喻帥克羅茂麗王連睿周天豹苗明三白 莉

(河南中醫(yī)藥大學(xué),鄭州 450046)

骨肉瘤(Osteosarcoma,OS)是骨組織常見的原發(fā)性惡性腫瘤,全球發(fā)病率每一百萬人約有4 人,好發(fā)于15 ～19 歲的青少年[1-3],主要表現(xiàn)為疼痛、腫塊、跛行等,具有高轉(zhuǎn)移性、預(yù)后差、病情發(fā)展迅速等特點(diǎn)[4-6]。 OS 現(xiàn)代治療多采用放療、化療、根治性手術(shù)切除和晚期截肢[7-8],多方法結(jié)合治療雖然可以抑制癌細(xì)胞增殖和減少轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn),卻為機(jī)體帶來不可逆損傷和殘疾,化療毒性和耐藥性導(dǎo)致機(jī)體免疫下降,加深了患者的痛苦[9-12]。 因此,對(duì)OS 的發(fā)病機(jī)制,以及有效的治療方法和藥物進(jìn)行更深入的研究是非常有必要的,而穩(wěn)定可靠的動(dòng)物模型是開展OS 相關(guān)研究的關(guān)鍵和基礎(chǔ)。 OS 動(dòng)物模型應(yīng)用于骨肉瘤相關(guān)研究已有較長的歷史,創(chuàng)造了多種可行的造模方式,例如病毒誘導(dǎo)模型[13]、輻射誘導(dǎo)模型[14]、腫瘤移植模型[15]等,但相關(guān)文獻(xiàn)缺少統(tǒng)一的模型制備及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。 本文將通過對(duì)骨肉瘤動(dòng)物模型研究的文獻(xiàn)進(jìn)行歸納分析,探討模型動(dòng)物的選擇、造模方法、主要檢測指標(biāo)等,以期為骨肉瘤動(dòng)物模型的完善提供方法學(xué)參考。

1 材料和方法

1.1 資料來源

在中國知網(wǎng)(CNKI)、萬方數(shù)據(jù)庫知識(shí)服務(wù)平臺(tái)(Wanfang)中以“骨肉瘤”“動(dòng)物”為主題詞進(jìn)行檢索,鎖定檢索年限2000 年1 月～2022 年10 月,在PubMed 數(shù) 據(jù) 庫 以“(osteosarcoma) AND (animal model)”進(jìn)行檢索,檢索時(shí)間范圍均設(shè)置為2019 年10 月～2022 年10 月。 其中中國知網(wǎng)數(shù)據(jù)庫檢索出相關(guān)期刊文獻(xiàn)1478 篇、萬方數(shù)據(jù)庫799 篇、PubMed數(shù)據(jù)庫檢索文獻(xiàn)227 篇,文獻(xiàn)總數(shù)為2504 篇。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn):選擇具有骨肉瘤動(dòng)物模型應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)性期刊文獻(xiàn),排除標(biāo)準(zhǔn):(1)會(huì)議性文獻(xiàn)、碩博士學(xué)位論文、綜述類文獻(xiàn)、理論研究類文獻(xiàn);(2)未明確記錄造模方法或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物種類的文獻(xiàn);(3)數(shù)據(jù)庫之間重復(fù)的文獻(xiàn)。

1.3 數(shù)據(jù)規(guī)范

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物名稱、種類等均參照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)技術(shù)》[16]進(jìn)行規(guī)范總結(jié)。

1.4 數(shù)據(jù)處理及分析

將納入標(biāo)準(zhǔn)的284 篇文獻(xiàn)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種類、性別、造模方法、癌細(xì)胞種類、檢測指標(biāo)等數(shù)據(jù)錄入Excel 表,建立骨肉瘤動(dòng)物模型數(shù)據(jù)庫。 使用Microsoft Excel 2016 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理與分析。

2 結(jié)果

2.1 文獻(xiàn)篩選結(jié)果

初次檢索到文獻(xiàn)2504 篇,排除不符合標(biāo)準(zhǔn)以及重復(fù)的文獻(xiàn),最終篩選得到符合標(biāo)準(zhǔn)的文獻(xiàn)284 篇,建立數(shù)據(jù)庫。 分析數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)OS 動(dòng)物模型使用頻數(shù)為302 例,一篇文獻(xiàn)中出現(xiàn)兩次及以上OS 模型的原因是比較不同造模方法[17],以及癌細(xì)胞株種類原因[18-19]引起的藥效差異和模型成功率差異。

2.2 骨肉瘤造模動(dòng)物種類

將284 篇文獻(xiàn)中使用的動(dòng)物種類進(jìn)行統(tǒng)計(jì),共有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物15 類[20-26]。 其中使用頻次＞10 的共有3 種,使用最多的為BALB/c-nu/nu 裸鼠(227 例,75.17%),其次為SD 大鼠(20 例,6.62%)和C3H小鼠(11 例,3.64%)。 動(dòng)物年齡多為(4 ～6)周齡、(6～8)周齡,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物性別選擇以雌性為主,共101例,占比35.94%,其次為雄性(99 例,35.23%),雌雄各半(81 例,28.83%)(21 篇文獻(xiàn)未注明性別情況,故不計(jì)入統(tǒng)計(jì)),動(dòng)物種類分布情況見表1。

表1 骨肉瘤模型動(dòng)物種類Table 1 Osteosarcoma model animal species

2.3 骨肉瘤動(dòng)物模型造模方法

統(tǒng)計(jì)納入標(biāo)準(zhǔn)的284 篇文獻(xiàn)中骨肉瘤動(dòng)物模型的造模方法,發(fā)現(xiàn)異位移植法使用頻數(shù)為230 例,原位移植法為72 例,且異位移植模型以細(xì)胞液移植為主。 異位移植法中背部皮下移植(66 例,21.85%)最多,其次為腋部皮下移植(55 例,18.21%)、后肢皮下移植(41 例,13.58%);原位移植法是接種在股骨遠(yuǎn)端或脛骨近端的骨髓腔,其中細(xì)胞液移植(51例,16.89%)、組織塊移植(21 例,6.95%)。 細(xì)胞液移植法中明確表明細(xì)胞數(shù)量的有242 例,多選擇1×107/mL 或1×106/mL 癌細(xì)胞濃度注射;瘤組織塊移植法中瘤組織直徑以1～2 mm 大小為主。 詳細(xì)造模情況見表2、表3。

表2 骨肉瘤動(dòng)物模型造模方法Table 2 Methods for the animal model of osteosarcoma

表3 細(xì)胞液移植法癌細(xì)胞濃度Table 3 Cancer cell concentrations by cell fluid transplantation

2.4 骨肉瘤動(dòng)物模型造模癌細(xì)胞株種類

在納入的284 篇文獻(xiàn)中,癌細(xì)胞種類使用頻次＞15 的有5 種,分別是人源骨肉瘤MG-63 細(xì)胞100例,鼠源骨肉瘤UMR-106 細(xì)胞39 例、人源骨肉瘤143B 細(xì)胞31 例、患者腫瘤細(xì)胞混懸液23 例、人源骨肉瘤U2OS 細(xì)胞17 例。 詳細(xì)分布見表4。

表4 骨肉瘤動(dòng)物模型造模癌細(xì)胞株種類Table 4 Type of molded cancer cell lines in animal models of osteosarcoma

2.5 骨肉瘤動(dòng)物模型檢測指標(biāo)

統(tǒng)計(jì)納入標(biāo)準(zhǔn)的284 篇文獻(xiàn)中骨肉瘤動(dòng)物模型的檢測指標(biāo),若檢測指標(biāo)為同一組織的多個(gè)同類型指標(biāo),則歸為一類,不再分開統(tǒng)計(jì)[27],如血清中同時(shí)檢測TNF-α、IL-6、VEGF、IL-2 水平等;若同一組織被分成不同種類的檢測指標(biāo),則分別統(tǒng)計(jì),如腫瘤組織在同一動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中既檢測腫瘤組織免疫組化又檢測腫瘤組織病理。 且因同一文獻(xiàn)中,不同造模方法的檢測指標(biāo)相同,故檢測指標(biāo)百分比通過納入文獻(xiàn)數(shù)量計(jì)算。 其中頻數(shù)＞50 的有5 項(xiàng),檢測最多的為腫瘤組織表觀指標(biāo):腫瘤大小、瘤徑、個(gè)數(shù)、重量等(238 例,83.80%);腫瘤組織HE 病理染色(129 例,45.42%);動(dòng)物表觀指標(biāo):體重、毛發(fā)、飲食、活動(dòng)狀態(tài)等(94 例,33.10%);腫瘤組織免疫組化: VEGF、 Bax、 Bcl-2、 Caspase-3、 NF-κB、 CD34、CD31、HIF-1α、Ki67 等(89 例,31.34%);抑瘤率(71例,25.00%)。 骨肉瘤動(dòng)物模型檢測指標(biāo)詳情見表5。

表5 骨肉瘤動(dòng)物模型檢測指標(biāo)Table 5 Test indexes of the animal model of osteosarcoma

3 討論

骨肉瘤有兩個(gè)高發(fā)期,一個(gè)是兒童及青少年時(shí)期,多原發(fā)性發(fā)于長骨的干骺端, 以股骨遠(yuǎn)端及脛骨近端最為常見[28-29],可能與骨的生長活動(dòng)有關(guān)[30],另一個(gè)是骨肉瘤高發(fā)期是老年期,患者中多為繼發(fā)性腫瘤,常與Pagets 骨病(Paget disease of bone)及放療后惡變等相關(guān)[31-33]。 患者臨床表現(xiàn)多為局部疼痛與腫脹,且夜間病發(fā)較為嚴(yán)重[34]。 但現(xiàn)有OS 模型尚不完全符合OS 臨床病癥特點(diǎn),因此進(jìn)一步研究OS 模型,對(duì)OS 發(fā)病機(jī)制,以及新藥研發(fā)具有重要意義。 下面對(duì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析,以期為建立簡便穩(wěn)定的骨肉瘤模型提供參考。

3.1 常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分析

本文通過OS 動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)性文獻(xiàn)分析發(fā)現(xiàn),骨肉瘤動(dòng)物模型以鼠類為主要來源,小鼠以BALB/c-nu/nu 裸鼠為主,大鼠以SD 大鼠為主。 鼠類在遺傳學(xué)、病理學(xué)、生物學(xué)等方面與人類非常相似,且鼠類生長周期短,時(shí)間成本低,價(jià)格低廉,是做動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的理想材料[35]。 首選模型動(dòng)物BALB/c-nu/nu裸鼠缺乏成熟的胸腺和免疫T 細(xì)胞,細(xì)胞免疫功能低下,對(duì)同種或異種移植物排斥力低。 又因裸鼠無毛,便于觀察和測量腫瘤的生長情況,故BALB/cnu/nu 裸鼠更適用于制備骨肉瘤模型[36]。 縱觀BALB/c-nu/nu 裸鼠生理周期,4 周齡以下裸鼠可能不耐受,導(dǎo)致裸鼠死亡,而6 周齡以上裸鼠體內(nèi)NK細(xì)胞活性增加,免疫力會(huì)呈現(xiàn)一定程度的增強(qiáng)[37-38],導(dǎo)致成瘤率降低,因此選擇4 ～6 周齡裸鼠有利于腫瘤的生長與轉(zhuǎn)移[39]。

3.2 常用造模方法及腫瘤細(xì)胞分析

建立與臨床吻合度高的OS 動(dòng)物模型是其機(jī)制研究與新藥研發(fā)的重要基礎(chǔ)。 數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)目前OS 模型造模方法主要以異位移植造模為主,占比76.16%,其中背部皮下移植最多,其次為腋部皮下移植、后肢皮下移植。 目前常用的骨肉瘤造模方法各有優(yōu)劣:(1)皮下異位移植模型操作簡便,腫瘤表淺,便于觀察腫瘤的生長,記錄腫瘤的生長曲線,但這種造模方法與原發(fā)性骨肉瘤中的轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)有較大差別[40];(2)尾靜脈細(xì)胞液移植法是考察骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移的重要手段,易于成模;(3)原位移植滿足了腫瘤生長所需要的局部微環(huán)境,具有良好的重復(fù)性,但原位移植需要手術(shù)操作,暴露股骨或脛骨[39,41],需考慮手術(shù)后預(yù)防感染的問題;(4)細(xì)胞液移植法增大了腫瘤細(xì)胞與周圍組織的接觸面積,腫瘤新生血管可為其提供更好的血供,但在細(xì)胞液中腫瘤細(xì)胞處于游離狀態(tài),可能會(huì)沿針道走行,致使細(xì)胞液流出或錯(cuò)位移植等問題[23];(5)組織塊移植法易于固定[42],但瘤組織塊有限的接觸面積限制了機(jī)體對(duì)整個(gè)瘤組織的血供,影響了腫瘤傳代率,且創(chuàng)面手術(shù)增加了術(shù)后出血和感染的風(fēng)險(xiǎn)[43]。

接種的腫瘤細(xì)胞種類是影響骨肉瘤動(dòng)物模型的重要因素之一,經(jīng)統(tǒng)計(jì),使用較多的骨肉瘤細(xì)胞為人源MG-63 細(xì)胞和鼠源UMR-106 細(xì)胞,兩者均具有較高的成模率。 其中人源MG-63 細(xì)胞具有較高的肺轉(zhuǎn)移率[44-45],且人源MG-63 細(xì)胞能更好地反映骨肉瘤患者的臨床特征,以便實(shí)驗(yàn)結(jié)果的臨床轉(zhuǎn)化。 同時(shí)為保證細(xì)胞活力,可在荷瘤前1 d 更換培養(yǎng)基,提高接種成功率[23]。

3.3 高頻檢測指標(biāo)分析

根據(jù)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn),研究者主要通過表觀指標(biāo)、抑瘤率、腫瘤組織病理、腫瘤組織免疫組化、腫瘤組織PCR、血清中細(xì)胞因子表達(dá)等指標(biāo)檢測,評(píng)價(jià)骨肉瘤模型成模情況和藥物療效。 所統(tǒng)計(jì)文獻(xiàn)中,表觀指標(biāo)包括腫瘤組織表觀指標(biāo)(腫瘤瘤徑、個(gè)數(shù)、重量)和動(dòng)物表觀指標(biāo)(如體重、毛發(fā)、飲食、活動(dòng)狀態(tài)等),可初步判定骨肉瘤模型成模情況。 腫瘤組織病理進(jìn)一步判斷骨肉瘤模型的病變程度和藥物療效。 腫瘤組織免疫組化、PCR、Western blot 等分子生物學(xué)檢測主要圍繞著細(xì)胞凋亡、炎癥因子、細(xì)胞增殖、細(xì)胞侵襲、腫瘤血管生成等展開,故多選擇與之 相 關(guān) 的Bcl-2、 Bax、 Caspase-3、 NF-κB、 STAT3、MEPK、VEGF 等相關(guān)通路進(jìn)行研究[26,46-48],同時(shí)腫瘤組織和血清的生化指標(biāo)與病理染色相互佐證,進(jìn)一步探究OS 的機(jī)制通路。

綜上所述,目前對(duì)骨肉瘤研究多選擇4 ～6 周齡的BALB/c-nu/nu 裸鼠,性別不限,多使用細(xì)胞液移植法異位造模,癌細(xì)胞主要選擇MG-63 細(xì)胞、UMR-106 細(xì)胞、143B 細(xì)胞或U2OS 細(xì)胞,檢測指標(biāo)多選擇腫瘤組織表觀指標(biāo)、腫瘤組織HE 染色、腫瘤組織免疫組化、動(dòng)物表觀指標(biāo)、抑瘤率等。 同時(shí),在分析過程中發(fā)現(xiàn)了一些問題:(1)所統(tǒng)計(jì)文獻(xiàn)中陽性藥涉及較少;(2)大多文獻(xiàn)未提及動(dòng)物成模的標(biāo)準(zhǔn),且模型成功的判定沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。 綜合動(dòng)物倫理學(xué)與實(shí)驗(yàn)實(shí)際需要,建議小鼠成模標(biāo)準(zhǔn)為小鼠腫瘤體積在100～150 mm3;(3)血清生化指標(biāo)LDH 和ALP是臨床檢測中的重要依據(jù)[49],建議未來的動(dòng)物模型中將其作為重要指標(biāo)進(jìn)行考察;(4)中醫(yī)認(rèn)為骨肉瘤病因病機(jī)為氣虛、血瘀、痰濁,而目前骨肉瘤動(dòng)物模型少有對(duì)應(yīng)的中醫(yī)指征,因此可在造模時(shí)加入中醫(yī)致病因素,如高脂飼料喂養(yǎng)等方法,誘發(fā)模型動(dòng)物痰濁血瘀,配合腫瘤細(xì)胞液皮下移植,構(gòu)建符合中西醫(yī)臨床病證結(jié)合要求的骨肉瘤動(dòng)物模型。

本文通過對(duì)骨肉瘤動(dòng)物模型相關(guān)文獻(xiàn)挖掘與分析,對(duì)常用骨肉瘤動(dòng)物模型的動(dòng)物選擇、造模方法、優(yōu)缺點(diǎn)及檢測指標(biāo)進(jìn)行整理比較,并針對(duì)不足之處進(jìn)行探討,希望本文可為后續(xù)模型完善提供思路,為建立更符合發(fā)病機(jī)制的動(dòng)物模型提供參考。