陳澤蒙，楊晨曦，張博文，李婷

乳腺癌是女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤，也是癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2020 年全球約有 226 萬(wàn)例新增病例，68 萬(wàn)人因乳腺癌死亡[1]。盡管過(guò)去幾十年的研究在其預(yù)防、診斷和治療方面已取得重大研究進(jìn)展[2]，乳腺癌仍然是全球健康的主要負(fù)擔(dān)之一。早期乳腺癌患者的五年生存率為 98%，而晚期乳腺癌患者的五年生存率則降至27%[3]。因此較早地發(fā)現(xiàn)、診斷和治療乳腺癌對(duì)改善患者預(yù)后至關(guān)重要[4]。目前臨床應(yīng)用最廣泛的乳腺癌影像學(xué)檢測(cè)方式包括鉬靶 X 線、乳腺超聲和 MRI[5]，然而前兩種技術(shù)的局限性是特異性低和準(zhǔn)確性差，MRI 雖然具有較高的特異性但其價(jià)格昂貴。乳腺癌在臨床診斷中的唯一金標(biāo)準(zhǔn)是病理學(xué)分析，但侵入性的手術(shù)切除或穿刺活檢往往給患者造成較大的創(chuàng)傷。此外，乳腺組織的形態(tài)和分子異質(zhì)性可能造成診斷的困難，依賴于病理學(xué)專家的經(jīng)驗(yàn)。非侵入式、快速和具有高時(shí)空分辨率的拉曼光譜（Raman spectroscopy，RS）術(shù)正在成為乳腺癌診斷的臨床研究中的強(qiáng)大工具，具有為乳腺癌提供臨床相關(guān)診斷信息的潛力[6]。本文回顧了相關(guān)研究并介紹其基本原理、優(yōu)勢(shì)和相關(guān)案例。

1 表面增強(qiáng)拉曼光譜術(shù)原理

1928 年，拉曼發(fā)現(xiàn)光的非彈性散射（拉曼現(xiàn)象）[7]，后于 1970 年拉曼現(xiàn)象首次在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中報(bào)道[8]。拉曼光譜術(shù)是一種分子振動(dòng)光譜技術(shù)，可以反映分子的特征結(jié)構(gòu)[9]，給出分子組成的直接、客觀圖像[10]。表面增強(qiáng)拉曼光譜（surface enhanced Raman spectroscopy，SERS）術(shù)克服了弱拉曼散射和熒光發(fā)射的干擾造成的低特異性的問(wèn)題，利用等離子體獲得附著在納米結(jié)構(gòu)表面上的分子組裝物的全部化學(xué)信息[11]。SERS 增強(qiáng)主要通過(guò)兩種機(jī)制發(fā)生：電磁增強(qiáng)和化學(xué)增強(qiáng)。電磁理論認(rèn)為，當(dāng)入射光落在粗糙的貴金屬表面時(shí)，粗糙金屬表面的等離子體吸收光子能量，進(jìn)入更高的能量狀態(tài)，進(jìn)一步與光產(chǎn)生的電場(chǎng)耦合導(dǎo)致粗糙金屬表面電磁場(chǎng)的強(qiáng)度增加。而化學(xué)增強(qiáng)主要依賴探針與金屬間的化學(xué)相互作用。當(dāng)活性拉曼襯底表面的 SERS 活性位點(diǎn)吸收探針?lè)肿樱a(chǎn)生強(qiáng)大的 SERS 效應(yīng)，探針和拉曼底物之間的化學(xué)鍵導(dǎo)致形成新的配合物。此外，電荷變化所產(chǎn)生的類共振現(xiàn)象增強(qiáng)了分子的極化率，增加拉曼散射光的強(qiáng)度。與拉曼光譜術(shù)相比，表面增強(qiáng)光譜術(shù)的特異性低至單分子水平，可提供精細(xì)的分子指紋，從而可以直接識(shí)別目標(biāo)分析物，適合在多路復(fù)用檢測(cè)中使用[12]。

2 表面增強(qiáng)拉曼光譜在乳腺癌診斷中的臨床應(yīng)用

表面增強(qiáng)拉曼光譜術(shù)具有較高的特異性和準(zhǔn)確度，滿足識(shí)別和診斷乳腺癌的臨床需求，能夠更快速、更可靠、更早地檢測(cè)疾病，以改善患者的預(yù)后[13]。表1 總結(jié)了表面增強(qiáng)拉曼光譜術(shù)通過(guò)分析液體活檢和體內(nèi)成像的結(jié)果進(jìn)行乳腺癌的檢測(cè)和診斷的基本原理、優(yōu)勢(shì)和臨床應(yīng)用研究案例。

表1 表面增強(qiáng)拉曼光譜術(shù)在乳腺癌診斷中的臨床應(yīng)用

2.1 液體活檢

眾所周知，體液如血液、唾液和淚液在許多情況下具有多種生物標(biāo)志物[20]，并且獲取簡(jiǎn)單、無(wú)創(chuàng)，如今被越來(lái)越多地應(yīng)用于乳腺癌早期檢測(cè)和診斷的研究。其中，miRNA由于其在體液中的穩(wěn)定性，作為用于早期診斷和預(yù)后的癌癥生物標(biāo)志物而受到越來(lái)越多的關(guān)注[21]。研究表明，外泌體 miRNA 生物標(biāo)志物表達(dá)水平與乳腺癌之間存在密切關(guān)聯(lián)[22]，因此具有成為癌癥診斷、預(yù)后和治療效果的理想生物標(biāo)志物的潛力。通常，液體活檢應(yīng)用的目標(biāo)分子包括蛋白質(zhì)、核酸片段和脂質(zhì)類的多種生物標(biāo)志物，在臨床研究中三類目標(biāo)分子被聯(lián)合用于早期檢測(cè)和診斷乳腺癌[23]。

2.1.1 血液 2021年，Nargis 等[14]證實(shí)了基于血清的乳腺癌診斷的有效性。收集 II～I(xiàn)V 期乳腺癌患者和正常人的血清樣本，從每個(gè)樣本中獲取表面增強(qiáng)拉曼光譜，對(duì)其進(jìn)行主成分分析和偏最小二乘判別分析獲得用于乳腺癌診斷和分類的光譜標(biāo)志物的光譜特征，測(cè)試結(jié)果其準(zhǔn)確度、特異性和受試者工作特征曲線下面積分別為 90%、98.4% 和 94%。2021 年，Gao 等[15]和 Lin 等[16]的研究結(jié)果表明拉曼光譜可以準(zhǔn)確分類和區(qū)分乳腺癌患者和健康對(duì)照的血清（和血清白蛋白）。為將表面增強(qiáng)拉曼光譜分析用于乳腺癌的臨床診斷，必須將乳腺癌與其他惡性腫瘤進(jìn)行鑒別。現(xiàn)有研究在乳腺癌患者的血清中發(fā)現(xiàn)了相對(duì)于其他惡性腫瘤獨(dú)特的生化特征，可以將乳腺癌與結(jié)直腸癌、肺癌、卵巢癌、口腔癌、肝癌、白血病和宮頸癌區(qū)分開(kāi)來(lái)[24-25]。

2.1.2 唾液 Feng 等[26]的研究結(jié)果表明，唾液中蛋白質(zhì)的表面增強(qiáng)拉曼光譜也具有應(yīng)用于乳腺癌診斷的臨床潛能。該實(shí)驗(yàn)采集正常對(duì)照、良性和惡性乳腺腫瘤患者的純化唾液蛋白進(jìn)行表面增強(qiáng)拉曼光譜分析，根據(jù)唾液蛋白的不同化學(xué)鍵振動(dòng)確定了六個(gè)突出的峰，而三組之間大多數(shù)峰的強(qiáng)度存在顯著差異。另外，2011 年，Oztürk 等[18]發(fā)現(xiàn)唾液酸水平升高與乳腺癌存在相關(guān)。通過(guò)對(duì)健康和乳腺癌患者的唾液樣本應(yīng)用表面增強(qiáng)拉曼光譜術(shù)來(lái)量化唾液酸水平的研究表明，健康樣本的中位唾液酸濃度（3.5 mg/dl）顯著低于乳腺癌樣本中觀察到的唾液酸濃度（18.5 mg/dl）[27]。

2.1.3 淚液 淚液成分除了伴隨眼部疾病的產(chǎn)生而變化以外，也會(huì)隨全身性疾?。òㄈ橄侔┑陌l(fā)生而改變[28]。與其他體液相比，淚液的成分相對(duì)簡(jiǎn)單[29]，因此高特異性的表面增強(qiáng)拉曼光譜術(shù)可以用來(lái)檢測(cè)其中的低豐度成分。Kim 等[19]使用便攜式拉曼系統(tǒng)和基于多變量統(tǒng)計(jì)的識(shí)別算法從人類眼淚中檢測(cè)或預(yù)測(cè)無(wú)癥狀乳腺癌，檢測(cè)乳腺癌臨床準(zhǔn)確度和特異性分別達(dá)到 92% 和 100%，驗(yàn)證了其臨床應(yīng)用的潛能。

2.2 體內(nèi)成像

目前已有多項(xiàng)研究應(yīng)用便攜式手持拉曼光纖探頭對(duì)離體的癌性和非癌性乳腺組織進(jìn)行分類[30]，證明了術(shù)中診斷乳腺癌的體內(nèi)應(yīng)用的潛在臨床應(yīng)用能力。然而尚缺乏臨床應(yīng)用的報(bào)道，因此本部分主要介紹表面增強(qiáng)拉曼光譜在離體乳腺癌腫瘤樣本和活體模型動(dòng)物中的體內(nèi)成像研究。

2006年，Haka 等[31]報(bào)道了第一個(gè)來(lái)自乳房組織的體內(nèi)拉曼光譜，樣本從接受部分乳房切除術(shù)的患者身上獲得。使用臨床拉曼系統(tǒng)和光纖探頭，對(duì)切除后剩余腫瘤腔的手術(shù)切緣進(jìn)行評(píng)估，將結(jié)果與傳統(tǒng)組織病理學(xué)評(píng)估的結(jié)果進(jìn)行比較時(shí)，拉曼的總體準(zhǔn)確度達(dá)到 93%。2021 年，Wen 等[32]使用納米探針將光聲成像與表面增強(qiáng)拉曼光譜術(shù)結(jié)合，引導(dǎo)手術(shù)切除小鼠乳腺惡性腫瘤并在術(shù)中切除殘留微腫瘤，在乳腺癌模型鼠中實(shí)現(xiàn)了微腫瘤的完全消融，且后續(xù)未出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)。

經(jīng)皮從乳房獲取拉曼光譜的可行性在小鼠模型中已被驗(yàn)證[33-34]，基于表面增強(qiáng)拉曼光譜術(shù)的體內(nèi)成像動(dòng)物研究也廣泛開(kāi)展。Pal 等[35]設(shè)計(jì)了一種具有生物相容性的三模態(tài)納米探針，對(duì)三陰性乳腺癌鼠模型進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明該探針優(yōu)先集中于腫瘤內(nèi)，且具有出色的光聲、熒光和表面增強(qiáng)拉曼成像能力。2023 年，Qiu 等[36]對(duì)雌性乳腺癌裸鼠模型靜脈注射含有表面增強(qiáng)拉曼光譜探針的溶液，體內(nèi)成像的結(jié)果與處死后 HE 染色和 Masson 染色結(jié)果一致。同時(shí)，解剖后獲得的器官未出現(xiàn)明顯的毒性，這表明了表面增強(qiáng)拉曼光譜術(shù)的生物安全性。

2.3 乳腺癌的 SERS 特征

2.3.1 乳腺癌 4 個(gè)亞型的 SERS 特征 乳腺癌根據(jù)基因和免疫組化不同分出的 4 個(gè)亞型分別為：luminal A 型、luminal B 型、HER-2 過(guò)表達(dá)型、三陰型。Xie 等[37]的研究將一種有監(jiān)督的深度學(xué)習(xí)算法——人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（ANN）與血清 SERS 結(jié)合對(duì)乳腺癌的 4 種亞型進(jìn)行分類，具有100% 的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率，同時(shí)給出可以將 4 種亞型區(qū)分的SERS 特征。在三陰型、HER-2 過(guò)表達(dá)型、luminal B 型和luminal A 型中，SERS 在 668 cm-1（鳥(niǎo)嘌呤、胸腺嘧啶）、732 cm-1（腺嘌呤）、858 cm-1（酪氨酸環(huán)）、933 cm-1（對(duì)稱拉伸主干 C-C、α-螺旋）、1010 cm-1（對(duì)稱環(huán)苯丙氨酸）、1078 cm-1（鏈條 C-C 拉伸）、1169 cm-1（C-C、C-N拉伸）、1335 cm-1（腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤）、1442 cm-1（CH2形變）、1513 cm-1（C=C 拉伸）以及 1580 cm-1（酰胺 II）處的峰值依次減弱。

2.3.2 同一亞型乳腺癌不同階段 SERS 特征 乳腺癌根據(jù)不同發(fā)展階段可分為 I～I(xiàn)V 期。2021 年，Nargis 等[14]在不同乳腺癌階段觀察到了可以將其區(qū)分的 SERS 峰，這些 SERS 特征包括 737cm-1[DNA、色氨酸、d（環(huán)）]，766 cm-1（胞嘧啶和胸腺嘧啶的環(huán)形模式），784 cm-1（胞嘧啶），950 cm-1（氨基酸的單鍵拉伸），1191 cm-1（L-纈氨酸），1313 cm-1（脂質(zhì)的 CH3CH2扭曲模式），1424 cm-1[脫氧核糖（B、Z 標(biāo)記）]、1542 cm-1（酰胺 II）、1628 cm-1（L-絲氨酸）。括號(hào)內(nèi)的生物分子即乳腺癌的疾病生物標(biāo)志物，因?yàn)樗鼈冎饕嬖谟谌橄侔┗颊叩难鍢颖局?，而在健康人的血清樣本中不存在或微量。在乳腺癌的?II 階段進(jìn)展至第IV 階段的過(guò)程中，在 752 cm-1（DNA、鳥(niǎo)嘌呤），848 cm-1（氨基酸的單鍵伸縮振動(dòng)），932 cm-1（骨架 C-C、α-螺旋），1074 cm-1[甘油三酯 C-C（脂質(zhì)）]，1245 cm-1（酰胺 III），1280 cm-1（膠原蛋白），1292 cm-1（胞嘧啶），1355 cm-1[鳥(niǎo)嘌呤（N7、B、Z 標(biāo)記）]，1365 cm-1（氨基酸、色氨酸），1445 cm-1（蛋白質(zhì)、膠原蛋白的 CH2彎曲模式），1472 cm-1（鳥(niǎo)嘌呤），1558 cm-1（色氨酸），1583 cm-1（苯丙氨酸的 C=C彎曲模式），1738 cm-1（脂質(zhì)）處的 SERS 峰值逐漸升高，即該生物標(biāo)志物的含量逐漸增加。并且處于疾病的第 III 和第 IV 期，血清中被檢測(cè)出含有大量的脂質(zhì)、DNA 和蛋白質(zhì)，這是臨床晚期乳腺癌階段。而健康人樣本的血清中出現(xiàn)729 cm-1（腺嘌呤環(huán)），893 cm-1（骨架、C-C 骨架），1137 cm-1（n(C-C)-脂質(zhì)、脂肪酸）和 1457 cm-1（脫氧核糖）SERS 峰值，在乳腺癌患者血清的 SERS 曲線中未體現(xiàn)。不過(guò)目前仍缺乏進(jìn)一步的研究來(lái)清楚地解釋以上現(xiàn)象。

2.3.3 乳腺癌治療前后 SERS 特征 Lin 等[38]對(duì)比了乳腺癌手術(shù)治療前后的患者和健康人間血清 SERS 曲線。研究結(jié)果表明，術(shù)后組在 496 cm-1（苯丙酮）、1004 cm-1（D-甘露糖）和 1132 cm-1（次黃嘌呤）處顯示出明顯較低的 SERS 峰值，在 725 cm-1（L-精氨酸）處則顯示出較高的強(qiáng)度，表明 L-精氨酸的百分比有所下降，苯丙酮、D-甘露糖和次黃嘌呤相對(duì)于血液樣本中總拉曼活性成分的百分比增加。此外，另一方面，在術(shù)前組（即乳腺癌患者）的血清中 496 cm-1（L-精氨酸）、638 cm-1（酪氨酸）、1004 cm-1（苯丙氨酸）、1132 cm-1（D-甘露糖）和 1658 cm-1（酰胺 ?）處 SERS 峰發(fā)生的顯著變化與正常組相反。該現(xiàn)象是由于隨著惡性腫瘤的出現(xiàn)和發(fā)展，凋亡和壞死的細(xì)胞會(huì)由于被動(dòng)機(jī)制釋放蛋白質(zhì)和游離核酸，或者由活的癌細(xì)胞主動(dòng)釋放這些物質(zhì)來(lái)影響遠(yuǎn)處易感細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。當(dāng)腫瘤組織被血液和淋巴液灌注時(shí)，該蛋白質(zhì)和核酸片段進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，在循環(huán)血液中產(chǎn)生獨(dú)特的特征[39-40]。當(dāng)惡性腫瘤經(jīng)手術(shù)切除后，這些癌癥特異性物質(zhì)的來(lái)源立即被切斷，最終導(dǎo)致術(shù)后患者的血液成分與術(shù)前不同。

3 總結(jié)與展望

表面增強(qiáng)拉曼光譜術(shù)的高準(zhǔn)確度和特異性為乳腺癌的臨床檢測(cè)與診斷研究帶來(lái)了啟發(fā)?；谏飿?biāo)志物 miRNA采集血液、唾液、淚液等體液應(yīng)用表面拉曼光譜術(shù)進(jìn)行液體活檢對(duì)于患者幾乎無(wú)創(chuàng)，經(jīng)過(guò)合理的臨床轉(zhuǎn)化后可以成為非常理想的乳腺癌篩查和檢測(cè)手段。乳腺癌切除手術(shù)過(guò)程中結(jié)合表面拉曼光譜術(shù)進(jìn)行體內(nèi)成像輔助檢測(cè)和定位乳腺惡性腫瘤，切除殘留微腫瘤，在臨床角度對(duì)于患者預(yù)后和防止疾病復(fù)發(fā)意義重大。然而表面增強(qiáng)拉曼光譜術(shù)也存在一定局限性。雖然現(xiàn)有的技術(shù)可以從生物樣本中獲得光譜，但研究標(biāo)準(zhǔn)尚未得到統(tǒng)一，如樣本的制備方式、安裝樣本的基板、光譜儀的設(shè)置及數(shù)據(jù)處理算法，不同分析流程可能使得相同的樣本產(chǎn)生顯著不同的光譜，這導(dǎo)致表面拉曼光譜術(shù)在臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化方面仍存在一定困難。因此，制訂規(guī)范化的分析流程和相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)是很有必要的。