)揮的生物學(xué)功能，一級結(jié)構(gòu)的正確與否關(guān)系到產(chǎn)品的安全性和有效性，是產(chǎn)品的關(guān)鍵質(zhì)量屬性之一。本研究用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，以利拉魯肽和司美格魯肽作為 GLP-1 類似物研究對象，對其一級結(jié)構(gòu)進行測定。通過 MSE采集模式同時對一級和二級碎片進行采集，包括完整分子量、完整分子和酶解肽段水平序列測定（N 端序列測定）以及脂肪酸側(cè)鏈的準確定位。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 ACQUITY UPLC I-Class液質(zhì)聯(lián)用儀、Synapt G2-S Q TOF 液質(zhì)聯(lián)用儀和 UNIFI 數(shù)據(jù)處理軟件均為美國 Waters 公司產(chǎn)品。

1.1.2 試劑 乙腈、甲酸為美國 Fisher Scientific公司產(chǎn)品；Glu-C 酶（1 mg/支）為美國 Worthington公司產(chǎn)品；利拉魯肽和司美格魯肽原料藥為中檢院激素室留樣（批號：HJ1LK4012、JQ1SHP008）；貝那魯肽國家標準品來源于中國食品藥品檢定研究院（批號：410020-201901）。

1.2 方法

1.2.1 樣品制備

1.2.1.1 供試品的制備 稱取樣品約 10 mg，用0.1% 氨水溶液定容至 10 ml，配成濃度為 1 mg/ml的樣品溶液。取上述溶液 100 μl 置于 10 ml 容量瓶中，用 0.1% 甲酸/水溶液定容至刻度，混勻，作為供試品溶液。

1.2.1.2 酶切樣品前處理 稱取樣品約 10 mg，用 50 mmol/L 的碳酸氫銨溶液溶解并定容至 10 ml，配成濃度為 1 mg/ml 的樣品溶液。取該溶液 100 μl，加入 50 mmol/L 的碳酸氫銨溶液 900 μl，GLU-C酶（1 mg/ml）2 μl（蛋白和酶重量比為 50:1），37 ℃孵育 15～18 h。加入甲酸 1 μl 停止反應(yīng)，作為酶切供試品溶液。

1.2.2 實驗儀器方法

1.2.2.1 完整分子量和序列測定儀器方法 液相條件：色譜柱 ACQUITY UPLC peptide BEH C18（2.1 mm × 100 mm，1.7 μm，30 nm）；流動相 A 為0.1% 甲酸-水溶液，流動相 B 為 0.1%甲酸-乙腈溶液，梯度洗脫：0～10 min，20%～70% B；10～10.5 min，70%～95% B；10.5～12 min，95% B；12～12.5 min，95%～20% B；12.5～15 min，20% B。流速 0.3 ml/min，柱溫 50 ℃，進樣體積 5 μl。質(zhì)譜條件：液質(zhì)聯(lián)用儀器為 Waters UPLC I-Class/synapt G2-S Q TOF，電噴霧離子源（ESI+）正離子模式，錐孔電壓：40.0 V；掃描范圍：50～2000 m/z；檢測模式為 MSE，碰撞能量：20～30 eV。

1.2.2.2 酶切肽段序列測定的儀器方法 液相條件：ACQUITY UPLC peptide BEH C18（2.1 mm ×100 mm，1.7 μm，30 nm）色譜柱；流動相 A 為 0.1%甲酸-水溶液，流動相 B 為 0.1% 甲酸-乙腈溶液，梯度洗脫：0～13 min，0%～30% B；13～19 min，30%～45% B；19～30 min，45%～70% B；30～32 min，70% B；32～32.5 min，70%～0% B；32.5～40 min，0% B。流速 0.3 ml/min，柱溫 50 ℃，進樣體積 1 μl。質(zhì)譜條件同 1.2.2.1。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理 Waters-UNIFI 輸入理論氨基酸序列，一級質(zhì)量數(shù)和二級質(zhì)量數(shù)質(zhì)量容差為20 ppm。利拉魯肽序列設(shè)置 HAEGTFTSDVSSY LEGQAAK(&)EFIAWLVRGRG，& 為脂肪酸修飾，分子式 C21H37NO4（367.2723 Da）；司美格魯肽序列設(shè)置 HOEGTFTSDVSSYLEGQAAK(&)EFIAWLVRGRG，O 代表Aib 氨基酸，& 分子式C35H61N3O12（715.4255 Da）。

2 結(jié)果

2.1 分子量檢測

對 GLP-1 類似物進行 MSE一級質(zhì)譜采集，經(jīng)去卷積處理，利拉魯肽實測單一同位素質(zhì)量數(shù)[M+H]+為 3749.9813 Da，理論單一同位素質(zhì)量數(shù)[M+H]+為 3749.9537 Da，偏差為 7.4 ppm；司美格魯肽實測單一同位素質(zhì)量數(shù) [M+H]+為4112.1414 Da，理論單一同位素質(zhì)量數(shù) [M+H]+為4112.1227 Da，偏差為 4.5 ppm，結(jié)果表明利拉魯肽和司美格魯肽的分子量正確，一級質(zhì)譜圖見圖2A和 2B。

圖2 利拉魯肽（A）和司美格魯肽（B）一級質(zhì)譜圖Figure 2 Primary mass spectra of liraglutide (A) and semaglutide (B)

2.2 完整多肽二級序列測定和修飾位點定位

2.2.1 完整多肽二級序列測定碰撞能優(yōu)化 對關(guān)鍵碰撞能參數(shù)進行考察，以期獲得較多 b/y 離子數(shù)，更好地覆蓋氨基酸序列?？疾?10～20、10～30、20～30、20～40、30～40、30～50、40～50、50～60 eV 碰撞能下的 b/y 離子總數(shù)（每個碰撞能條件下重復(fù)進樣 2 針）。結(jié)果如圖3 所示，碰撞能20～30 eV 時產(chǎn)生的 b/y 離子數(shù)較其他碰撞能的個數(shù)相對較多，故選擇 20～30 eV 碰撞能條件下進行二級采集分析。

圖3 不同碰撞能條件下利拉魯肽和司美格魯肽的 b/y 離子數(shù)Figure 3 The total number of b/y ions of liraglutide and semaglutide at different collision energy

2.2.2 完整多肽二級序列和 N 末端氨基酸序列測定 對 GLP-1 類似物進行 MSE二級質(zhì)譜采集，采用 UNIFI 軟件進行處理，得到對應(yīng)的 y 離子與 b 離子，b、y 離子系列相鄰的離子的質(zhì)量差，即氨基酸殘基質(zhì)量，根據(jù)互補或完整的 b/y 系列離子可以匹配氨基酸序列。經(jīng)去卷積處理，利拉魯肽氨基酸序列測定（y 離子與 b 離子）由結(jié)果（表1和圖4A）可知，b/y 離子共計 56 個，肽段覆蓋率為 100%，N 末端氨基酸為 HAEGTFTSDVSS YLE，該 15 個氨基酸所匹配的互補 b/y 離子至少檢出一個，可表明 N 末端氨基酸序列與理論序列一致。司美格魯肽氨基酸序列測定（y 離子與 b 離子）由結(jié)果（表2 和圖4B）可知，b/y 離子共計52 個，肽段覆蓋率為 100%，N 末端氨基酸為HOEGTFTSDVSSYLE（O 表示 Aib），該 15 個氨基酸所匹配的互補 b/y 離子至少檢出一個，可表明N 末端氨基酸序列與理論序列一致。

表1 利拉魯肽氨基酸序列測定（y 離子與 b 離子）結(jié)果Table 1 Amino acid sequence determination of liraglutide (y ion and b ion) data

圖4 利拉魯肽（A）和司美格魯肽（B）二級離子覆蓋圖Figure 4 Secondary ions coverage of liraglutide (A) and semaglutide (B) fragments

2.2.3 完整多肽二級序列測定中修飾位點定位 利拉魯肽氨基酸序列測定（圖4A），y1～y11碎片離子和 b1～b19 碎片離子均無酰化側(cè)鏈相連，酰化試劑連接位點在 y11 與 y12& 之間，b19與 b20& 之間，即 20 位 K 上。司美格魯肽氨基酸序列測定（圖4B），y1～y10 碎片離子和 b1～b19 碎片離子均無?；瘋?cè)鏈相連，?；噭┻B接位點在 y10 與 y12& 之間，b19 與 b21& 之間，存在兩個氨基酸 KE。根據(jù)反應(yīng)機制，司美格魯肽通過序列氨基酸中的側(cè)鏈基團與脂肪二酸發(fā)生定點?；磻?yīng)所得，E 不存在與脂肪二酸結(jié)合的位點，K 中側(cè)鏈氨基可以與其反應(yīng)，故修飾位點位于K 上。

2.2.4 專屬性驗證 另取貝那魯肽適量，按照1.2.1.1 項下前處理和 1.2.2.1 項下進行采集，在Waters-UNIFI 中分別輸入利拉魯肽或司美格魯肽理論氨基酸序列進行完整分子量和碎片離子的匹配，結(jié)果顯示貝那魯肽實測單一同位素質(zhì)量數(shù)[M+H]+為 3297.6741 Da，與利拉魯肽或司美格魯肽理論一級分子量均不一致，故無法進一步匹配利拉魯肽或司美格魯肽二級碎片離子。故輸入貝那魯肽理論序列（HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIA WLVKGR）進行軟件解析。結(jié)果如圖5，表明貝那魯肽與利拉魯肽或司美格魯肽理論二級碎片均不完全一致。綜上，證明該方法專屬性良好。

圖5 貝那魯肽碎片覆蓋離子圖Figure 5 Secondary ions coverage of beinaglutide

2.2.5 重復(fù)性驗證 照 1.2.2.1 項下液質(zhì)方法，利拉魯肽和司美格魯肽分別重復(fù)進樣 6 針，利拉魯肽單一同位素質(zhì)量數(shù) [M+H]+平均值為3749.9831，RSD% 為 0.0003%，肽段覆蓋率均為100%；司美格魯肽單一同位素質(zhì)量數(shù) [M+H]+平均值為 4112.1561，RSD% 為 0.0005%，肽段覆蓋率均為 100%。

2.3 酶解肽段二級序列測定和修飾位點結(jié)構(gòu)及定位

2.3.1 酶解肽段二級序列測定 通過 V8 Glu-C蛋白酶進行特異性水解，利拉魯肽和司美格魯肽皆有 3 個 Glu 酶切位點，采用 LC-MS/MS 對水解的主要肽段分析，根據(jù)肽段序列推導(dǎo)氨基酸序列。利拉魯肽和司美格魯肽分別檢測到 4 條和 5 條主要肽段（含一個漏切肽段），每條肽段的質(zhì)量數(shù)、保留時間、序列和 b/y 離子數(shù)詳見表3 和表4，表中顯示的所有酶切肽段可全部覆蓋利拉魯肽和司美格魯肽氨基酸序列，從而也輔助驗證了完整多肽序列與理論序列的一致性。

表4 司美格魯肽酶切質(zhì)量肽圖數(shù)據(jù)Table 4 Digestion quality peptide map data of semaglutide

2.3.2 酶解肽段修飾位點結(jié)構(gòu)定位 根據(jù)利拉魯肽和司美格魯肽經(jīng)酶切后肽段 3（V3&[5]+H+）質(zhì)量肽圖數(shù)據(jù)，顯示脂肪酸側(cè)鏈修飾位于該肽段中，進一步通過 LC-MS/MS 分析和 UNIFI 軟件處理，該肽段的 y1 碎片離子和 b1～b4 碎片離子均無?；瘋?cè)鏈相連，修飾位點則位于 y1 與 y2& 之間，b4 和 b5& 之間，即 K 上（圖6）。通過裂解規(guī)律分析，進一步從肽段 3 的原始二級質(zhì)譜圖中尋找?；瘋?cè)鏈特征離子和定位特征離子。如圖7 所示，信號峰 m/z 643.4276 為利拉魯肽肽段3 的 y2& 離子，序列為 EK&；信號峰 m/z 451.3536 為利拉魯肽脂肪酸側(cè)鏈與 20 位賴氨酸K 的側(cè)鏈直接相連的碎片離子。同理，如圖8 所示，信號峰 m/z 991.5812 為司美格魯肽肽段 3 的y2& 離子，序列為 EK&；信號峰 m/z 799.5058 為司美格魯肽脂肪酸側(cè)鏈與 20 位賴氨酸 K 的側(cè)鏈直接相連的碎片離子。綜上，通過肽段 3 的二級質(zhì)譜特征碎片證明?；瘋?cè)鏈直接與賴氨酸側(cè)鏈NH2相連。

圖6 利拉魯肽（A）和司美格魯肽（B）肽段 3 二級覆蓋圖Figure 6 Secondary ions coverage of liraglutide (A) and semaglutide (B) peptide 3

圖7 利拉魯肽的肽段 3 中特征離子碎片圖Figure 7 Characteristic ion fragments of liraglutide peptide 3

圖8 司美格魯肽的肽段 3 中特征離子碎片圖Figure 8 Characteristic ion fragments of semaglutide peptide 3

3 討論

隨著生物質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜法串聯(lián)測定多肽及蛋白質(zhì)氨基酸序列快速、靈敏、準確等特點，可以作為支撐多肽和蛋白結(jié)構(gòu)分析和確證的重要手段。

通過借鑒以往在胰島素及其類似物中一級結(jié)構(gòu)的分析經(jīng)驗[12-13]，本研究采用了兩種質(zhì)譜的分析策略：自下而上和自上而下分析策略?！白陨隙隆笔抢蒙V聯(lián)用質(zhì)譜或質(zhì)譜等分析技術(shù)，直接對完整蛋白水平分析；“自下而上”策略是使用一種或多種酶將蛋白水解成小肽再進行肽段水平的質(zhì)譜分析。本研究通過 MSE模式采集利拉魯肽和司美格魯肽完整肽段分子的一級分子量和二級碎片離子，對該兩種 GLP-1 類似物進行“自上而下”完整分子層面的一級結(jié)構(gòu)分析，在碰撞誘導(dǎo)解離碎裂中，b 和 y 型碎片離子在質(zhì)譜圖中較多見，豐度較高[14]，通過互補的 b/y 離子匹配氨基酸理論序列。研究中嘗試不同碰撞能量，采用 20～30 eV 的梯度碰撞電壓，得到相對較多的 b/y 離子數(shù)。經(jīng)數(shù)據(jù)處理分析，利拉魯肽和司美格魯肽的 N 端 15 個氨基酸全部匹配，肽段覆蓋率均為 100%。完整肽段脂肪酸定位研究中，根據(jù) b、y 離子系列相鄰的離子的質(zhì)量差，利拉魯肽可精準判斷脂肪酸修飾在20 位賴氨酸上，司美格魯肽 EK 兩個氨基酸之間則可以根據(jù)反應(yīng)機制進行判斷。在“自下而上”肽段水平中，所有酶切肽段可 100% 覆蓋利拉魯肽和司美格魯肽氨基酸序列，并且通過對特征肽段二級質(zhì)譜的解析，找到利拉魯肽和司美格魯肽脂肪酸?；瘋?cè)鏈直接與賴氨酸側(cè)鏈 NH2相連的碎片離子。

本研究通過利用液質(zhì)聯(lián)用的技術(shù)，準確測定了兩種脂肪酸修飾型 GLP-1 類似物一級完整序列信息結(jié)構(gòu)，并對修飾側(cè)鏈位點進行了準確、快速的定位，為該類藥物的一級結(jié)構(gòu)表征提供了參考價值，可用于研發(fā)、終產(chǎn)品放行過程中的結(jié)構(gòu)表征方法，對該類藥物質(zhì)譜定性表征的標準平臺化建設(shè)有一定意義。另外，不論是“自下而上”還是“自上而下”的分析策略，均可以對 N 末端氨基酸序列進行準確測定，相比于 Edman 降解法，操作更簡便，靈敏度較高，具有可以替代傳統(tǒng) Edman 降解法的應(yīng)用前景。