申秋平,唐雨萌,沈靜怡,莊林林

江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院,江蘇 鎮(zhèn)江 212400

0 引言

豬圓環(huán)病毒(Porcine circovirus,PCV)可引起豬的生殖和呼吸道疾病、斷奶仔豬綜合征、皮炎和腎炎,給全球養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。目前,根據(jù)PCV基因組序列分析,PCV可分為4種類型:PCV1、PCV2、PCV3、PCV4。其中,PCV2是我國(guó)目前豬群流行的主要亞型,其感染途徑多樣、傳播速度較快。此外,該病毒易與其他豬源病毒(如豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬偽狂犬病病毒)等混合感染,給獸醫(yī)臨床診斷帶來(lái)較大難度[3]。因此,建立快速高效的PCV2檢測(cè)方法對(duì)于我國(guó)乃至世界養(yǎng)豬業(yè)均具有重要意義。

本文通過(guò)對(duì)近年來(lái)國(guó)內(nèi)外報(bào)道的PCV2快速檢測(cè)方法進(jìn)行綜述,以期為行業(yè)工作者科學(xué)防控PCV2提供可選的參考方法。

1 基于核酸的檢測(cè)方法

1.1 基于聚合酶鏈反應(yīng)的檢測(cè)方法

1.1.1 常規(guī)聚合酶鏈反應(yīng)

聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)是基于目標(biāo)基因序列設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物以實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)的一種核酸技術(shù),具有敏感、特異、結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。唐萬(wàn)壽 等[4]基于PCV2ORF1基因設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物,通過(guò)對(duì)反應(yīng)體系和條件進(jìn)行優(yōu)化建立了一種可快速檢測(cè)PCV2的PCR方法。該方法具有快速、靈敏、選擇性好等優(yōu)點(diǎn),適用于PCV2快速檢測(cè)。徐引弟 等[5]建立了一種直接PCR方法。在該方法中,組織樣品研磨后采用滅菌PBS緩沖液進(jìn)行稀釋并離心,取上清液即可直接用于PCR檢測(cè)。該方法最低可檢測(cè)到10-3稀釋度的模板,具有樣品處理簡(jiǎn)單、反應(yīng)快速等優(yōu)點(diǎn),整個(gè)過(guò)程可在1 h內(nèi)完成。

1.1.2 巢式PCR

巢式PCR(nested PCR,nPCR)又稱“套式PCR”,是基于PCR的一種改良方法,其基本原理與常規(guī)PCR相同,都是在體外進(jìn)行DNA擴(kuò)增。不同之處在于,該方法需要在常規(guī)PCR的基礎(chǔ)上多設(shè)計(jì)1對(duì)引物,并將PCR反應(yīng)分為2個(gè)步驟進(jìn)行:第1步反應(yīng)基于外引物擴(kuò)增出1個(gè)較長(zhǎng)的DNA片段;第2步反應(yīng)則用1對(duì)內(nèi)引物在第1步PCR產(chǎn)物的內(nèi)部區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增,從而得到1個(gè)更短的靶基因擴(kuò)增產(chǎn)物。這種方法可以有效減少非特異性擴(kuò)增,同時(shí)提高PCR方法的敏感性。靳玉芬 等[6]對(duì)可疑病料進(jìn)行PCR擴(kuò)增并構(gòu)建質(zhì)粒,建立了一種套式PCR方法,可用于PCV2臨床檢測(cè)。該方法最低可檢測(cè)到10 μL的陽(yáng)性細(xì)胞培養(yǎng)物,且具有良好的特異性和可重復(fù)性。夏嘉鑫 等[7]通過(guò)正交試驗(yàn)篩選出優(yōu)選反應(yīng)體系,建立了一種PCV2單管巢式PCR方法。該方法具有高度特異性,針對(duì)DBN-SX07和ZJ/c株的檢測(cè)限分別為0.6×10-6和0.6×10-3ng。

1.1.3 熒光定量PCR

熒光定量PCR(fluorescent quantitative PCR,qPCR)是一種通過(guò)在PCR反應(yīng)體系中加入熒光標(biāo)記的探針或染料進(jìn)行目標(biāo)DNA定量檢測(cè)的核酸技術(shù)。熒光定量PCR具有高靈敏度、特異性和準(zhǔn)確性等優(yōu)點(diǎn),已廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)、病原體檢測(cè)、遺傳疾病診斷等領(lǐng)域。馮華 等[8]以PCV2ORF2為靶基因建立了一種基于SYBR Green的qPCR方法,并對(duì)該方法的引物濃度、退火溫度等進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明,該方法的檢測(cè)限可達(dá)3.0×102copies/mL,比常規(guī)PCR低2個(gè)數(shù)量級(jí)。經(jīng)臨床樣品驗(yàn)證,該方法檢出率高于常規(guī)PCR,更適于PCV2早期診斷?；谙嗤幕?吳曉燕 等[9]建立的qPCR方法檢測(cè)限達(dá)10 copies/μL,且批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)均小于2.5%。吳佳鑫[10]使用TaqMan探針建立的qPCR方法最低可檢測(cè)到濃度為10 copies/μL的模板,且具有良好的特異性和重復(fù)性。Vilcek et al.[11]利用熒光標(biāo)記的引物(light upon extention)開(kāi)發(fā)了一種可用于高敏檢測(cè)PCV2的qPCR方法。經(jīng)優(yōu)化后,該檢測(cè)方法可檢測(cè)到20 copies的PCV2 DNA。同時(shí),最佳定量分析范圍為2×102～2×107copies。

1.1.4 多重PCR

多重PCR(multiplex PCR,mPCR)是一種同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)目標(biāo)DNA片段的PCR技術(shù)。在該技術(shù)中,多對(duì)特異性引物被設(shè)計(jì)用于識(shí)別并擴(kuò)增不同的目標(biāo)序列。這使得在一個(gè)反應(yīng)中可以檢測(cè)多個(gè)基因或變異。多重PCR具有高通量、節(jié)省時(shí)間和成本等優(yōu)點(diǎn)。值得注意的是,多重PCR的優(yōu)化和引物設(shè)計(jì)相對(duì)復(fù)雜,需要避免引物間的非特異性結(jié)合和擴(kuò)增偏差。Zhang et al.[12]建立了一種基于TaqMan探針的多重qPCR/RT-qPCR方法用于檢測(cè)常見(jiàn)的豬病毒和細(xì)菌。該方法以雙管形式在反應(yīng)中可同時(shí)檢測(cè)4種病毒和4種細(xì)菌。通過(guò)使用每種病毒和細(xì)菌的質(zhì)粒優(yōu)化反應(yīng)組分,提高了該方法的靈敏度、特異性和重現(xiàn)性。其中針對(duì)PCV2的檢測(cè)限為4.74×102copies,比常規(guī)PCR低10倍。謝燕婷 等[13]基于豬偽狂犬病毒(Porcine pseudorabies virus,PRV)gB、PCV2ORF2和豬細(xì)小病毒(Porcine parvovirus,PPV)VP2基因保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物,建立了一種可快速檢測(cè)PRV、PCV2與PPV的mPCR方法。其中,該方法針對(duì)PCV2的檢測(cè)限為1.47×106ng,且與其他豬病毒無(wú)交叉反應(yīng)性,適于臨床上PCV2混合感染的快速診斷。

1.1.5 納米PCR

納米PCR(nano-PCR)技術(shù)是一種結(jié)合納米材料的PCR技術(shù)。在這個(gè)方法中,納米顆粒(如金納米顆粒、磁性納米顆粒等)由于其高比表面積、優(yōu)異的光學(xué)性能和高熱傳導(dǎo)性等優(yōu)點(diǎn),可被用作PCR反應(yīng)的助劑,以提高PCR的特異性、敏感性以及擴(kuò)增效率等。其中,金納米粒子還可作為熱穩(wěn)定劑,提高PCR反應(yīng)的熱穩(wěn)定性。目前,nano-PCR技術(shù)在基因檢測(cè)、病原篩查等方面已有相關(guān)應(yīng)用。梁琳 等[14]建立了一種同時(shí)檢測(cè)PCV2和PCV3的雙重nano-PCR方法,該方法具有良好的特異性,對(duì)PCV2和PCV3的檢測(cè)限分別為93.2、91.6 copies/μL,比常規(guī)PCR低2個(gè)數(shù)量級(jí)。沈鶴柏 等[15]研究同樣證明基于金納米顆粒的nano-PCR效果優(yōu)于常規(guī)PCR。

1.1.6 數(shù)字PCR

數(shù)字PCR(digital PCR,dPCR)技術(shù)是一種高靈敏度和精確度的分子生物學(xué)技術(shù),可檢測(cè)到樣品中極低濃度的DNA或RNA分子。數(shù)字PCR先將樣品分離成數(shù)千個(gè)微小的反應(yīng)單元,每個(gè)區(qū)域只包含1個(gè)或0個(gè)目標(biāo)分子,然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增,最終通過(guò)檢測(cè)每個(gè)單元中的熒光信號(hào)來(lái)確定目標(biāo)分子的數(shù)量。相比于qPCR,dPCR可以更準(zhǔn)確地檢測(cè)出目標(biāo)分子的數(shù)量,適用于分子拷貝數(shù)低、樣品差以及含有雜質(zhì)的樣品等。按照獨(dú)立單元的實(shí)現(xiàn)方式來(lái)劃分,dPCR可分為微滴數(shù)字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)和微滴芯片數(shù)字PCR(crystal digital PCR,cdPCR)。趙珊[16]根據(jù)PCV2ORF2基因設(shè)計(jì)引物及探針,對(duì)反應(yīng)溫度優(yōu)化后建立了qPCR和ddPCR 2種方法。試驗(yàn)表明,2種方法在靶標(biāo)濃度為12.5～9.85×105copies/μL區(qū)間時(shí)均具有良好的線性關(guān)系。其中,ddPCR的檢測(cè)限約為25 copies/μL,且具有更寬的動(dòng)態(tài)檢測(cè)范圍。使用ddPCR方法檢測(cè)PCV1、PRV、PPV、豬瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)以及豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV),結(jié)果均呈陰性。吳朦晨[17]根據(jù)PCV2基因序列設(shè)計(jì)特異性探針和引物,建立了ddPCR和三重cdPCR方法。其中,ddPCR的檢測(cè)限為2.93 copies/μL,比qPCR的靈敏度高10倍,且對(duì)飼料樣品的檢測(cè)更加敏感,對(duì)復(fù)雜成分樣品具有較好的適應(yīng)性。三重cdPCR則可同時(shí)檢測(cè)PCV1、PCV2、PCV3。標(biāo)準(zhǔn)曲線顯示,該方法可特異性檢測(cè)3種病毒,且具有較高的擴(kuò)增效率和相關(guān)性。該方法對(duì)PCV2質(zhì)粒樣品的檢測(cè)限為12.29 copies/μL。

1.1.7 微納米材料在PCR樣品制備中的應(yīng)用

微納米材料(micro/nano materials)具有尺寸小、比表面積大、形貌可控等優(yōu)異特性。在PCR樣品制備中,微納米材料如磁性珠或金納米顆粒可以作為模板提取的載體,通過(guò)特定的表面化學(xué)修飾,可以選擇性地捕獲目標(biāo)DNA分子,快速而高效地純化樣品中的目標(biāo)DNA,從而提高PCR檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確度。Huang et al.[18]使用涂有PCV2特異性DNA探針的磁性微粒從樣品中富集PCV2 DNA,然后加入PCV2特異性寡核苷酸修飾的金納米顆粒形成夾心核酸復(fù)合物。復(fù)合物形成后,寡核苷酸被釋放并通過(guò)PCR進(jìn)行擴(kuò)增。該方法針對(duì)PCV2 DNA和血清樣本的檢測(cè)限分別為2、10 copies,比常規(guī)PCR低約500倍。該方法對(duì)所有的PCV2基因型都有很寬的檢測(cè)范圍,并且具有可靠的重復(fù)性。同時(shí),該方法與其他豬相關(guān)病毒無(wú)交叉反應(yīng),包括PCV1、PRV、PRRSV和CSFV等。經(jīng)臨床樣本驗(yàn)證,該方法的檢出率高于常規(guī)PCR和qPCR,在評(píng)估臨床樣品的病毒載量方面具有應(yīng)用價(jià)值。

1.2 核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

1.2.1 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是2000年由Notomi et al.[19]提出的一種基于鏈置換DNA聚合酶的核酸擴(kuò)增技術(shù),可以在等溫條件下(通常60～65 ℃)高效擴(kuò)增目標(biāo)DNA序列。LAMP技術(shù)通過(guò)使用2～3對(duì)引物識(shí)別目標(biāo)DNA的6～8個(gè)區(qū)域,可有效增加反應(yīng)的特異性。此外,LAMP技術(shù)也可以檢測(cè)低濃度的靶基因,靈敏度比常規(guī)PCR高1～2個(gè)數(shù)量級(jí)[20]。Zhao et al.[21]基于PCV2ORF2基因設(shè)計(jì)引物建立了一種可用于PCV2檢測(cè)的LAMP方法。該方法對(duì)PCV2的檢測(cè)限為10 copies,比常規(guī)PCR低2個(gè)數(shù)量級(jí)。同時(shí),該方法與PCV1、PRRSV、豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒以及輪狀病毒等無(wú)交叉反應(yīng)性。謝志勤 等[22]基于CSFVE2和PCV2ORF2基因設(shè)計(jì)引物和探針,建立二重?zé)晒釲AMP方法以快速區(qū)分CSFV和PCV2。通過(guò)對(duì)CSFV和PCV2探針?lè)謩e標(biāo)記不同的熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán),即可根據(jù)不同熒光判斷檢測(cè)結(jié)果。試驗(yàn)分析表明,該方法可特異性檢測(cè)CSFV和PCV2,檢測(cè)限均為100 copies/μL。Lei et al.[23]利用LAMP無(wú)需特殊設(shè)備以及CRISPR/Cas12a系統(tǒng)能夠切割單鏈DNA的特性,建立了一種快速有效的PCV2檢測(cè)方法。經(jīng)過(guò)一系列反應(yīng)條件優(yōu)化后,該LAMP-CRISPR方法的檢測(cè)限達(dá)1 copies/μL,且可在1 h完成,并實(shí)現(xiàn)結(jié)果可視化。張琪 等[24]通過(guò)優(yōu)化LAMP試劑盒檢測(cè)性能,建立了一種可用于PCV2現(xiàn)場(chǎng)可視化定性檢測(cè)的LAMP方法。利用該方法可在40 min內(nèi)可檢測(cè)到最低5 copies/μL的PCV2 DNA。同時(shí)該方法具有特異性強(qiáng)、簡(jiǎn)單實(shí)用、儀器簡(jiǎn)單等特點(diǎn),有望應(yīng)用于臨床診斷。

1.2.2 重組酶介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)

重組酶介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)(recombinase aided amplification,RAA)是一種基于重組酶、DNA聚合酶、單鏈結(jié)合蛋白等共同作用在恒溫條件下(37～42 ℃)進(jìn)行核酸高效擴(kuò)增的分子技術(shù)。范樂(lè)佳[25]將RAA與CRISPR/Cas系統(tǒng)結(jié)合,建立了一種可快速、精準(zhǔn)檢測(cè)PCV2的方法。該方法有效簡(jiǎn)化了樣品處理和操作步驟,可在30 min內(nèi)完成檢測(cè)。同時(shí),該方法的檢測(cè)限為10 copies/μL,比PCR方法低3個(gè)數(shù)量級(jí)。經(jīng)52份臨床樣品檢測(cè)驗(yàn)證,該方法檢測(cè)結(jié)果與PCR的符合度為98%,表明該方法適用于臨床PCV2檢測(cè)。

1.2.3 重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)

重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)(recombinase polymerase amplification,RPA)利用重組酶、DNA聚合酶、單鏈DNA結(jié)合蛋白等,通過(guò)引物引導(dǎo)DNA擴(kuò)增,可在等溫條件下將目標(biāo)DNA序列擴(kuò)增至數(shù)量足以檢測(cè)的水平。Wang et al.[26]基于PCV2ORF2基因設(shè)計(jì)特異性引物和exo探針建立了一種可實(shí)時(shí)檢測(cè)PCV2的RPA方法。檢測(cè)可在38 ℃、20 min內(nèi)完成,靈敏度為103 copies,且與豬其他常見(jiàn)病原無(wú)交叉反應(yīng)。基于同樣的靶基因,Yang et al.[27]建立實(shí)時(shí)熒光RPA和結(jié)合RPA與側(cè)向?qū)游鲈嚰?lateral flow dipstick,LFD)的RPA-LFD方法進(jìn)行PCV2快速檢測(cè)。結(jié)果表明,RPA可在37 ℃、20 min內(nèi)完成擴(kuò)增。實(shí)時(shí)RPA和RPA-LFD方法的靈敏度均為102copies,且均具有高度特異性。進(jìn)一步地,陳思楠 等[28]根據(jù)PCV2Cap基因建立的基于側(cè)向?qū)游鲈嚰埖腞PA方法可在5 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)可視化檢測(cè)。同時(shí),該方法檢測(cè)限為10 copies/μL,且具有高度特異性。Wang et al.[29]基于Cas12a在切割目標(biāo)dsDNA后會(huì)以非特異性的方式繼續(xù)切割ssDNA這一原理,通過(guò)RPA擴(kuò)增的目標(biāo)序列被Cas12a和crRNA切割以激活Cas12a的反切活性。由于G-四鏈體ssDNA被活化的Cas12a切割,不能形成空間結(jié)構(gòu),失去氧化酶活性。當(dāng)沒(méi)有靶序列時(shí),G-四鏈體ssDNA不會(huì)被Cas12a切割。完整的具有氧化酶活性的G-四鏈體和血紅素相結(jié)合以催化TMB顯色。因此,檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性呈無(wú)色,陰性呈藍(lán)色。該方法檢測(cè)PCV2的靈敏度為103copies,且可以實(shí)現(xiàn)可視化和無(wú)標(biāo)簽的PCV2現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè),無(wú)需依賴儀器和電源。該方法為PCV2鑒定提供了一種新的選擇,有望應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)即時(shí)診斷。

1.3 基因芯片技術(shù)

基因芯片(gene chip)檢測(cè)是以DNA分子雜交為原理的生物分析技術(shù)。芯片上含有大量DNA探針的固定陣列,每個(gè)探針均可用于檢測(cè)特定序列,因此可實(shí)現(xiàn)對(duì)生物樣品中大量基因的高通量和高效率分析。姜永厚 等[30]基于PCV復(fù)制酶基因保守序列成功建立了一種可用于區(qū)分檢測(cè)PCV1和PCV2的芯片。該方法可以檢測(cè)到的最低約4×108copies/μL的PCR產(chǎn)物以及0.15 μg/L的PCV2重組質(zhì)粒。肖馳 等[31]研制的三重DNA芯片可用于同時(shí)檢測(cè)CSFV、PRRSV和PCV2混合感染。該芯片具有特異性強(qiáng)、靈敏度高和可重復(fù)利用等優(yōu)點(diǎn)。

1.4 原位雜交技術(shù)

原位雜交技術(shù)(in situ hybridization,ISH)是基于外源核酸(探針)與待測(cè)DNA或RNA以顯示該核酸所在位置的分子技術(shù)。該技術(shù)敏感性較強(qiáng),可以準(zhǔn)確定位到細(xì)胞或組織中特定的DNA或RNA序列。姚鑫 等[32]利用高辛標(biāo)記的核酸探針建立了一種PCV2 ISH檢測(cè)方法,最低可檢測(cè)到1.78 pg的病毒DNA。應(yīng)用該方法對(duì)人工感染PCV2的豬組織進(jìn)行檢測(cè),可以發(fā)現(xiàn)PCV2最早侵染和滯留的組織。結(jié)果表明該方法可以準(zhǔn)確反映病毒在組織中的狀態(tài)與細(xì)胞的分布,對(duì)PCV2的早期診斷具有應(yīng)用價(jià)值。

1.5 液相芯片系統(tǒng)

液相芯片系統(tǒng)(flexible multi-analyte profiling,xMAP)是基于微球體懸浮芯片的一種生物芯片技術(shù)。它是在不同熒光編碼的微球上進(jìn)行多種結(jié)合反應(yīng)及核酸雜交,通過(guò)不同激光分別檢測(cè)微球編碼和報(bào)告熒光以實(shí)現(xiàn)定量[33]。王晶鈺 等[34]聯(lián)合不對(duì)稱二重PCR和液相芯片系統(tǒng),建立了一種可同時(shí)檢測(cè)PPV和PCV2的方法。該芯片特異性良好,針對(duì)PCV2的檢測(cè)限為2.58×102copies,且臨床樣品檢測(cè)結(jié)果與PCR方法一致。

2 免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)

2.1 免疫膠體金技術(shù)

免疫膠體金技術(shù)(immunocolloidal gold techniques)是一種用于檢測(cè)生物分子(如蛋白質(zhì)、抗體等)的簡(jiǎn)單、快速的方法。該技術(shù)基于免疫反應(yīng)原理,將目標(biāo)分子與適當(dāng)?shù)目贵w結(jié)合,然后使用膠體金顆粒標(biāo)記另一種抗體來(lái)檢測(cè)這個(gè)復(fù)合物。該技術(shù)通常通過(guò)裸眼觀察膠體金顆粒的顏色變化來(lái)診斷結(jié)果,具有操作簡(jiǎn)單、快速和成本可控等優(yōu)點(diǎn)[35]。時(shí)建立 等[36]采用膠體金顆粒建立了一種檢測(cè)PCV2抗體的免疫層析試紙。試驗(yàn)結(jié)果表明,該試紙只與PCV2陽(yáng)性血清發(fā)生反應(yīng),最低可檢出100倍稀釋的陽(yáng)性血清,具有較好的特異性和靈敏度。

2.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)是一種常用的免疫檢測(cè)方法。該技術(shù)利用抗原與抗體反應(yīng),通過(guò)酶催化底物進(jìn)行顯色從而實(shí)現(xiàn)抗體或抗原的檢測(cè)分析。ELISA操作簡(jiǎn)單、快速、重復(fù)性好,目前已廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、生物學(xué)等領(lǐng)域中的診斷和監(jiān)測(cè)等研究。葛猛 等[37]制備可溶性的Cap重組蛋白作為診斷抗原,建立了一種間接ELISA抗體檢測(cè)方法。該方法可以檢測(cè)到稀釋100倍的PCV2陽(yáng)性血清,且可重復(fù)性好,對(duì)394份血清的檢測(cè)結(jié)果與臨床診斷相符。陳清清 等[38]基于PCV2 Rep建立間接ELISA抗體檢測(cè)方法。該方法采用大腸桿菌原核表達(dá)獲得的重組PCV2 Rep蛋白,純化后的抗原可以被PCV2抗體陽(yáng)性血清特異性識(shí)別,具有良好的免疫反應(yīng)性。同時(shí),該方法具有較好的特異性,且可有效鑒別自然感染以及疫苗免疫豬只。Han et al.[39]通過(guò)使用PCV2病毒顆粒作為包被抗原和PCV2單克隆抗體作為競(jìng)爭(zhēng)抗體來(lái)建立競(jìng)爭(zhēng)性ELISA。該方法表現(xiàn)出良好的特異性和可重復(fù)性,有助于簡(jiǎn)單地檢測(cè)豬血清樣品中的PCV2特異性抗體,而不受PCV1抗體干擾,可用于評(píng)估PCV2抗體水平。Yang et al.[40]利用噬菌體展示技術(shù),從1只PCV2-Cap蛋白免疫的雙峰駝身上篩選出19個(gè)抗PCV2-Cap蛋白納米抗體?；诩{米抗體(Nb)-辣根過(guò)氧化物酶(HRP)融合蛋白平臺(tái)表達(dá)PCV2-Nb15-HRP構(gòu)建了一種競(jìng)爭(zhēng)性ELISA方法以快速檢測(cè)PCV2抗體[41]。分析表明,該ELISA的臨界值為20.72%。經(jīng)360份豬血清樣本驗(yàn)證,建立的ELISA和商業(yè)試劑盒相比,靈敏度和特異性分別為99.68%和95.92%,且2種方法的重合率為99.17%。

2.3 瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)

瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)(agargel precipitation test,AGPT)是一種常用的免疫學(xué)試驗(yàn)方法。該方法利用抗原與抗體之間的特異性反應(yīng),在瓊脂板上形成不可溶性復(fù)合物,通過(guò)測(cè)量復(fù)合物的直徑或面積來(lái)判斷待檢測(cè)物質(zhì)是否存在或濃度大小。瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)操作簡(jiǎn)單、成本低廉,但分辨率和準(zhǔn)確性有限,適用于檢測(cè)大分子物質(zhì)如蛋白質(zhì)等。苗麗娟 等[42]以PCV2 Cap蛋白為抗原建立瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)方法。該方法具有較好的特異性和穩(wěn)定性,與膠體金試紙條檢測(cè)結(jié)果符合率達(dá)到94.1%,可用于臨床檢測(cè)。莊金秋 等[43]制備出兔抗PCV2 Cap蛋白多克隆抗體,建立了可用于Cap蛋白效價(jià)測(cè)定的瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)方法。由于抗原成分單一,免疫效率大大提升,也避免了用全病毒作為免疫原制備抗體過(guò)程中的大量繁瑣工作和結(jié)果的不確定性,有望代替PCV2標(biāo)準(zhǔn)抗體以用于臨床檢測(cè)。

2.4 斑點(diǎn)測(cè)定法

斑點(diǎn)測(cè)定法(spot assay)是一種常用的快速、便捷且經(jīng)濟(jì)的免疫檢測(cè)方法,可用于檢測(cè)多種生物分子如蛋白質(zhì)、抗體等。它基于抗原與相應(yīng)抗體之間的特異性結(jié)合反應(yīng),通過(guò)標(biāo)記在試紙或膜上的單克隆或多克隆抗體來(lái)檢測(cè)樣本中的目標(biāo)分子。該方法具有操作簡(jiǎn)便、快速、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)。Fossum et al.[44]建立了一種PCV2斑點(diǎn)測(cè)定法(PCV2-SPOT)以計(jì)數(shù)從自然感染的豬獲得的分泌病毒的淋巴細(xì)胞。該檢測(cè)方法的原理與常規(guī)斑點(diǎn)檢測(cè)法相似,將PCV2顆粒固定化并作為濾色斑檢測(cè)。該方法為半定量檢測(cè)感染豬細(xì)胞釋放的PCV2病毒顆粒提供了可選方法支持。

2.5 表面等離子體共振技術(shù)

表面等離子體共振技術(shù)(surface plasmon resonance,SPR)是一種基于光學(xué)原理的快速分析技術(shù)。在恒定光源波長(zhǎng)和金屬薄表面的條件下,SPR角取決于金屬表面附近材料的折射率。當(dāng)生物分子與金屬表面相互作用時(shí),會(huì)改變金屬薄膜的折射率,從而影響到SPR波長(zhǎng)的位置和強(qiáng)度,這種改變可以被SPR儀器檢測(cè)到,并轉(zhuǎn)化為生物分子之間的相互作用強(qiáng)度和動(dòng)力學(xué)參數(shù)[45]。Hu et al.[46]以表面等離子體共振(SPR)技術(shù)為基礎(chǔ),結(jié)合免疫學(xué)技術(shù),通過(guò)在金膜上修飾PCV2抗體并對(duì)生物傳感器進(jìn)行化學(xué)處理,建立了一種敏感、無(wú)標(biāo)記、實(shí)時(shí)檢測(cè)PCV2的方法。該方法最低可檢測(cè)到樣品中濃度為0.04 μg/mL的PCV2,回收率介于81.0%～89.3%,且在寬濃度范圍內(nèi)具有較好的線性響應(yīng)(R2為0.996 25)。該方法可靠、穩(wěn)定,為直接檢測(cè)PCV2提供了一種新的工具支持。

3 結(jié)束語(yǔ)

基于核酸的檢測(cè)技術(shù)和免疫學(xué)技術(shù)的發(fā)展為PCV2快速檢測(cè)提供了重要工具和技術(shù)支持。這2種檢測(cè)技術(shù)分別通過(guò)檢測(cè)病毒核酸和特異性免疫反應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)PCV2檢測(cè)。2類檢測(cè)方法各有優(yōu)缺點(diǎn),如:基于PCR的方法結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏度高、特異性強(qiáng),但這類方法均需要借助熱循環(huán)儀且操作要求較高;核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)為PCV2現(xiàn)場(chǎng)即時(shí)檢測(cè)提供了可選工具支持,但目前相關(guān)方法在技術(shù)成熟度上仍需要完善,難以廣泛應(yīng)用;免疫學(xué)檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)單、快速,但在靈敏度、特異性等方面仍有待提升。

隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展,未來(lái)PCV2快速檢測(cè)方法的潛在發(fā)展方向包括但不限于以下3個(gè)方面:①可視化檢測(cè)?；赑CV2現(xiàn)場(chǎng)(欄邊)即時(shí)檢測(cè)需求,支持裸眼觀察或簡(jiǎn)單設(shè)備讀取結(jié)果、無(wú)需復(fù)雜儀器和操作的檢測(cè)技術(shù)將得到不斷優(yōu)化和發(fā)展,有望開(kāi)發(fā)出更加靈敏、快速、高效的檢測(cè)方法。②便攜式檢測(cè)系統(tǒng)。開(kāi)發(fā)便攜式PCV2快速檢測(cè)系統(tǒng),包括一體化PCR及恒溫檢測(cè)儀、手持式核酸/蛋白分析儀等,提高快速、精準(zhǔn)檢測(cè)PCV2的能力和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)水平。③高通量檢測(cè)。針對(duì)PCV2易與其他多種病毒共感染的特點(diǎn),期待未來(lái)能發(fā)展出更高通量的檢測(cè)方法,提高多種病毒混合感染的檢測(cè)能力,為養(yǎng)豬業(yè)的可持續(xù)發(fā)展提供有力技術(shù)保障。