劉書一王正波

(1.昆明理工大學(xué)靈長類轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院,省部共建非人靈長類生物醫(yī)學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,昆明 650500;2.云南中科靈長類生物醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,昆明 650500)

帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是世界第二大神經(jīng)退行性疾病,主要的病理表現(xiàn)為中腦黑質(zhì)致密部的多巴胺能神經(jīng)元的丟失和腦中路易小體的形成,從而引起病人出現(xiàn)靜息性震顫、運(yùn)動遲緩、僵硬、步態(tài)障礙和姿勢不穩(wěn)等運(yùn)動癥狀,以及睡眠障礙、癡呆、焦慮、抑郁和便秘等非運(yùn)動癥狀[1]。 目前針對PD 的藥物治療和手術(shù)治療雖然能夠在一定程度上緩解癥狀,但是無法阻止病情的進(jìn)展[2],動物模型對于研究帕金森病的發(fā)病機(jī)制以及治療策略至關(guān)重要[3-5],非人靈長類(non-human priroate,NHP)帕金森動物模型可以較好的模擬該疾病,特別是在疾病早期階段的非運(yùn)動癥狀的描述,以及疾病后期的運(yùn)動障礙表型呈現(xiàn)。 針對運(yùn)動障礙表型的行為學(xué)評估有助于PD 發(fā)病機(jī)制和治療的研究。本文針對非人靈長類帕金森動物模型中涉及的行為學(xué)評估方式的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述,為將來PD 行為學(xué)研究提供參考。

1 非人靈長類帕金森動物模型的行為學(xué)優(yōu)勢

嚙齒類動物是目前應(yīng)用最廣泛的PD 動物模型,嚙齒類PD 模型可以重現(xiàn)PD 的部分行為癥狀,在此動物模型上開展的經(jīng)典的行為學(xué)實(shí)驗(yàn)包括自發(fā)旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)、阿撲嗎啡誘導(dǎo)的旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)、開放場實(shí)驗(yàn)、滾軸實(shí)驗(yàn)和水迷宮實(shí)驗(yàn)等[6],對PD 的發(fā)病機(jī)制和治療的研究起到了一定的促進(jìn)作用,但由于嚙齒類動物在大腦結(jié)構(gòu)及行為表現(xiàn)等方面與人類相差很大,在嚙齒類PD 模型上獲得的研究結(jié)果很難進(jìn)行臨床轉(zhuǎn)化[7]。 相比之下非人靈長類動物與人類在基因相似度和生理機(jī)能等方面有著更密切的關(guān)系,在大腦結(jié)構(gòu)上和行為表現(xiàn)上與人高度近似。 尤其是獼猴、食蟹猴等猴模型,是典型的非人靈長類動物模型[8],它們具有精細(xì)的手部動作,可以抓取食物和操作物體。 此外具有和人類類似的面部表情,以及直立姿勢等進(jìn)化優(yōu)勢,因此利用非人靈長類帕金森模型研究PD 相關(guān)的行為癥狀會比嚙齒類動物更加有助于效果評估和臨床轉(zhuǎn)化[9]。 例如結(jié)合患者的臨床表現(xiàn)而衍生出的非人靈長類PD 評分量表,該量表主要涉及對模型動物的總體運(yùn)動能力的評估[10],能夠用來評估模型動物的疾病的嚴(yán)重程度。 在PD 患者中,患者的精細(xì)運(yùn)動,包括抓握、書寫等會隨疾病進(jìn)展受到損傷,嚙齒類動物無法模擬這類手部的精細(xì)運(yùn)動,非人靈長類動物具有與人類相似的手指,能夠進(jìn)行一些更高級的手部精細(xì)運(yùn)動,可以對非人靈長類PD 模型的精細(xì)運(yùn)動進(jìn)行測試,這一類測試則包含布林克曼板、走廊測試以及抽屜抓取實(shí)驗(yàn),可以綜合評估模型動物的總體和精細(xì)運(yùn)動能力的變化[11]。

PD 患者中除了運(yùn)動癥狀還存在非運(yùn)動癥狀,這些癥狀不但包括從輕度認(rèn)知障礙到癡呆以及精神癥狀和情緒障礙,而且大多都早于運(yùn)動癥狀的出現(xiàn),這些非運(yùn)動癥狀也是導(dǎo)致患者生活質(zhì)量差的關(guān)鍵因素,可以作為早期PD 診斷的標(biāo)準(zhǔn)之一。 非人靈長類有更好的社會化行為、情感表現(xiàn)以及睡眠節(jié)律,且具有更高級的認(rèn)知能力,能夠進(jìn)行較為復(fù)雜的測試,從而能夠進(jìn)行非運(yùn)動癥狀的評估。

認(rèn)知功能障礙屬于PD 非運(yùn)動癥狀中的一種,主要包括注意力、識別能力、工作記憶以及解決問題和執(zhí)行能力下降,并且隨著疾病的進(jìn)程,癥狀逐漸加重,非人靈長類動物相對于嚙齒類動物可以更好模擬PD 患者中的認(rèn)知癥狀,可以用于研究與該病理表現(xiàn)相關(guān)的病理變化和內(nèi)在機(jī)制,先前研究建立了一些認(rèn)知檢測的測試,包括物體繞道檢索任務(wù)(object detour retrieval task, ODRT),延遲反應(yīng)任務(wù)以及注意力轉(zhuǎn)移測試等,這些檢測項(xiàng)目不僅可以測試模型動物記憶能力的變化,還可以對注意力以及應(yīng)變能力進(jìn)行測試,以評估造模和治療對動物認(rèn)知能力的影響。

隨著人們對于精神疾病的認(rèn)識的深入,PD 患者的精神癥狀也得到了更多的關(guān)注,近年來研究發(fā)現(xiàn)有多達(dá)60%的PD 患者可以出現(xiàn)多種形式的精神癥狀,其較高的發(fā)病率和較低的診斷率使其成為診斷和治療中的挑戰(zhàn)性難題,目前PD 中精神病樣癥狀的發(fā)病機(jī)制仍然不清楚[12],非人靈長類相比嚙齒類動物具有更高級的情感,并擁有類似于人類社會的社會屬性和階級屬性,因此使用非人靈長類PD模型評估PD 中的精神病樣行為,對于研究PD 中精神病樣行為的發(fā)病機(jī)制及其中的分子通路等研究都具有重要的現(xiàn)實(shí)意義,因此也建立了針對精神病樣行為和認(rèn)知障礙的評估包括評分量表和相關(guān)行為實(shí)驗(yàn)[13]。

此外,在過去的幾十年中有大量的研究對PD中的睡眠障礙進(jìn)行了調(diào)查,PD 中睡眠障礙的患病率高達(dá)90%,這些問題主要包括:失眠、白天過度嗜睡以及夜間睡眠覺醒等問題,非人靈長類動物具有和人類相似的睡眠節(jié)律,故非人靈長類PD 模型能夠更好的重現(xiàn)這些睡眠改變,例如在睡眠開始后覺醒次數(shù)增加,白天嗜睡以及快速眼動期睡眠的抑制等[14]。

非人靈長類具有的這些優(yōu)勢,使量化與患者相似的運(yùn)動障礙和非運(yùn)動障礙特征成為可能,簡化了從實(shí)驗(yàn)室的研究到臨床的轉(zhuǎn)化。 因此,建立合理客觀的行為學(xué)量化方式十分重要。

2 非人靈長類帕金森動物模型中的運(yùn)動癥狀評估

2.1 帕金森病評分量表

PD 患者最為顯著的運(yùn)動癥狀包括靜息性震顫、肌肉強(qiáng)直、運(yùn)動遲緩以及姿勢步態(tài)異常等。 目前臨床上對于PD 患者的診斷評分量表也主要針對這些運(yùn)動癥狀。 如前所述,非人靈長類PD 模型可以復(fù)制這些運(yùn)動癥狀,針對特異性PD 癥狀,PD 評分量表是一種有力的評價(jià)工具。 目前,針對非人靈長類PD 模型的評分量表大多是由臨床患者評分量表為基礎(chǔ)改變而來,用來衡量非人靈長類PD 模型的造模情況和治療效果。

評分開始前,被測試的動物需要先熟悉錄像籠子,正式開始錄像的30 min 內(nèi),測試者分別在籠子的底部和頂部給予食物,用于評估動物如何站起,站起時(shí)是否搖晃以及支撐情況;隨后在籠子的中間將食物分別向左右移動,用于評估雙手的使用和震顫;測試者離開前將大塊的食物放在籠子里,以評估動物對物體的操控能力。 錄像結(jié)束后,由不同的測試者根據(jù)錄像和評分量表對猴子的行為進(jìn)行評分,并消除不同測試者之間的誤差。 目前常用的評分量表主要有8 種,這8 種量表雖然都是針對PD中的主要癥狀,但是在評分的細(xì)節(jié)上會有一些不同之處,表1 將這8 種經(jīng)典評分量表進(jìn)行了總結(jié)概述,并對比了其優(yōu)缺點(diǎn)[15-22]。

表1 8 種評分量表內(nèi)容差異比較Table 1 Comparison of content differences of eight rating scales

在對比了不同量表的優(yōu)缺點(diǎn)后可以發(fā)現(xiàn),PD Kurlan 量表[19]對于運(yùn)動和非運(yùn)動癥狀的評價(jià)更為全面,得分描述也更為準(zhǔn)確,從而降低了評分者之間的客觀差異性和難度,但仍缺乏對于攀爬能力的評估。 PD 評分量表的設(shè)計(jì)應(yīng)該更加考慮向猴子行為的轉(zhuǎn)化,例如對攀爬能力和對刺激反應(yīng)等,同時(shí)需要更準(zhǔn)確的分?jǐn)?shù)實(shí)例標(biāo)準(zhǔn),可用于標(biāo)準(zhǔn)化不同測試者的評分。 針對這些問題,在實(shí)際應(yīng)用中,可根據(jù)需要將不同量表結(jié)合使用,開發(fā)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)的培訓(xùn)練習(xí),以縮小測試者的主觀差異,這可以更好地幫助測試者定義PD 非人靈長類動物模型癥狀的嚴(yán)重程度。

2.2 手指精細(xì)運(yùn)動評價(jià)

對非人靈長類PD 模型中精細(xì)運(yùn)動的評估能夠指示活動的靈巧性,針對精細(xì)運(yùn)動的評估方法包括FMS 測試、布林克曼板、手抓抽屜任務(wù)、走廊任務(wù)等。

不同的測試方法能夠評估不同水平的精細(xì)運(yùn)動,FMS 測試在幾種測試方法中最為簡單可行,常被作為非人靈長類帕金森動物模型的造?；蛘咧委熝芯恐械闹匾袨閷W(xué)檢測項(xiàng)目之一,可以描述模型猴抓取食物的能力,實(shí)驗(yàn)需要區(qū)分模型猴的左右手,并利用攝像機(jī)對過程進(jìn)行錄像,在規(guī)定的時(shí)間內(nèi)進(jìn)行規(guī)定次數(shù)的測試,隨后對錄像進(jìn)行分析,記錄不同的數(shù)據(jù),例如反應(yīng)時(shí)間、拿取時(shí)間和總時(shí)間等,這些指標(biāo)能客觀量化猴子手部整體的抓取能力,但是FMS 測試只能評價(jià)相對較簡單的抓取運(yùn)動,對更精細(xì)的手部運(yùn)動的檢測較不敏感[23]。

相較于FMS 測試,布林克曼板能夠測試更精細(xì)的手部運(yùn)動,該方法是1973 年Brikman 等[24]在研究恒河猴中左右手大腦控制的研究中建立的,該實(shí)驗(yàn)中的食物顆粒,例如糖球或花生等會被放置在帶有小孔的板子中(圖1),考驗(yàn)?zāi)Ｐ秃锶∈硶r(shí)的手部靈巧性,同時(shí)借助猴椅的幫助,可以區(qū)分左右手的靈巧程度,對于單側(cè)PD 猴模型的檢測十分有利,布林克曼板在后期還進(jìn)行了改良,出現(xiàn)了旋轉(zhuǎn)的布林克曼板,錄像記錄被測試猴子取食的數(shù)量和接觸時(shí)間后,通過錄像數(shù)據(jù)分析可以評估實(shí)驗(yàn)猴左右手的精細(xì)運(yùn)動和靈活性,從而量化造?；蛑委熁謴?fù)情況。

圖1 靜止和旋轉(zhuǎn)的布林克曼板示意圖Figure 1 Schematic of a Brinkmann plate at rest and rotating

除了這兩種經(jīng)典的精細(xì)運(yùn)動檢測方法之外,手抓抽屜任務(wù)[25]和走廊任務(wù)[26]也可以評估猴子手部力量和綜合運(yùn)動能力,但是這兩種測試方法由于訓(xùn)練難度高,硬件要求高等因素,實(shí)際應(yīng)用相對較少。

在實(shí)際的實(shí)驗(yàn)中,FMS 測試和布林克曼板與PD 評分量表通常結(jié)合使用,從而在一定程度上評估出實(shí)驗(yàn)猴在PD 相關(guān)運(yùn)動癥狀上的嚴(yán)重程度,達(dá)到互補(bǔ)的效果。

2.3 整體運(yùn)動量變化的評價(jià)

除了PD 評分量表和手部精細(xì)測試之外,研究者根據(jù)猴子生性好動的特性,延伸出對整體運(yùn)動量變化的一套評價(jià)體系,包括針對小體型狨猴的塔式測試[27],以及自主運(yùn)動水平測試[28],該測試應(yīng)用最廣泛,測試在有機(jī)玻璃建造的透明觀察籠子里進(jìn)行,錄像機(jī)被設(shè)立在籠子的不同側(cè)邊,錄像的時(shí)間一般為20～40 min,錄像完畢后將視頻導(dǎo)入軟件中對猴子活動范圍和四肢活動進(jìn)行圈定,以便于計(jì)算機(jī)算法可以對其活動進(jìn)行計(jì)算,在分析完畢后,計(jì)算機(jī)可以自動生成猴子一定時(shí)間內(nèi)在觀察籠中的運(yùn)動距離,以及不同運(yùn)動方式所占的時(shí)間和距離。整體的運(yùn)動量能夠反映猴子的運(yùn)動能動性和自主運(yùn)動能力,隨著疾病的進(jìn)展,猴子運(yùn)動的能動性降低,并伴隨著運(yùn)動能力的下降。

此外,利用不同的藥物例如阿撲嗎啡和左旋多巴也可以檢測整體運(yùn)動的變化,該方法只能用于單側(cè)PD 模型,因?yàn)閱蝹?cè)造模后猴子會向損毀側(cè)自發(fā)旋轉(zhuǎn),使用一定量的多巴胺受體激動劑后,猴子會向健側(cè)進(jìn)行旋轉(zhuǎn),這種藥物的處理方式也可以證明造模的程度和治療的效果[29]。 該測試一般是對比給藥前后30 min 的轉(zhuǎn)圈次數(shù),從而指示疾病的嚴(yán)重程度。

上述三類測試方法可以對PD 猴模型的運(yùn)動癥狀進(jìn)行評價(jià),包括粗運(yùn)動和精細(xì)運(yùn)動以及總體運(yùn)動量,測試者需要將以上評價(jià)方式結(jié)合使用,才能得到客觀準(zhǔn)確、全面細(xì)致的數(shù)據(jù),這對實(shí)驗(yàn)的可信性至關(guān)重要,單一的評價(jià)方式會導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果主觀性過強(qiáng),失去評價(jià)的意義。

3 非人靈長類帕金森模型中的抑郁水平評價(jià)

3.1 情感和社會行為相關(guān)的抑郁評價(jià)

近期有很多臨床前研究常聚焦于PD 中的抑郁癥狀[30],快感缺失被認(rèn)為是抑郁癥的核心癥狀之一,研究者們利用非人靈長類動物對于糖水的天然偏好性,設(shè)計(jì)出了糖水偏好實(shí)驗(yàn),以評估快感缺失情況[31],實(shí)驗(yàn)時(shí)同時(shí)給被測試猴一瓶糖水和一瓶純凈水,對比其對于糖水和純凈水的攝取量,通過對比不同時(shí)間的糖水飲用量的變化,評估其抑郁表型,糖水偏好實(shí)驗(yàn)在很多的研究中被用于評估抑郁中的快感缺失,也證明了其可靠性。

對非人靈長類PD 模型的情緒障礙和社會行為相關(guān)的抑郁表現(xiàn)的評價(jià)主要是對比自身的一些典型行為,例如情緒障礙中典型的焦慮起搏、自損行為、刻板行為、擁擠姿勢等[32],這類行為以有/無來量化,通常以造模前為參照,抗抑郁藥處理后以上行為的變化,也可以反映PD 猴模型抑郁癥狀的存在[33]。

此外,非人靈長類動物與人類一樣具有社會屬性,它們有社會組織機(jī)制,并且有明確穩(wěn)定的等級制度,研究表明等級較低的猴子在種群中具有更強(qiáng)的警惕性,獨(dú)處的時(shí)間更多,壓力相對更大,這類動物更容易觀察到抑郁相關(guān)的社會行為,且這類行為通常先于運(yùn)動癥狀出現(xiàn)[34-35],因此研究抑郁行為時(shí),動物的選擇也是重要的一環(huán)。

3.2 睡眠障礙評價(jià)

先前的研究表明,臨床PD 病人中的睡眠障礙的患病率高達(dá)90%,包括失眠、白天過度嗜睡、快速眼動期睡眠障礙、夜間睡眠驚醒行為,通常與抑郁并存[36]。 非人靈長類和人類具有相似的睡眠節(jié)律,例如晚上睡眠穩(wěn)定,白天會有一些小睡等,適合用于研究PD 中的睡眠障礙[37]。 對睡眠的監(jiān)測方式包括腦電圖、肌電圖以及眼電圖等侵入性策略,以及佩戴項(xiàng)圈,錄像后人工分析等非侵入性策略[38],需要關(guān)注的睡眠變化包括:

(1)在睡眠開始后醒來的頻率增加;

(2)白天更容易進(jìn)行長時(shí)間的睡眠;

(3)快速眼動期睡眠被急性抑制[39]。

4 非人靈長類帕金森模型中的精神障礙和認(rèn)知障礙

4.1 精神病樣行為評分

使用非人靈長類帕金森精神病樣行為評分量表(表2)可以對非人靈長類動物的精神狀態(tài)進(jìn)行評估,在實(shí)驗(yàn)的過程中對實(shí)驗(yàn)動物進(jìn)行2 h 的錄像,錄像后由測試人員對于視頻進(jìn)行分析量化[40]。

表2 非人靈長類帕金森精神病樣行為評分量表Table 2 Nonhuman primate psychopathic-like behavior scale

對精神病樣行為的評估有利于尋找可能的分子機(jī)制和通路,為尋找PD 的早期發(fā)病機(jī)制提供有力的幫助。

4.2 帕金森相關(guān)的認(rèn)知障礙

導(dǎo)致認(rèn)知障礙的細(xì)胞和分子機(jī)制是未知的,有研究認(rèn)為這種障礙可能與線粒體功能障礙相關(guān)[41],但仍需要進(jìn)一步驗(yàn)證,相關(guān)的行為學(xué)研究方式包括一些演化而來的檢索任務(wù)和視覺任務(wù)[42]。

在檢索任務(wù)中,ODRT 能夠檢測動物對執(zhí)行任務(wù)的應(yīng)變能力[43],其類似于嚙齒類動物行為檢測中的水迷宮或Y 迷宮實(shí)驗(yàn),該實(shí)驗(yàn)中的任務(wù)在獎勵(lì)信息和錯(cuò)誤信息之間存在沖突性,動物需要依靠繞道來獲取食物,這種能力是衡量其推理能力、積極能動性和解決問題能力的指標(biāo),所以可以用于衡量認(rèn)知能力。

與之類似的是可變延遲反應(yīng)任務(wù)(variable delay response task, VDR)[44]和修改延遲反應(yīng)任務(wù)(modify the delayed response task, MDR)[45],VDR任務(wù)主要可以測試猴子的短期記憶的能力,短期記憶能力也是認(rèn)知能力中很重要的一部分,該任務(wù)是由針對患者的經(jīng)典測試威斯康辛卡片分類測試(wisconsin card sorting test, WCST)演變而來[46],在這項(xiàng)任務(wù)中包含有幾個(gè)不同的子測試,使得刺激的特征不斷發(fā)生改變,這就要求動物始終保持適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)策略,從而衡量動物的執(zhí)行力和變通力。

PD 中的非運(yùn)動癥狀雖然不如運(yùn)動癥狀那樣典型,但是患者上的研究顯示其能夠指征早期的PD癥狀,目前有很多PD 動物模型在嘗試從病因角度造模,從而模擬早期的PD 進(jìn)程,因此使用相關(guān)的行為評估策略,對在非人靈長類PD 模型中的早期的疾病診斷、生物標(biāo)志物的篩選,早期神經(jīng)保護(hù)藥物的開發(fā),基因治療策略的檢測等都是不可缺少的工具。

5 非人靈長類帕金森模型中行為學(xué)相關(guān)深層指標(biāo)

對于非人靈長類PD 模型的評估,除了以上介紹的行為學(xué)指標(biāo),還可以結(jié)合一些深層指標(biāo)一起進(jìn)行分析,包括影像學(xué)檢查、代謝物分析和病理學(xué)分析等。 影像學(xué)檢查主要包括核磁共振成像(magnetic resonance imaging, MRI)[47]、單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層掃描(single photon emission computed tomography, SPECT)[48]和正電子發(fā)射斷層掃描(positron emission tomography, PET)等,可以對腦結(jié)構(gòu)、功能和分子變化等進(jìn)行成像,結(jié)合行為學(xué)結(jié)果,可以評估出腦內(nèi)結(jié)構(gòu)等變化與行為之間的聯(lián)系[49]。此外,腦脊液或血液中的一些物質(zhì)的變化,也被認(rèn)為可以作為生物標(biāo)記物來確認(rèn)PD 的存在,其中包括在腦脊液(CSF)、血液中的α-突觸核蛋白(α-syn)總量及寡聚體量[50],相關(guān)外泌體[51]、microRNA[52]和炎癥相關(guān)標(biāo)志物[53]等。 其中一些生物標(biāo)志物結(jié)合影像學(xué)檢查以及行為學(xué)檢測,可以對PD 有較高的診斷性和預(yù)測價(jià)值。

以上的檢測方法可以在活體動物上實(shí)現(xiàn)對PD的診斷,病理學(xué)檢測則可以在組織學(xué)層面對PD 的一些指標(biāo)進(jìn)行檢測,經(jīng)典的病理學(xué)檢測包括:黑質(zhì)和紋狀體位置的多巴胺能神經(jīng)元數(shù)量;腦中尤其是黑質(zhì)和紋狀體的病理性α-syn 炎癥反應(yīng)等[54]。 病理學(xué)檢測的指標(biāo)來源于患者尸檢的結(jié)果,能夠?qū)τ诩膊∵M(jìn)程進(jìn)行更準(zhǔn)確的預(yù)測,同時(shí)結(jié)合行為檢測結(jié)果,可以幫助挖掘一些非運(yùn)動癥狀背后的病理機(jī)制[55]。

6 結(jié)語

本綜述總結(jié)了在非人靈長類PD 模型中,針對運(yùn)動癥狀和非運(yùn)動癥狀被廣泛應(yīng)用的測試方式,選擇不同的測試方法,能夠幫助研究者對不同方向進(jìn)行表型和機(jī)理結(jié)合的測試,這對于在非人靈長類動物模型上進(jìn)行PD 研究的研究者是十分有力的工具。