木 魁，周雨凡，汪瑤瓊，邑 晴，方頌平，2，3①

（1.亳州學(xué)院 生物與食品工程系，安徽 亳州 236800；2.養(yǎng)生型配制酒亳州市重點實驗室，安徽 亳州 236800；3.配制酒工程技術(shù)研究中心，安徽 亳州 236800；4.藥用植物有效成分生物合成亳州市重點實驗室，安徽 亳州 236800）

0 引言

2017年，全球大氣顆粒物（particulate matter，PM2.5）暴露造成458萬人死亡和1.425 2萬億經(jīng)濟損失［1］，PM2.5是導(dǎo)致中國人口死亡僅次于飲食風(fēng)險、高血壓和吸煙的第四大風(fēng)險因素［2］。PM2.5已被國際癌癥研究機構(gòu)（IARC）列為導(dǎo)致人類肺癌的I類致癌物［3］。黑炭是PM2.5的主要化學(xué)組分［4］，是含碳燃料不完全燃燒的產(chǎn)物，對氣候變化、空氣質(zhì)量和人類健康有顯著的不利影響［5］。典型黑炭的外貌為鏈?zhǔn)角蛐涡×Ｗ樱睆揭话銥?.01～1.0 μm。由于黑炭顆粒尺寸不同，其在人體內(nèi)的運動表現(xiàn)也不盡相同。大多數(shù)粒子直徑超過10 μm的顆粒會在鼻腔和喉嚨處就被阻擋，從而無法到達肺中，在咽喉部位，可以利用物理機制除去直徑為2.5～10 μm的黑炭粒子，5 μm以下的黑炭顆粒會進入支氣管，低于2.5 μm的黑炭顆粒會在肺部最深處沉淀，且進入肺泡，利用氣血交換進入血管中，隨血液循環(huán)進入人體其它臟器中［6］。經(jīng)肺暴露納米黑炭會導(dǎo)致小鼠肝臟發(fā)生遺傳毒性，納米黑炭長期滯留肝臟可能導(dǎo)致肝癌發(fā)生［7］。氣管內(nèi)染毒納米黑炭顆粒后觀察到的肝基因損傷是由肝臟中檢測到納米黑炭顆粒造成氧化應(yīng)激損傷，而不是由肺部炎癥或肝臟急性期反應(yīng)的繼發(fā)性作用引起的［8］。目前以納米黑炭為研究材料經(jīng)氣管暴露多集中在肺部方面的研究，顯示納米黑炭可誘導(dǎo)多種細胞死亡方式，包括自噬、壞死、凋亡、焦亡和鐵亡，從而引發(fā)心血管和慢性肺阻等多種疾?。?］。納米黑炭經(jīng)呼吸系統(tǒng)進入機體后對其他臟器造成的影響研究較少，肝臟是人體最大的實質(zhì)器官，對毒素的清除、蛋白質(zhì)的產(chǎn)生和代謝穩(wěn)態(tài)的維持至關(guān)重要［10］。大粒徑黑炭在機體代謝非常緩慢，黑炭顆粒經(jīng)氣管暴露小鼠180 d，可通過顯微鏡在肝臟中檢測到黑炭顆粒［8］。納米級黑炭粒徑小,具有更強的轉(zhuǎn)運能力，能夠隨呼吸轉(zhuǎn)運到肝臟部位，通過研究納米黑炭對小鼠肝臟造成的影響，可以為大氣顆粒物對人類健康的危害研究提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

納米黑炭，粒徑40 nm，購自于北京德科島金科技有限公司；6周齡的昆明小鼠，購于安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。

1.2 試劑及儀器設(shè)備

堿性磷酸酶測試盒（南京建成生物工程研究所）；酸性磷酸酶測試盒（南京建成生物工程研究所）；多功能酶標(biāo)儀（Tecan Infinite M1000 PRO）；石蠟切片機（Leica，德國）；倒置顯微鏡（奧林巴斯IX73，日本）。

1.3 研究方法

1.3.1 動物分組和染毒

由于雌性小鼠在整個激素周期內(nèi)的各項生理指標(biāo)變動并不比雄性小鼠大，甚至雄性動物的有些個體差異表現(xiàn)比雌性個體更為明顯［11］，且實驗非藥物方面的實驗，不涉及性別差異，因此全部選取清潔級6周齡的雌性昆明小鼠40只，體重（25±1.3）g，實驗前經(jīng)過7 d的適應(yīng)性飼養(yǎng)，隨機分為4個小組，每組10只，對照組用生理鹽水處理。實驗組分為暴露1 d、3 d、7 d（每天染毒1 次），采用氣管滴注，處理劑量為4 mg/kg。最后一次暴露72 h后處死小鼠摘取小鼠肝臟。

氣管滴注方法：配置質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%戊巴比妥鈉，按照3 mL/kg麻醉小鼠，往靜脈留置針注入50 μL配制好的黑炭溶液，將針芯抽出，隨后將PVC軟管插入小鼠聲門裂，當(dāng)看到PVC套管內(nèi)黑炭溶液隨小鼠呼吸，液體發(fā)生波動，即可將黑炭溶液打入小鼠氣道［12］。

1.3.2 制作組織切片蘇木素-伊紅染色（HE染色）并觀察

小鼠肝臟摘取后，用Carnoy改良液（3份無水乙醇+1份冰醋酸）固定過夜，固定完成后依次置于體積分?jǐn)?shù)為50%、75%、80%、90%、95%、100%酒精各1 h 至完全脫水，然后放入無水乙醇與二甲苯體積比為1:1中進行過渡，在純二甲苯更換2次進行各透明20 min，然后置于二甲苯與石蠟體積比為1:1中進行過渡，在純石蠟中進行包埋，冷卻后在石蠟切片機上將含有組織的蠟塊切成3 μm的組織薄片，在展片機設(shè)置42 ℃水浴中展開，用干凈粘附載玻片撈取切片，在烘片機上設(shè)置50 ℃烘烤載玻片30 min。然后將烘烤完成的切片放入純二甲苯Ⅰ、純二甲苯Ⅱ中各20 min 脫蠟，再依次放入無水乙醇20 min，體積分?jǐn)?shù)90%、80%、70%乙醇各2 min后用蒸餾水沖洗干凈，切片浸于蘇木精溶液中染細胞核10 min，蒸餾水沖洗干凈，再將切片浸入伊紅染液中染色細胞質(zhì)2 min，染色完成后將切片依次放入體積分?jǐn)?shù)為70%、80%、90%、95%、100%酒精Ⅰ，100%酒精Ⅱ梯度脫水各2 min，浸入純二甲苯Ⅰ、純二甲苯Ⅱ各10 s，透明后拿出晾干，用中性樹脂封片，在顯微鏡下對HE染色的肝臟組織切片進行病理學(xué)觀察。

1.3.3 小鼠肝臟生化指標(biāo)測定

為評估小鼠肝臟生化指標(biāo)，將小鼠肝臟組織先用生理鹽水沖洗干凈，然后分別稱取小鼠對照組和實驗組的肝臟組織各0.5 g，分別加入4.5 mL 生理鹽水，稀釋10 倍。經(jīng)過組織勻漿后，用冷凍離心機設(shè)置1 000 r/min，4 ℃條件下離心10 min，取上清液，分別按照測試盒說明書進行操作檢測AKP和ACP含量。

1.4 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)圖使用GraphPad Prism 8.3軟件分析。t檢驗分析方法進行組間差異分析，其中*代表P＜0.05，表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義［13］。

2 結(jié)果與分析

2.1 納米黑炭材料形貌觀察

為確保實驗材料的尺寸和均一度，實驗通過透射電子顯微鏡（TEM）表征納米黑炭，如圖1，結(jié)果顯示納米黑炭呈近球形形貌，尺寸符合實驗要求的直徑40 nm，均一性好，納米黑炭在自然狀態(tài)下呈團簇狀態(tài)，由于納米黑炭自身的理化特征，納米黑炭在電鏡下顯示聚集程度較高。

圖1 透射電子顯微鏡（TEM）的納米黑炭形貌

2.2 納米黑炭對小鼠肝臟生化指標(biāo)的影響

酸性磷酸酶（ACP）和堿性磷酸酶（AKP）廣泛分布于肝臟中，堿性磷酸酶異常預(yù)示著肝臟異常。如圖2，ACP和AKP在暴露1 d處理均呈現(xiàn)病理性降低（P＜0.05），ACP在暴露3 d和7 d相較于1 d均出現(xiàn)升高，AKP在暴露3 d和7 d呈現(xiàn)降低。

圖2 納米黑炭對小鼠肝臟生化指標(biāo)影響

2.3 納米黑炭對小鼠肝臟組織病理學(xué)的影響

肝臟組織病理學(xué)主要按照炎癥細胞活動程度和肝細胞的狀態(tài)進行評定。炎細胞浸潤，指的是炎細胞在炎癥灶聚集的現(xiàn)象。氣球樣變是由于細胞受損后水分增多引起肝細胞脹大、胞漿疏松化，進一步發(fā)展肝細胞脹大如球形，胞漿幾乎透明，稱為氣球樣變。由圖3 可知，對照組小鼠的肝細胞的形態(tài)為排列整齊，致密，分布均勻，結(jié)構(gòu)清晰，未觀察到病理學(xué)改變；暴露1 d處理，可見大量納米黑炭顆粒在血管中，大量炎細胞浸潤血管壁，少量黑炭進入肝臟組織，肝臟細胞無明顯炎細胞浸潤現(xiàn)象，肝細胞結(jié)構(gòu)清晰，分布均勻；暴露3 d處理，炎細胞大量浸潤，肝細胞出現(xiàn)結(jié)構(gòu)異常，排列紊亂，相較暴露1 d炎癥細胞在肝臟組織大量浸潤，在肝臟組織可見較多黑炭，對肝臟組織造成損傷；暴露7 d處理，大面積肝細胞脹大如球形，胞漿疏松化，透明化嚴(yán)重，發(fā)生大量氣球樣變，肝臟細胞損傷嚴(yán)重。

圖3 小鼠肝臟組織病理學(xué)切片（HE染色，400×）

3 討論

由于PM2.5的主要成分不一樣及理化性質(zhì)復(fù)雜且不明了，小于2.5 μm的黑炭顆粒能在肺部最深處沉淀，且進入肺泡，利用氣血交換進入到血管中，隨血液循環(huán)進入到人體其它臟器中［6］。大粒徑黑炭在機體代謝非常緩慢，黑炭顆粒經(jīng)氣管暴露小鼠180 d，能通過顯微鏡檢測到肝臟中有黑炭顆粒［8］。本研究選取的材料為具有更強轉(zhuǎn)運能力的納米級黑炭，形狀選擇近球形，接近自然狀態(tài)下PM2.5成分黑炭的形貌。商品化納米黑炭理化成分明確，性質(zhì)穩(wěn)定，能更好地探究納米黑炭對機體健康損傷的機制。

本研究探討納米黑炭經(jīng)氣管染毒對小鼠肝臟的影響，納米級顆粒團聚體在肺部沉積后，有可能分解并作為單個納米顆粒轉(zhuǎn)移到遙遠的位置［14］。結(jié)果顯示，AKP和ACP 在暴露1 d的時候活性都顯著性降低（P＜0.05），但在染毒3 d的時候有所回升，結(jié)合病理切片圖，染毒1 d，可見大量納米黑炭顆粒在血管中，大量炎細胞浸潤血管壁。染毒3 d，炎細胞大量浸潤肝臟組織，肝細胞結(jié)構(gòu)異常，排列紊亂。肝臟對毒素的清除至關(guān)重要［10］。ACP和AKP是肝臟損傷標(biāo)記酶，肝臟AKP和ACP的降低可能是由于細胞組織壞死所致。同時，肝臟具有再生功能，當(dāng)肝臟組織發(fā)生肝再生的過程時，ACP和AKP 的活性也會上升?？梢酝茰y出納米黑炭剛進入小鼠體內(nèi)1 d時，小鼠肝臟發(fā)生炎癥反應(yīng)而后機體免疫系統(tǒng)作出反應(yīng)，當(dāng)炎癥反應(yīng)超出肝臟調(diào)節(jié)能力，炎癥反應(yīng)會對肝臟造成損害［10］，肝臟損傷是由納米黑炭氧化應(yīng)激造成的損傷，而不是由肺部炎癥或肝臟急性期反應(yīng)的繼發(fā)性作用引起的［8］。染毒3 d時，納米黑炭滯留肝臟，會導(dǎo)致小鼠肝臟發(fā)生遺傳毒性，可導(dǎo)致肝臟損傷加重［7］。病理切片可看出,小鼠染毒7 d 的時候已經(jīng)出現(xiàn)大量肝細胞脹大，胞漿疏松化、透明化嚴(yán)重，發(fā)生大量氣球樣變，這與黑炭顆粒經(jīng)氣管暴露小鼠180 d的結(jié)果一致，均在肝臟檢測到黑炭顆粒［8］，但由于其實驗選取材料是粒徑較大黑炭，轉(zhuǎn)運能力弱，所以必須長期染毒才能在肝臟檢測到黑炭顆粒，這就揭示粒徑越小的納米黑炭在暴露過程中毒性更強，對其他臟器的影響更大。雖然肝臟在對慢性損傷的病理具有修復(fù)功能，人們實際生活中每天都會暴露大氣顆粒，長期來看由于納米黑炭滯留肝臟組織，持續(xù)對肝臟造成損傷程度比肝臟再生能力要強，因此可能導(dǎo)致肝癌風(fēng)險 增加［7］。

經(jīng)氣管滴注的納米黑炭會對小鼠肝臟組織產(chǎn)生損害，并且當(dāng)納米黑炭暴露的時間越長，對小鼠肝臟產(chǎn)生的損害會更嚴(yán)重。總之，納米黑炭會蓄積在小鼠肝臟中，對小鼠肝臟組織產(chǎn)生損害，由于納米黑炭滯留肝臟造成氧化應(yīng)激與炎癥損傷，對肝臟直接造成遺傳毒性。