宮長斌，陳可泉，賈紅華

(南京工業(yè)大學(xué)生物化學(xué)工程實驗教學(xué)示范中心，江蘇 南京 210018)

1 簡 介

蛋白質(zhì)化學(xué)是生物化學(xué)教學(xué)中最重要的內(nèi)容之一，蛋白質(zhì)不僅參與了細(xì)胞中的許多生理過程，是探索生命機(jī)理的關(guān)鍵，也是重要的營養(yǎng)物質(zhì)，廣泛應(yīng)用于工業(yè)、醫(yī)學(xué)、營養(yǎng)學(xué)等行業(yè)[1]。對蛋白質(zhì)在生物中的含量進(jìn)行分析，可以進(jìn)一步了解蛋白在生物體中的占比組成，幫助對蛋白質(zhì)的表達(dá)、結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行分析，也可以幫助對工業(yè)用品、食品、飼料等物質(zhì)的營養(yǎng)價值進(jìn)行鑒定[2]。因此蛋白質(zhì)的定性與定量檢測，是生物技術(shù)、醫(yī)學(xué)、食品、營養(yǎng)學(xué)等行業(yè)畢業(yè)生必須要掌握的知識點，也是生物化學(xué)實驗教學(xué)中必備的實驗項目，在實驗教學(xué)中具有非常重要的地位，也是相關(guān)專業(yè)在生物化學(xué)課程中深入理解和研究蛋白質(zhì)的重要基礎(chǔ)。目前蛋白質(zhì)的定量分析檢測方法很多，其中很多種已應(yīng)用于生物化學(xué)實驗教學(xué)。表1列出了目前在教學(xué)中使用較多的幾種蛋白質(zhì)分析實驗及其適用專業(yè)類型。

表1 蛋白質(zhì)分析實驗項目對課程體系的支撐情況和適用專業(yè)

2 不同蛋白質(zhì)分析方法原理與特點

2.1 血清蛋白的醋酸纖維薄膜電泳

該方法是利用帶電荷的膠體粒子在電場中移動的現(xiàn)象，用醋酸纖維薄膜作為支持物分離鑒定血清中多種蛋白質(zhì)的實驗方法。醋酸纖維薄膜由二乙酸纖維素制成，具有強(qiáng)滲透性，對分子移動無阻力等優(yōu)點。用醋酸纖維薄膜作為支持物的電泳方法具有樣品用量少、快速、方便、應(yīng)用范圍廣、分離清晰等優(yōu)點，實驗使用設(shè)備為低壓電泳儀和水平電泳槽。該實驗方法具備實驗操作簡單，藥品與設(shè)備成本低、微量快速等優(yōu)點，目前已廣泛應(yīng)用于血清蛋白、脂蛋白、血紅蛋白、糖蛋白和同功酶的分離以及免疫電泳。成為生物化學(xué)實驗課常用的實驗項目之一[3-4]。

2.2 微量凱氏定氮法

該方法作為最經(jīng)典的蛋白質(zhì)定量測定方法，目前廣泛應(yīng)用于食品、飼料加工、實驗研究等領(lǐng)域，在生物化學(xué)實驗教學(xué)中也是一種常用的實驗教學(xué)項目。微量凱氏定氮法是利用蛋白質(zhì)含氮量來測定蛋白質(zhì)含量的一種方法，被測的天然含氮化合物與98%濃硫酸在高溫(480 ℃以上)共熱時分解出氨，氨與硫酸反應(yīng)生成硫酸銨，該過程稱之為消化或消解。將消化后的溶液轉(zhuǎn)移至凱氏定氮儀中，然后加入強(qiáng)堿，使硫酸銨中的銨根離子釋放生成氨水。加熱至沸騰，用水蒸汽將氨蒸餾入2%硼酸等弱酸溶液中，然后再用標(biāo)準(zhǔn)稀鹽酸溶液進(jìn)行滴定，根據(jù)所測得的氨量即可計算樣品的含氮量。凱氏定氮法優(yōu)點是準(zhǔn)確性高，但耗時長，需要對樣品的高溫消煮至少需要3 h，用到濃硫酸、鹽酸等管控試劑，并且對測定樣品蛋白質(zhì)純度以及是否含尿素、三聚氰胺等含有氮元素的雜質(zhì)，有較高要求。針對以上問題雷紅等[5]提出了將實驗用蛋白質(zhì)樣品加入濃硫酸和硫酸銅催化劑后放置過夜再消化，減少消化時間的方法。張澤泉等[6]探討了利用乙酸鋅做沉淀劑，分離蛋白質(zhì)與非蛋白氮，再用凱氏定氮法測定蛋白含量的方法。該方法是目前較為經(jīng)典的蛋白質(zhì)定量測定的實驗方法。

2.3 紫外分光光度法

該方法是利用蛋白質(zhì)分子中苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸等芳香族氨基酸中的苯環(huán)結(jié)構(gòu)含有共軛雙鍵的特征，使得蛋白質(zhì)在280 nm紫外波長處具有吸收紫外線的性質(zhì)。在這個波長下，蛋白質(zhì)溶液的光吸收值與蛋白質(zhì)的濃度呈正比關(guān)系。因此可以利用已知含量的蛋白質(zhì)樣品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)定未知蛋白質(zhì)的含量。該方法測定蛋白質(zhì)含量的優(yōu)點是迅速、簡便、不消耗樣品，低濃度鹽類不干擾測定，但酸類物質(zhì)和醇類物質(zhì)均會影響紫外分光光度計法對小分子蛋白的測定[7]。在在蛋白質(zhì)的柱層析分離或者各種生物來源的酶的制備中得到廣泛應(yīng)用。此方法在使用過程中，對蛋白質(zhì)的種類和干擾物質(zhì)有一定的要求，一是對于不適合測定與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)酪氨酸和色氨酸含量差異較大的蛋白質(zhì)；二是若樣品中含有有共軛雙鍵的物質(zhì)，如各種核甘酸、富馬酸等吸收紫外線的物質(zhì)，則會出現(xiàn)較大的誤差。該方法不需要額外消耗藥品，使用儀器為分光光度計，其他器皿均為試管、移液器等簡單裝備，成本低廉且操作方便，該方法較為適用于一些成份比較單純的蛋白質(zhì)類物質(zhì)。

2.4 考馬斯亮蘭法

該方法是根據(jù)蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸與染料考馬斯亮藍(lán)相結(jié)合發(fā)生藍(lán)色反應(yīng)的原理設(shè)計的。考馬斯亮藍(lán)G-250有紅、藍(lán)兩種不同顏色的形式，在一定濃度的乙醇及酸性條件下，可配成淡紅色的溶液，當(dāng)與蛋白質(zhì)結(jié)合后，產(chǎn)生藍(lán)色化合物，反應(yīng)迅速而穩(wěn)定，化合物在595 nm處吸光值與蛋白濃度成正比，可用于計算蛋白的含量。該方法最低蛋白質(zhì)檢測量可達(dá)1 mg，蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物有更高的消光系數(shù)，反應(yīng)靈敏，實驗成本不高，是目前生物化學(xué)實驗教學(xué)中最常見的一種測定蛋白質(zhì)含量的方法。該方法盡管相對與其它方法來說干擾物質(zhì)較少，但由于每一種蛋白精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，導(dǎo)致蛋白質(zhì)與該染料的結(jié)合能力不同，所以標(biāo)準(zhǔn)品的選擇非常重要，在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時通常選用g-球蛋白或牛血清清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，以減少這方面的偏差?？捡R斯亮蘭法的突出優(yōu)點是：靈敏度高、干擾物質(zhì)少、測定快速、簡便，尤其適用于生物來源的蛋白質(zhì)的檢測。

2.5 聚丙烯酰胺凝膠電泳法

聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺和交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺催化劑過硫酸銨或核黃素的作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠，以此凝膠為支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳。用該種凝膠電泳可利用生物大分子攜帶電荷的多少、分子量的大小進(jìn)行分離。通過在電泳體系中加入陰離子表面活性劑的十二烷基磺酸鈉(簡稱SDS)，破壞蛋白質(zhì)分子中的氫鍵和疏水鍵，使蛋白質(zhì)變性，再加入強(qiáng)還原劑巰基乙醇打開蛋白質(zhì)分子內(nèi)的二硫鍵，解聚后的蛋白質(zhì)分子與SDS充分結(jié)合形成帶負(fù)電荷的復(fù)合物，消除蛋白質(zhì)所帶電荷的差異，使遷移率完全取決于蛋白質(zhì)的分子量，因此可用此法測得的蛋白質(zhì)的分子量，與用其它方法測得的分子量相比，誤差一般在±10%以內(nèi)，準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好。此方法雖然適用于大多數(shù)蛋白質(zhì)分子量的測定，但對于一些蛋白質(zhì)，如帶有較大輔基的蛋白質(zhì)、結(jié)構(gòu)蛋白和一些含二硫鍵較多的蛋白質(zhì)等是不適用的。該方法蛋白樣品用量較少，但所用的儀器裝置、藥品價格較高，屬于實驗成本較高的實驗。

2.6 蛋白質(zhì)的呈色反應(yīng)

蛋白質(zhì)中的某些共價鍵或氨基酸殘基中的某些化學(xué)基團(tuán)可以與某些特殊試劑形成特定的有色物質(zhì)，稱之為呈色反應(yīng)。該類反應(yīng)由于各種蛋白質(zhì)的氨基酸殘基有所差異，所以不同類的蛋白質(zhì)反應(yīng)后呈現(xiàn)的顏色也不完全一樣。而且，由于呈色反應(yīng)是蛋白質(zhì)側(cè)鏈基團(tuán)或者蛋白質(zhì)中的共價鍵導(dǎo)致的顏色，一些擁有類似基團(tuán)或共價鍵的非蛋白物質(zhì)往往也能呈現(xiàn)類似的顯色反應(yīng)。因蛋白質(zhì)為高分子物質(zhì)，鏈長和所含氨基酸殘基中的側(cè)鏈基團(tuán)數(shù)目有較大差異，顯色反應(yīng)很難對蛋白質(zhì)進(jìn)行定量測定，因此，這一類方法具有較大的局限性。常用的蛋白質(zhì)呈色反應(yīng)有雙縮脲反應(yīng)、茚三酮反應(yīng)和黃色反應(yīng)。雙縮脲反應(yīng)利用的是蛋白質(zhì)類物質(zhì)中氨基酸殘基鏈接時的肽鍵加熱至180 ℃可以縮合成一分子雙縮脲并釋放一份子氨的反應(yīng)，再利用雙縮脲在堿性溶液中與金屬銅離子結(jié)合生成紫紅色絡(luò)合物用于檢測。茚三酮反應(yīng)利用的是氨基酸的氨基與茚三酮共熱可產(chǎn)生紫色或黃色有色縮合物，因此可以用茚三酮定性檢測或定量檢測蛋白質(zhì)。黃色反應(yīng)則利用在蛋白質(zhì)分子中具有芳香環(huán)的酪氨酸和色氨酸殘基上的芳香環(huán)硝酸氧化，可轉(zhuǎn)變?yōu)殚冱S色的硝醌衍生物。多數(shù)蛋白質(zhì)分子含有帶苯環(huán)的氨基酸，所以有黃色反應(yīng)。

3 結(jié) 語

在科研實驗和工業(yè)生產(chǎn)中，蛋白質(zhì)分析方法還有很多，例如同位素示蹤質(zhì)譜法、免疫電泳、等電聚焦等方法均已在科學(xué)研究中有所應(yīng)用，但目前這些蛋白質(zhì)的分析方法在儀器、藥品等方面均成本較高、難以應(yīng)用于實驗教學(xué)。目前這些應(yīng)用于本科生實驗教學(xué)的蛋白質(zhì)分析方法，特點與應(yīng)用方向各有側(cè)重，可根據(jù)教學(xué)要求予以選擇。表2和表3匯總了這幾種蛋白質(zhì)分析方法的優(yōu)缺點與對不同專業(yè)實驗課程體系的支撐度。

表2 不同蛋白質(zhì)分析實驗項目的特點

表3 不同蛋白質(zhì)分析實驗項目對實踐能力支撐度

隨著國家對新工科建設(shè)的要求，培養(yǎng)適應(yīng)國民經(jīng)濟(jì)建設(shè)需要，具有解決復(fù)雜工程問題能力的新工科人才對實驗教學(xué)提出了新的要求[8]。在教學(xué)中合理運用各種不同的實驗方法，培養(yǎng)掌握不同技能的新工科人才，是目前生物化學(xué)實驗教學(xué)的重要教學(xué)改革方向。