羅景舒,馬建嶺,羅敬月,史利卿,溫紹惠,李扭扭,王麗云

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院,北京 100078;2.北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院呼吸熱病科,北京 100078;3.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院中醫(yī)科,北京 101149)

咳嗽是呼吸門診常見(jiàn)就診原因,其中慢性咳嗽占比約1/3[1],逐漸受到重視,1998 年美國(guó)胸科醫(yī)師協(xié)會(huì)制定了第一部咳嗽機(jī)制專家共識(shí),此后咳嗽神經(jīng)生理學(xué)相關(guān)指南及診斷和治療指南多次更新,國(guó)內(nèi)于2021 年更新了最新版指南—《咳嗽的診斷與治療指南》。盡管咳嗽相關(guān)研究在逐步完善,由于其病因復(fù)雜,故臨床誤診誤治率較高,且長(zhǎng)期、反復(fù)的咳嗽對(duì)患者的身心、醫(yī)療經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)及社會(huì)保障等方面均造成影響[1]。而咳嗽機(jī)制研究對(duì)臨床療效的提高、新藥的研制、減少社會(huì)經(jīng)濟(jì)保障負(fù)擔(dān)等方面具有重要意義。

關(guān)于發(fā)病機(jī)制研究,人體試驗(yàn)?zāi)壳爸挥嗅槍?duì)死亡患者短期內(nèi)捐獻(xiàn)遺體迷走神經(jīng)及氣道平滑肌的相關(guān)研究[2],其仍具有相對(duì)復(fù)雜、標(biāo)本較少、取材及時(shí)限短等局限性,因此動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究為主要途徑?？煽壳铱芍貜?fù)的動(dòng)物模型是研究疾病病因、發(fā)病機(jī)制、治療方法及開發(fā)新藥的基礎(chǔ),選擇合適的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物以及造模方法對(duì)咳嗽相關(guān)研究也具有重要意義。隨著認(rèn)識(shí)的不斷深入,實(shí)驗(yàn)技術(shù)的推進(jìn),咳嗽動(dòng)物模型造模方法亦在不斷改進(jìn),另外基于國(guó)內(nèi)外咳嗽指南不斷發(fā)布,咳嗽分類及相關(guān)病種亦有較大變化,相關(guān)疾病模型有較多探討,檢索發(fā)現(xiàn)專項(xiàng)咳嗽動(dòng)物模型文獻(xiàn)亟待更新。本團(tuán)隊(duì)咳嗽專項(xiàng)臨床及實(shí)驗(yàn)研究20 年,筆者導(dǎo)師近期于英國(guó)帝國(guó)理工大學(xué)國(guó)立心肺研究所對(duì)咳嗽機(jī)制方面進(jìn)行了專項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研究,相關(guān)成果于國(guó)際會(huì)議學(xué)術(shù)交流[3-4],對(duì)各種咳嗽模型的制備有較為深入的研究,并參與國(guó)內(nèi)最新版指南制定,結(jié)合既往經(jīng)驗(yàn),現(xiàn)對(duì)咳嗽動(dòng)物實(shí)驗(yàn)相關(guān)動(dòng)物模型研究新進(jìn)展進(jìn)行整理比較及總結(jié),以期為相關(guān)研究提供參考(表1、表2)。

表1 單純咳嗽動(dòng)物模型比較Table 1 Comparison of animal models of simple cough

表2 疾病咳嗽動(dòng)物模型比較Table 2 Comparison of animal models of disease cough

1 模型動(dòng)物的選擇

目前豚鼠、大小鼠、犬、貓、豬等動(dòng)物常用,不同動(dòng)物咳嗽反射的形式相異,其調(diào)節(jié)咳嗽反射的方式有所不同,對(duì)激發(fā)咳嗽的因素和反應(yīng)也各有不同,因此為了適應(yīng)不同研究目的及要求,應(yīng)選用合理的模型動(dòng)物。

嚙齒類小型動(dòng)物如大小鼠、豚鼠,繁殖快,數(shù)量大,飼養(yǎng)繁殖及藥物成本低,更易操作及進(jìn)行大批量研究。大小鼠的咳嗽反射與人類差異較大,且不敏感,但小鼠轉(zhuǎn)基因型模型完備,可用新技術(shù)較多,既往認(rèn)為小鼠氣道可能缺乏咳嗽反射所需部分神經(jīng)突觸及通路,難以區(qū)分咳嗽反射和呼氣反射,然而近年來(lái)有研究表明可通過(guò)Buxco 公司的全身體積描記系統(tǒng)(whole body plethysmography, WBP)識(shí)別小鼠咳嗽反射[5],故用小鼠進(jìn)行咳嗽研究也更普遍。而大鼠需要麻醉,抑制中樞,難于產(chǎn)生咳嗽,且其咳嗽反射來(lái)源于喉不是支氣管束,并不是咳嗽模型的理想動(dòng)物。

犬、貓、豬等大型動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)操作較為容易,可用于研究藥物的進(jìn)一步篩選。犬適用于觀察鎮(zhèn)咳藥物的作用時(shí)間,貓?jiān)谑軝C(jī)械或化學(xué)刺激后易誘發(fā)咳嗽,但該類動(dòng)物成本高,故由于經(jīng)濟(jì)和來(lái)源上的考慮,上述動(dòng)物多用于確定藥物初篩后的鎮(zhèn)咳療效。

豚鼠免疫系統(tǒng)發(fā)達(dá),對(duì)于化學(xué)刺激十分敏感,大多霧化引咳藥易引起咳嗽,其咳嗽反射與人類相似;與清醒狀態(tài)下的動(dòng)物相比,麻醉動(dòng)物和人之間的咳嗽反應(yīng)性存在不同,而豚鼠可在清醒、不限制活動(dòng)的狀態(tài)下進(jìn)行研究;體外研究提示機(jī)械刺激豚鼠迷走神經(jīng)引起的去極化過(guò)程與人類亦較為相似;另外豚鼠還有占地小、脾氣溫順、無(wú)攻擊性的特點(diǎn),其咳嗽監(jiān)測(cè)也有成熟的軟件,因此豚鼠作為咳嗽模型動(dòng)物最為理想,是近年來(lái)咳嗽新藥藥理研究、咳嗽反射及相關(guān)研究最常用的動(dòng)物[6-7]。

2 單純咳嗽模型

人類咳嗽的病理生理改變包括無(wú)明顯的肺部炎癥,以及對(duì)外界環(huán)境的刺激表現(xiàn)為咳嗽敏感性的提高,理想的咳嗽動(dòng)物模型應(yīng)具備上述特點(diǎn)[6]。

單純咳嗽模型是指直接通過(guò)刺激物刺激而制備的咳嗽模型,此類模型常被用于研究咳嗽反射的發(fā)生機(jī)制和咳嗽新藥的研發(fā)等?？人杂梢幌盗猩窠?jīng)反射所構(gòu)成,受刺激后,迷走神經(jīng)傳導(dǎo)信號(hào)至位于延髓的咳嗽中樞,中樞整合后再下傳至相應(yīng)的運(yùn)動(dòng)神經(jīng),進(jìn)而引發(fā)。與咳嗽反射密切相關(guān)的氣道傳入神經(jīng)為Aδ 纖維(有髓鞘)和C 纖維(無(wú)髓鞘),其末梢突觸分別主要感受機(jī)械刺激及化學(xué)刺激。根據(jù)以上神經(jīng)反射機(jī)制,單純咳嗽模型的制備主要有機(jī)械刺激、化學(xué)刺激、電刺激、抗原致敏引咳等方法。

2.1 機(jī)械刺激法

機(jī)械刺激法是指通過(guò)刺激有髓鞘的迷走Aδ 傳入纖維引起單純咳嗽,基本操作方法如下:將細(xì)長(zhǎng)狀纖維如聚乙烯管、兔胡須等置入動(dòng)物喉部或者氣道內(nèi),反復(fù)操作2~3 次,可導(dǎo)致其劇烈、快速的咳嗽;或者用異物直接放入氣管套管內(nèi)操作來(lái)引發(fā)咳嗽。Poliacek 等[8]使用軟聚乙烯導(dǎo)管機(jī)械刺激麻醉貓的胸腔內(nèi)氣道,導(dǎo)管在氣管內(nèi)周期性來(lái)回移動(dòng)6~8 次,持續(xù)10 s,以引起反復(fù)咳嗽,該法所有刺激都由一名實(shí)驗(yàn)者進(jìn)行,以盡量保證刺激強(qiáng)度的可比性。機(jī)械刺激法簡(jiǎn)便易行,但需在麻醉狀態(tài)下進(jìn)行,盡管由同一名實(shí)驗(yàn)者進(jìn)行,仍不能保證刺激強(qiáng)度一致,難以定量比較。

Varechova 等[9]和Foucaud 等[10]使用改良儀器來(lái)進(jìn)行氣管機(jī)械刺激引咳,具體如下:在麻醉兔氣管切開后,置入硅橡膠半剛性導(dǎo)管,穿過(guò)氣管導(dǎo)管的側(cè)端口直至引發(fā)咳嗽(一般距離導(dǎo)管出口3~4 cm)。該導(dǎo)管由一個(gè)小型電機(jī)驅(qū)動(dòng),該電機(jī)旋轉(zhuǎn)導(dǎo)管(每秒60 個(gè)周期)并在短時(shí)間(刺激時(shí)間設(shè)置為150 ms)內(nèi)將其尖端摩擦到氣道粘膜上,而來(lái)自發(fā)動(dòng)機(jī)的電信號(hào)可以作為準(zhǔn)確識(shí)別刺激時(shí)間過(guò)程的標(biāo)記。此種方法雖然較上述方法稍繁瑣,但是可以控制強(qiáng)度,從而能夠定量比較。

2.2 化學(xué)刺激法

化學(xué)刺激法是指采用化學(xué)物質(zhì)(咳嗽刺激劑)刺激呼吸系統(tǒng)引起咳嗽,該法快速簡(jiǎn)便易行、對(duì)樣本傷害小、引咳時(shí)可保證樣本處于清醒狀態(tài),因此常用,其藥物多選用氨水、檸檬酸、辣椒素、異硫氰酸烯丙酯(allylisothiocyanate,AITC)等。

氨水引咳法是常用的化學(xué)刺激法,多采用小鼠進(jìn)行造模。梁婷等[11]采用氨水誘咳造模法如下:以雄性ICR 小鼠為例,在倒扣燒杯(500 mL)中放入一個(gè)棉球,并將300 μL 25%的氨水滴入該棉球中,待1 min 飽和后再將小鼠放入該燒杯中45 s,取出后置于另一燒杯中,對(duì)小鼠咳嗽情況進(jìn)行記錄,觀察典型咳嗽動(dòng)作(腹肌收縮,有咳聲),記錄咳嗽潛伏期(從取出開始到第1 次咳嗽的時(shí)間)及5 min 內(nèi)咳嗽次數(shù)。結(jié)果顯示模型小鼠咳嗽次數(shù)增加,咳嗽潛伏期縮短,提示造模成功。氨水引咳法中,氨水體積濃度常在13%~25%之間,建議在開展正式實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行咳嗽敏感性篩選的預(yù)實(shí)驗(yàn)以確定適合的激動(dòng)劑濃度。使用倒扣燒杯進(jìn)行氨水引咳為常用的簡(jiǎn)便誘咳方法之一,但是燒杯容量、氨水用量、飽和時(shí)間等尚無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn),且氨水揮發(fā)量受溫度、時(shí)間影響。而多功能誘咳引喘儀可以控制藥物定時(shí)、定量、定濃度,保持物質(zhì)原有性質(zhì),相較于使用燒杯進(jìn)行氨水誘咳法更易定量控制,故近年來(lái)應(yīng)用較多[12]。氨水誘咳用量小,較易操作,但吸入氨水對(duì)肺部有損傷,且氨水誘發(fā)小鼠咳嗽反應(yīng)性差異較大,故氨水誘咳制備模型多用于初步篩選鎮(zhèn)咳藥物。

近年來(lái)瞬時(shí)受體電位( transient receptor potential,TRP)家族在咳嗽發(fā)生機(jī)制中的作用逐漸受到關(guān)注。TRP 通道屬于非選擇性的陽(yáng)離子通道蛋白,受環(huán)境溫度、pH、化學(xué)物質(zhì)、滲透壓等刺激后,細(xì)胞內(nèi)外陽(yáng)離子通透性變化,進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞功能。氣道中分布眾多感覺(jué)神經(jīng)元上皮,其可表達(dá)多種TRP 家族成員,被各種外源或內(nèi)源性物質(zhì)激活后,產(chǎn)生各種神經(jīng)肽,繼而出現(xiàn)局部組織血管擴(kuò)張和通透性增加、炎性細(xì)胞滲出、黏膜出血水腫等神經(jīng)源性炎癥現(xiàn)象,導(dǎo)致咳嗽[13-15]。在TRP 家族中,瞬時(shí)感受器電位香草酸受體1(transient receptor potential vanilloid 1, TRPV1) 和瞬時(shí)受體電位錨蛋白1(transient receptor potential ankyrin 1, TRPA1)近年來(lái)研究較為深入,TRPV1 為非選擇性陽(yáng)離子通道,首先被證實(shí)可介導(dǎo)豚鼠咳嗽反射,而TRPA1 為非選擇性鈣離子通道,與TRPV1 相類似,二者均廣泛分布于感覺(jué)神經(jīng)元細(xì)胞,因此其激動(dòng)劑多用于誘咳及評(píng)價(jià)咳嗽敏感性。常用激動(dòng)劑包括檸檬酸、辣椒素、AITC 等[6,16]。

檸檬酸通過(guò)刺激C 纖維上的TRPV1 受體和Aδ傳入纖維末端致咳,造模動(dòng)物多選擇豚鼠或小鼠,其咳嗽模型主要用于咳嗽反射機(jī)制、藥物干預(yù)及新藥開發(fā)等研究,給藥途徑主要包括霧化吸入和局部注射。張童洋子等[17]采用霧化吸入造模具體操作如下:將豚鼠置于雙室體描箱中,頭部和軀體分別在體描箱的頭室和體室內(nèi),超聲霧化器與體描箱的頭室相連,清醒豚鼠每天霧化吸入0.4 mol/L 檸檬酸2 次,每次持續(xù)3 min,共15 d。造模結(jié)束后對(duì)模型豚鼠進(jìn)行咳嗽反應(yīng)性檢測(cè),計(jì)算從吸入激發(fā)溶液到停止吸入后1 min,共3 min 內(nèi)豚鼠出現(xiàn)的咳嗽次數(shù)。結(jié)果顯示模型組豚鼠激發(fā)后咳嗽次數(shù)增加,咳嗽反應(yīng)性增強(qiáng),提示造模成功。檸檬酸常用濃度為0.05~0.80 mol/L,霧化時(shí)間可根據(jù)具體情況及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果適當(dāng)延長(zhǎng),有學(xué)者認(rèn)為,較長(zhǎng)時(shí)間(3 周)的檸檬酸反復(fù)刺激,可以更好的模擬人體慢性咳嗽的疾病過(guò)程[18]。局部注射參照Tanaka 等[19]采用的方法,具體操作如下:腹腔注射麻醉豚鼠后,分離氣管,將聚乙烯導(dǎo)管(內(nèi)徑0.4 mm,長(zhǎng)13 cm)插入氣管至第5-6 氣管軟骨,將導(dǎo)管尖端放置在喉下,距離喉部約10 mm 處固定(導(dǎo)管用線固定于第6 氣管軟骨),導(dǎo)管另一端從背部皮下引出,注射0.4 mol/L 檸檬酸20 μL(注射10 次,每次間隔30 s)以制備豚鼠模型,模型豚鼠咳嗽次數(shù)增加,造模成功。檸檬酸霧化造模較為便捷,但是動(dòng)物真正藥物吸入量難以控制,且通過(guò)霧化給藥常對(duì)局部造成刺激,引起咳嗽之外的混淆動(dòng)作,由于TRPV1 受體分布于全身,檸檬酸霧化易引起豚鼠全身顫抖,故需要探索出提高氣道利用率的方法。相較于此,局部給藥有以下優(yōu)勢(shì):(1)制備過(guò)程中較少引起打噴嚏等混淆動(dòng)作,有利于確定咳嗽癥狀;(2)可改變內(nèi)置導(dǎo)管所在處進(jìn)而來(lái)控制咳嗽刺激物刺激的部位;(3)可以確?？人源碳の镉昧康目杀刃院蜏?zhǔn)確性。但是局部給藥仍存在耗費(fèi)時(shí)間久、需要麻醉、操作技術(shù)復(fù)雜、動(dòng)物死亡率相對(duì)偏高的特點(diǎn),因此臨床上霧化造模更為常用。

辣椒素通過(guò)刺激C 纖維上的TRPV1 受體來(lái)引發(fā)咳嗽,造模動(dòng)物以豚鼠或小鼠為主。辣椒素的研究用途與檸檬酸類似,多用于研究咳嗽反射機(jī)制、藥物開發(fā)等,其給藥途徑與檸檬酸類似。以霧化為例,采用豚鼠造模具體操作如下:將Hartley 豚鼠置于透明塑料廣口瓶中,用超聲霧化器將動(dòng)物暴露于辣椒素水溶液(0.2 mmol/L)中15 s,然后記錄咳嗽次數(shù)和咳嗽潛伏期,共3 min,造模成功入選標(biāo)準(zhǔn)為:10 s＜咳嗽次數(shù)＜50 s(3 min 內(nèi))和10 s＜咳嗽潛伏期＜120 s[20]。Iwata 等[21]選用C57BL/6 小鼠進(jìn)行辣椒素霧化造模,將小鼠置于全身體積描記儀中,用霧化器使小鼠暴露于50 μmol/L 辣椒素中,霧化10 min 引咳。辣椒素霧化濃度多為 0.01~10 mmol/L,具體造模時(shí)間尚無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。與激活多通路的檸檬酸相比,辣椒素造模多用于研究單純TRPV1 通路涉及的咳嗽反射機(jī)制及新藥研究。

AITC 可以特異性激活迷走C 纖維上的TRPA1受體,引起咳嗽的產(chǎn)生,其模型動(dòng)物多選用豚鼠。Sterusky 等[22]在研究雌性和雄性豚鼠咳嗽模型的差異時(shí),使用全身體積描記儀霧化吸入10 mmol/L AITC 5 min 來(lái)建立豚鼠咳嗽模型,其基本操作同檸檬酸及辣椒素誘咳,模型豚鼠咳嗽次數(shù)增加,咳嗽潛伏期縮短,造模成功。Daller 等[23]在Andrè 等[24]基礎(chǔ)上應(yīng)用AITC 誘咳來(lái)評(píng)估自制霧化設(shè)備,具體如下:將Hartley 豚鼠置于裝有麥克風(fēng)、攝像頭和氣壓計(jì)的透明小動(dòng)物麻醉誘導(dǎo)箱中,該誘導(dǎo)箱可以實(shí)時(shí)采集音頻、視頻、氣流和氣壓并進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和分析。制備聚山梨酯80/乙醇(AITC 載體)的50/50溶液,再將AITC 添加到載體溶液中,以達(dá)到80 mmol/L AITC 的濃度,使用自制霧化器進(jìn)行霧化(5 min)成功誘咳,咳嗽次數(shù)增加,造模成功。通常應(yīng)用AITC 濃度為0.3~30 mmol/L,但并非一成不變,可在開展正式試驗(yàn)前進(jìn)行咳嗽敏感性篩選的預(yù)實(shí)驗(yàn)。應(yīng)用AITC 誘咳能夠特異性激活TRPA1 受體,從而進(jìn)行TRPA1 相關(guān)機(jī)制研究。有研究對(duì)比TRPA1 與TRPV1 激動(dòng)劑在誘導(dǎo)咳嗽中產(chǎn)生的效力,顯示AITC(10 mmol/L)誘導(dǎo)的C 纖維活化及咳嗽次數(shù),要比辣椒素(50 μmol/L)弱3 倍左右[6],所以應(yīng)用AITC 進(jìn)行單純誘咳及咳嗽敏感性評(píng)價(jià)較少。

2.3 電刺激法

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物被一定頻率和強(qiáng)度的電刺激后,會(huì)產(chǎn)生咳嗽反射,該方法即為電刺激法,選用動(dòng)物種類較多,常用刺激部位包括:(1)豚鼠或狗的氣管粘膜;(2)豚鼠或貓的喉上神經(jīng);(3)貓延髓的背側(cè)部;(4)狗的胸膜。

在Malandrino 等[25]基礎(chǔ)上,王篤軍等[26]對(duì)豚鼠進(jìn)行電刺激引咳,具體如下:腹腔注射麻醉后進(jìn)行氣管插管,切開頸部皮膚,剝離氣管,插入Y 型氣管套管,一個(gè)支管經(jīng)壓力換能器與PowerLab 數(shù)據(jù)采集分析系統(tǒng)相連接記錄呼吸頻率和振幅,將刺激器的鉑制單電極固定在氣管的背面,盡可能的接近胸部,另一無(wú)關(guān)電極插入胸部皮下組織中,調(diào)節(jié)刺激器,刺激強(qiáng)度3.5 V、脈沖寬度50 ms、頻率每秒10次、刺激時(shí)間20 s,兩次刺激的間隔時(shí)間為5 min,記錄刺激后5 min 內(nèi)豚鼠的咳嗽次數(shù),模型豚鼠咳嗽次數(shù)顯著增加,造模成功。具體參數(shù)尚無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn),如Sugiyama 等[27]通過(guò)電刺激豚鼠含有氣管和喉部傳入纖維的喉返神經(jīng)來(lái)誘發(fā)假想咳嗽,其參數(shù)為脈沖持續(xù)時(shí)間0.2 ms;頻率10 Hz,強(qiáng)度40 ~60 A。

電刺激法的刺激頻率和強(qiáng)度可以定量比較,較機(jī)械刺激法更為準(zhǔn)確。其中,電刺激喉上神經(jīng)引咳法通?？捎糜诔鹾Y出止咳藥物之后,分析藥物是中樞鎮(zhèn)咳還是末梢止咳,從而進(jìn)一步確定藥物的作用部位。然而和機(jī)械刺激法相似,電刺激法需在麻醉狀態(tài)下進(jìn)行,且相較于其他方法來(lái)說(shuō),對(duì)動(dòng)物造成較大損傷,操作也更為復(fù)雜。

2.4 抗原致敏引咳法

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物多次被抗原致敏后,再次予以該抗原或其他致咳劑激發(fā),以提高其咳嗽敏感性,加重咳嗽反應(yīng),即為抗原致敏引咳法,主要用于過(guò)敏性咳嗽動(dòng)物模型的制備(具體內(nèi)容見(jiàn)后文變應(yīng)性咳嗽模型詳細(xì)論述),較辣椒素引起的咳嗽來(lái)說(shuō),該類咳嗽更易被短效β2受體激動(dòng)劑以及抗組胺藥所抑制。

3 疾病咳嗽模型

依據(jù)各國(guó)內(nèi)外指南,咳嗽多分為急性、亞急性及慢性咳嗽,病因各有不同,其中亞急性咳嗽主要是感染后咳嗽(postinfectious cough, PIC),而咳嗽變異性哮喘(cough variant asthma, CVA)、上氣道咳嗽綜合征(upper airway cough syndrome, UACS)、嗜酸性粒細(xì)胞性支氣管炎(eosinophilic bronchitis, EB)、變應(yīng)性咳嗽(atopic cough, AC)、胃食管反流性咳嗽( gastroesophagealreflux-relatedchroniccough,GERC)等則為慢性咳嗽常見(jiàn)病因,咳嗽高敏綜合征也是引起慢性咳嗽的重要因素,不同疾病涉及相對(duì)特異的發(fā)病機(jī)制,據(jù)此進(jìn)行模型制備,可以更好的研究相關(guān)疾病。

3.1 感染后咳嗽模型(PIC)

PIC[1]是指呼吸道急性感染后,咳嗽依然存在,持續(xù)3~8 周,多表現(xiàn)為刺激性干咳,伴或不伴少量白痰,胸片檢查正常,多由病毒性感冒引起,某些細(xì)菌性感染亦可導(dǎo)致。目前病理生理機(jī)制尚未完全明確,呼吸道病原體感染后引起的氣道粘膜損傷、氣道炎癥、咳嗽敏感性增高、一過(guò)性氣道高反應(yīng)、氧化應(yīng)激等是PIC 重要的發(fā)病機(jī)制。據(jù)此,PIC 模型造模方法主要包括病毒滴鼻感染法,脂多糖滴鼻法等,也有在此基礎(chǔ)上結(jié)合煙熏者,常用動(dòng)物包括豚鼠、小鼠、大鼠。

由于病毒性感冒引起PIC 多見(jiàn),故病毒滴鼻感染法為常用方法之一。王敏等[28]采用幼齡Balb/c小鼠作為造模對(duì)象,用乙醚輕度麻醉小鼠,使用半數(shù)組織培養(yǎng)感染量(50% tissue culture infections dose,TCID50)為10-3的呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)病毒懸液滴鼻,共連續(xù)感染3 d,每只50 μL。感染后第13 天對(duì)小鼠行辣椒素激發(fā)試驗(yàn),若小鼠出現(xiàn)咳嗽、抓臉、打噴嚏明顯增多,呼吸加快,腳前伸、頸前伸、腹部收縮等特征體位,且3 min 內(nèi)咳嗽次數(shù)大于10 次,即提示造模成功。該模型采用幼齡Balb/c 小鼠作為造模對(duì)象,與臨床上嬰幼兒更易被RSV 感染造成咳嗽表現(xiàn)一致。有研究表明應(yīng)用RSV 感染Balb/c 小鼠后,RSV 病毒可在模型小鼠體內(nèi)長(zhǎng)期存在,因此,RSV 滴鼻感染法可以模擬亞急性病程,且模型氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性明顯增高,符合PIC 發(fā)病機(jī)制。在該造模過(guò)程中,對(duì)于模型小鼠的肺組織病理、支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)等也進(jìn)行了觀察,結(jié)果顯示模型小鼠肺泡結(jié)構(gòu)改變,氣道炎性細(xì)胞浸潤(rùn),BALF 嗜酸性粒細(xì)胞升高,血清中多種高敏及炎癥相關(guān)的細(xì)胞因子表達(dá)上升,符合PIC 氣道粘膜損傷、氣道炎癥、咳嗽敏感性增高、氣道高反應(yīng)性的發(fā)病機(jī)制特點(diǎn),進(jìn)一步佐證RSV 滴鼻可成功建立感染后咳嗽模型。也有在此基礎(chǔ)上加以煙熏者,吳怡等[29]采用豚鼠制備PIC 模型,將燃有10 支香煙的50 g 刨花置于自制煙熏箱內(nèi),將豚鼠置于該煙熏箱內(nèi)(每籠5 只,每箱6 籠),持續(xù)煙熏30 min,每天1 次,連續(xù)7 d,分別于第2 天和第3 天,經(jīng)鼻腔給藥,給予豚鼠RSV 病毒凍存液(滴度7·106PFU/mL,滴入體積以豚鼠質(zhì)量1 μL/g 計(jì)算),最后一次給藥后,間隔40 min,使用檸檬酸激發(fā)。結(jié)果顯示模型豚鼠肺組織細(xì)胞腫脹、變圓、聚集,細(xì)胞間隙增寬,出現(xiàn)融合細(xì)胞,提示RSV 病毒感染成功。模型豚鼠肺組織大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),肺泡壁增厚,少有肺泡融合,未造成實(shí)質(zhì)性炎癥,且檸檬酸激發(fā)后咳嗽次數(shù)顯著提高,提示產(chǎn)生氣道咳嗽高敏感性,另外,血清中白介素-4(interleukin-4, IL-4)/干擾素-γ(interferon-γ, IFN-γ)比值顯著增高,導(dǎo)致Th1 型與Th2 型免疫細(xì)胞失衡,促進(jìn)炎癥反應(yīng),與PIC 發(fā)病機(jī)制一致。該造模方法將RSV 感染與煙熏結(jié)合起來(lái),相關(guān)研究提示,煙霧刺激可以形成氣道高反應(yīng)性及咳嗽高敏感性,因此結(jié)合煙熏可以更好的復(fù)制PIC 的發(fā)病機(jī)制[30]。

革蘭氏陰性菌是細(xì)菌感染致PIC 主要的致病菌之一[31],脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是衡量革蘭氏陰性菌致病力大小的關(guān)鍵毒素,能激發(fā)動(dòng)物的強(qiáng)烈免疫反應(yīng),從而可能引起PIC 的炎癥反應(yīng),故目前采用LPS 造模也較為多見(jiàn),多通過(guò)氣管內(nèi)滴注、滴鼻或霧化途徑,常合并煙熏法或辣椒素霧化。Zhao 等[32]利用LPS 氣管內(nèi)滴注聯(lián)合煙熏造模,具體如下:腹腔注射麻醉ICR 小鼠后行氣管插管(長(zhǎng)30 mm,外徑1.5 mm)。使小鼠呈仰臥抬頭位,經(jīng)氣管插管插入靜脈導(dǎo)管,注入含有80 μg LPS 的無(wú)菌生理鹽水50 μL。第8 天,將小鼠置于煙室中,每天暴露于5 支香煙中30 min,共30 d 完成造模,記錄小鼠咳嗽次數(shù),收集小鼠血液、肺泡灌洗液、肺組織等進(jìn)行檢測(cè)。小鼠模型出現(xiàn)咳嗽次數(shù)增加,提示咳嗽敏感性增高,肺泡灌洗液中白細(xì)胞及中性粒細(xì)胞升高,血清中促炎細(xì)胞因子白介素-6(interleukin-6,IL-6)和C-反應(yīng)蛋白(C-reactive protein,CRP)水平顯著升高,支氣管血管周圍中性粒細(xì)胞聚集,支氣管粘膜上皮腫脹脫落,氣道腔內(nèi)有炎性細(xì)胞滲出,提示存在呼吸道黏膜損傷、氣道炎癥,造模成功。此外,氧化應(yīng)激在PIC 的發(fā)生發(fā)展中起重要作用,該模型小鼠血清和組織勻漿中超氧化物歧化酶活性明顯下降、丙二醛含量上升,提示造模小鼠存在過(guò)氧化。Zhao 等[32]利用LPS 滴注和香煙霧化,成功復(fù)制了伴有咳嗽敏感性增高、呼吸道黏膜損傷、氣道炎癥、氧化應(yīng)激等PIC 發(fā)病機(jī)制特點(diǎn)的模型。然而氣管內(nèi)滴注操作較為復(fù)雜,小鼠死亡風(fēng)險(xiǎn)高,霧化或鼻內(nèi)滴注法則相對(duì)簡(jiǎn)便[33-34]。Zhu 等[35]采用LPS 霧化聯(lián)合煙熏、辣椒素霧化制備PIC 模型,將SD 大鼠置于0.5 平方米的煙室中,以10 支香煙,煙熏10 d,每天1 次,每次30 min,在第11、14 和17天,將大鼠乙醚麻醉后使用LPS 霧化,在250 μL 磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline, PBS)中加入20 μg LPS,第12、13、15、16、18 天霧化吸入辣椒素(10-4mol/L)每天1 次,每次3 min,收集肺泡灌洗液、肺組織。模型大鼠肺泡灌洗液中白細(xì)胞總數(shù)及巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞百分比均顯著升高,支氣管上皮大量壞死脫落,支氣管腔擴(kuò)張,支氣管壁及周圍組織有大量淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞滲入,提示氣道粘膜損傷,出現(xiàn)呼吸道炎癥,且模型組肺泡灌洗液中神經(jīng)肽類物質(zhì)如P 物質(zhì)(substance P, SP)、神經(jīng)激肽A(neurokinin A, NKA)、神經(jīng)激肽B(neurokinin B, NKB)、降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene-related peptide, CGRP)值顯著升高,提示氣道神經(jīng)源性炎癥存在,其是咳嗽敏感性增高的物質(zhì)基礎(chǔ),造模成功。該造模方法中采用LPS 霧化造模,用量較小,可能與結(jié)合辣椒素激發(fā)增加咳嗽敏感性相關(guān),由于不同濃度的LPS 可誘導(dǎo)不同程度的氣道炎癥,故可調(diào)整LPS 劑量使得氣道炎癥更好模擬PIC 的病理特點(diǎn)。LPS 滴鼻聯(lián)合煙熏法易重復(fù),可操作性較好,但是造模時(shí)間較久,仲坤等[31]通過(guò)增加香煙數(shù)量來(lái)縮短造模周期,結(jié)果顯示,以13 支香煙進(jìn)行煙熏,可將造模時(shí)間由傳統(tǒng)煙熏造模的10 d 縮短至7 d,成功建立了一種短周期的造模方法:采用Wistar 大鼠(雄性,180~220 g),置于煙室中,13 支香煙,每日煙熏15 min,每天1次,共7 d。煙熏結(jié)束后的第1、4、7 天,各組大鼠鼻腔滴入含0.4 mg/mL 的LPS,以1 mL/kg 的體積滴入鼻腔。第2、3、5、6 天將該組大鼠置于密閉容器中以檸檬酸溶液霧化激發(fā)(2.5 mol/L),每天1 次,每次5 min。觀察各組大鼠狀態(tài)并于末次滴鼻24 h 后測(cè)定相關(guān)指標(biāo)。模型大鼠檸檬酸激發(fā)咳嗽潛伏期縮短,咳嗽次數(shù)明顯增多,肺泡灌洗液中白細(xì)胞的數(shù)量增多,模型大鼠肺組織病理切片可見(jiàn)明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn),肺內(nèi)細(xì)支氣管上皮細(xì)胞脫落,支氣管壁增厚,病變區(qū)域的比例大于正常區(qū)域的比例,符合感染后咳嗽的病理特征。

3.2 變應(yīng)性/過(guò)敏性咳嗽模型(AC)

與日本學(xué)者對(duì)AC 的定義不同,我國(guó)指南中AC不包括嗜酸性粒細(xì)胞性支氣管炎。據(jù)此國(guó)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)診斷的AC 患者具有特應(yīng)質(zhì)、痰嗜酸性粒細(xì)胞正常、無(wú)氣道高反應(yīng)性等特征,糖皮質(zhì)激素、抗組胺藥物治療有效。然而其發(fā)病機(jī)制有待進(jìn)一步明確,可能與環(huán)境暴露刺激或吸入變應(yīng)原致咳嗽敏感性升高以及非嗜酸粒細(xì)胞性氣道炎癥相關(guān)[6,36]。豚鼠免疫系統(tǒng)發(fā)達(dá),咳嗽反射與人類相似,故多使用豚鼠進(jìn)行AC 造模。

AC 模型為研究咳嗽敏感性增高的常用模型[6],其利用抗原(卵蛋白腹腔注射)多次致敏后,再次予以抗原激發(fā),可顯著提高其咳嗽敏感性,模擬過(guò)敏性咳嗽的病理生理過(guò)程,目前比較成熟的造模是參照Muraki 等[37]方法建立的豚鼠過(guò)敏性咳嗽模型,具體如下:以豚鼠(200~250 g)為例,第1 天豚鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺30 mg/kg,第3 天在腹腔注射1 mL 2 mg 卵蛋白(ovalbumin, OVA) +100 mg 氫氧化鋁混懸液,3 周后腹腔注射1 mL 0.01 mg OVA+100 mg 氫氧化鋁的混懸液來(lái)加強(qiáng)豚鼠致敏。加強(qiáng)免疫后3 周,給予霧化吸入10 mg/mL 的OVA 溶液90 s 激發(fā),計(jì)數(shù)3 min 內(nèi)的咳嗽次數(shù),篩選出對(duì)刺激有咳嗽反射,咳嗽次數(shù)＞10 次,并能重復(fù)發(fā)生的豚鼠。賴克方[6]利用上述造模方法復(fù)制的豚鼠AC 模型,在激發(fā)后72 h,具有干咳(支氣管擴(kuò)張劑處理有效)、無(wú)喘息、組織病理示全氣道嗜酸粒細(xì)胞炎癥、氣道反應(yīng)性輕度升高的特點(diǎn),據(jù)此得出該模型可以模擬人類CVA 模型。然而AC 患者中心氣道粘膜活檢可見(jiàn)嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn),無(wú)外周氣道嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn),后者是EB 的特征。該模型對(duì)支氣管擴(kuò)張劑反應(yīng)性好、出現(xiàn)全氣道嗜酸性炎癥及氣道反應(yīng)性輕度升高,與我國(guó)臨床AC 診斷標(biāo)準(zhǔn)有較大出入,需進(jìn)一步完善。

為了減輕過(guò)度致敏狀態(tài),多使用環(huán)磷酰胺注射加強(qiáng)免疫抑制或減少OVA 用量,王謙等[38]比較環(huán)磷酰胺+高劑量OVA 及低劑量OVA 兩種主動(dòng)免疫過(guò)程,分析咳嗽頻次及氣道激發(fā)情況,發(fā)現(xiàn)后者氣道收縮反應(yīng)更為強(qiáng)烈,乙酰甲膽堿濃度閾值較低,更偏向于哮喘模型,而前者隨著乙酰甲膽堿濃度增高而平緩上升,可很好的模擬咳嗽敏感性增高狀態(tài),可以得出,加入免疫抑制劑的模型較單純減少主動(dòng)免疫OVA 劑量模型更優(yōu),但仍存在豚鼠死亡率較高、咳嗽反應(yīng)均一性較差等問(wèn)題,之后研究可以考慮在加用免疫抑制劑的同時(shí)控制OVA 用量,以期降低豚鼠死亡率,建立更符合臨床AC 特征的動(dòng)物模型。

3.3 咳嗽變異性哮喘模型(CVA)

CVA 是一種以咳嗽為主要表現(xiàn)的特殊類型哮喘,不伴有明顯喘息胸悶等典型哮喘癥狀,氣道炎癥主要以嗜酸性粒細(xì)胞為主,具有氣道高反應(yīng)性,是慢性咳嗽最常見(jiàn)病因,約占1/3。CVA 的發(fā)病原因與遺傳因素和環(huán)境理化因素相關(guān),接觸各種過(guò)敏原對(duì)于本病的發(fā)生有一定的促進(jìn)作用。與典型哮喘相似,其發(fā)病機(jī)制與氣道高反應(yīng)性、神經(jīng)機(jī)制、多種細(xì)胞參與的氣道慢性炎癥和免疫球蛋白E(immunoglobulin E, IgE)介導(dǎo)的變態(tài)反應(yīng)有關(guān)。但是CVA 的咳嗽敏感性較高、氣道反應(yīng)性較典型哮喘低、喘鳴閾值較哮喘高,是其有別于典型哮喘的機(jī)制特點(diǎn)[6]。常用動(dòng)物包括豚鼠、小鼠、大鼠。

既往CVA 的造模方法多參考AC 造模[37]。呂天宜等[39]在前人基礎(chǔ)上,用OVA 聯(lián)合煙熏建立相似度更高的豚鼠CVA 模型,CVA 的發(fā)病可能與接觸過(guò)敏原相關(guān),且煙熏可提高氣道反應(yīng)性,這為該造模方法提供了理論依據(jù),具體如下:先適應(yīng)性喂養(yǎng)豚鼠3 d,第4 天腹腔注射0.2% OVA 溶液1 mL,第11 天腹腔注射增敏OVA 溶液1 mL(OVA 增敏溶液:將0.01 mg OVA 和100 mg 氫氧化鋁溶于1 mL

NS 中),第18~24 天以1.0% OVA 霧化攻擊豚鼠,每天每次60 s,同時(shí)第4~24 天每天煙熏30 min。成模標(biāo)準(zhǔn):首次咳嗽時(shí)間明顯提前、咳嗽次數(shù)明顯增多;氣道阻力平緩上升;肺組織嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)增多。該豚鼠CVA 模型在咳嗽反應(yīng)、肺功能測(cè)定、肺組織病理學(xué)表現(xiàn)三方面均符合CVA 特征,且咳嗽次數(shù)顯著上升、首次咳嗽時(shí)間明顯提前、氣道阻力上升更加平緩,表明OVA 聯(lián)合煙熏造模CVA豚鼠的方法有更好的咳嗽敏感性,更加符合CVA 氣道高反應(yīng)性較典型哮喘略低的重要特征,該法可行性強(qiáng),重復(fù)性和穩(wěn)定性好。不同學(xué)者在進(jìn)行造模時(shí)藥物用量有所差別,且通過(guò)改變OVA 的劑量、注射時(shí)間及次數(shù)和煙熏劑量等可以建立特殊類型的CVA 模型,如糖皮質(zhì)激素不敏感CVA 模型等[40],這也為建立特殊類型的其他疾病咳嗽模型提供了相關(guān)思路。

也可采用大鼠與小鼠來(lái)建立CVA 模型,多采用OVA 造模,或聯(lián)合煙熏,侯丹等[41]采用OVA 致敏SD 大鼠造模的方法具體如下:分別于第1、8 天向SD 大鼠腹腔注射1 mL 致敏液(含OVA 100 mg,氫氧化鋁 0.25 mL,生理鹽水0.75 mL);第15 天開始每天霧化吸入1% OVA 溶液,激發(fā)20 min(流量 2 mL/min),連續(xù)14 d,造模結(jié)束。模型大鼠第0.1 秒用力呼氣量(forced expiratory volume 0.1, FEV 0.1),第0.1 秒用力呼氣量與用力肺活量(forced vital capacity, FVC)之比(FEV0.1/FVC),用力呼氣中期流速(forced expiratory flow 50%, FEF50%)明顯降低,外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著升高,血清炎性因子IL-4、IL-5、IL-10 水平升高,肺組織及支氣管可見(jiàn)結(jié)構(gòu)破壞、大量炎細(xì)胞浸潤(rùn),肺組織核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor-kappa B, NFκB)p65 蛋白表達(dá)升高,IκBα (inhibitor of NF-κB)蛋白表達(dá)降低,提示模型豚鼠氣道反應(yīng)性升高,存在氣道炎癥,符合CVA 患者的臨床特征。甘雨等[42]采用SD 大鼠復(fù)制CVA 模型,在卵蛋白注射致敏的基礎(chǔ)上,每天在熏煙箱中熏煙30 min,連續(xù)2周。聯(lián)合煙熏法與單純卵蛋白注射法造模結(jié)果區(qū)別不大,為減少操作的復(fù)雜性,目前多采用單純卵蛋白造模的方法。在大鼠選擇方面,Brown-Norway(BN)大鼠是高免疫球蛋白(尤其是IgE)的應(yīng)答品系,更易誘發(fā)出氣道變應(yīng)性炎癥與氣道高反應(yīng)性,故較SD 大鼠、Wistar 大鼠等更適合進(jìn)行CVA 的造模。楚慧倫等[43]采用BN 大鼠建立了一種較為簡(jiǎn)便易行的CVA 大鼠模型,具體如下:BN 大鼠,體重180~200 g,第1 天腹腔注射2 mg OVA 和100 mg 氫氧化鋁,3 周后再次腹腔注射0.01 mg OVA 及100 mg 氫氧化鋁,3 周后用1% OVA 進(jìn)行霧化攻擊,隔天1 次,共7 次,造模結(jié)束,其咳嗽癥狀和氣道高反應(yīng)性符合CVA 的臨床癥狀,但其免疫反應(yīng)特征尚需進(jìn)一步探索。

也有應(yīng)用小鼠制備CVA 模型的報(bào)道,Hua等[44]采用以下方法制備該模型:在D1 和D14,腹腔注射80 μg OVA 和等量氫氧化鋁進(jìn)行致敏。第2次致敏10 d 后起,小鼠每天使用OVA 霧化(1.5%OVA 溶解在0.9% 生理鹽水中)激發(fā)45 min,共持續(xù)20 d,造模結(jié)束,測(cè)定其氣道反應(yīng)性增高,為造模成功的重要指標(biāo)。小鼠體積小,活動(dòng)靈敏,注藥等操作較為困難,且小鼠自主呼吸及肺功能測(cè)定難度較大,故不是CVA 造模首選動(dòng)物。

3.4 上氣道咳嗽綜合征模型(UACS)

UACS 舊稱鼻后滴流綜合征(postnasal drip syndrome,PNDS),指鼻部分泌物倒流至咽喉等部位,直接或間接刺激該處咳嗽感受器,引起以咳嗽為主要特征的疾病,其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明,且與鼻后滴流的相關(guān)性也并不確切,因此指南提議用UACS 替代PNDS[36]。除鼻后滴流學(xué)說(shuō)以外,其病理生理學(xué)機(jī)制可能與氣道炎癥、感覺(jué)神經(jīng)敏感性增高、鼻功能異常等相關(guān)[6]。本病造模方法較少,目前采用SD 大鼠進(jìn)行造模。

UACS 被認(rèn)為與鼻炎、鼻竇炎性疾病以及咽喉炎、扁桃體炎等相關(guān)[1],基于國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn),曹治山等[45]使用膨脹海綿填塞鼻腔聯(lián)合香煙霧化SD 大鼠的方法進(jìn)行造模,具體如下:將膨脹明膠海綿片(3 mm×5 mm)置入麻醉后大鼠左側(cè)鼻腔的竇口鼻道復(fù)合體處(距離前鼻孔約15 mm),后于該側(cè)鼻腔內(nèi)滴注0.5 mL 金葡菌懸濁液,海綿放置4 周后,讓大鼠被動(dòng)吸煙2 h/d,連續(xù)20 d,具體被動(dòng)吸煙方法為將大鼠置于煙熏箱內(nèi),3 支香煙/次,持續(xù)20 min,共3次,燃燒9 支香煙,6 h 后重復(fù)第2 輪。自香煙霧化結(jié)束后開始觀察30 min,以抓鼻、噴嚏、咳嗽、清喉等系列癥狀的嚴(yán)重程度設(shè)置評(píng)分標(biāo)準(zhǔn),若總分超過(guò)5分,則造模成功,同時(shí)出現(xiàn)鼻竇黏膜充血水腫,鼻竇、咽喉大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn),血清炎性介質(zhì)IL-8、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)水平明顯升高。鼻竇炎是UACS 發(fā)病的原因之一,本法聯(lián)合了鼻竇炎的造模,符合UACS 的發(fā)病特點(diǎn),而短時(shí)間的煙霧刺激也增加了氣道炎癥。該造模方法避開了致敏,將鼻竇疾病與氣道炎癥等因素結(jié)合起來(lái),符合鼻竇炎導(dǎo)致UACS 的臨床表現(xiàn)和機(jī)制特點(diǎn)。但由于咳嗽病因十分復(fù)雜,此造模過(guò)程還必須排除其他導(dǎo)致咳嗽的可能因素。且臨床上UACS 的發(fā)病還可由于慢性鼻炎、過(guò)敏性鼻炎等其他鼻部疾病以及咽喉疾病造成,故單一的鼻竇炎聯(lián)合氣道炎癥模型不能完全模擬該病,還需要聯(lián)合其他疾病模型或從病理生理機(jī)制層面對(duì)本病進(jìn)行模型復(fù)制。

3.5 嗜酸粒細(xì)胞性支氣管炎模型(EB)

EB 部分臨床表現(xiàn)類似CVA,以咳嗽為主要癥狀,特征是氣道內(nèi)嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn),因而檢查痰中嗜酸性粒細(xì)胞增高,而氣道炎癥范圍及平滑肌肥大細(xì)胞浸潤(rùn)密度均低于哮喘,氧化應(yīng)激水平、炎癥程度則低于CVA[36],無(wú)氣道反應(yīng)性,糖皮質(zhì)激素療效確切。造?？蛇x用豚鼠或小鼠。

目前尚無(wú)一種動(dòng)物模型可模擬人類EB 的所有特征,國(guó)內(nèi)外研究者常以EB 的病理基礎(chǔ)嗜酸粒細(xì)胞性氣道炎癥和無(wú)氣道高反應(yīng)性作為造模成功的標(biāo)準(zhǔn)[46]。研究表明多粘菌素B 可以導(dǎo)致豚鼠嗜酸性肺炎,故而既往采用多粘菌素B 刺激的方法建立EB 模型。Ogawa 等[46]采用多黏菌素B 點(diǎn)鼻的方法進(jìn)行EB 豚鼠造模,具體如下:Hartley 豚鼠(300~350 g),輕度麻醉后,經(jīng)鼻給予多粘菌素B 生理鹽水溶液(5 mg/(mL·kg)),每周2 次,一共3 周。末次注射多粘菌素B 6 d 后進(jìn)行觀察,BALF 中嗜酸性粒細(xì)胞比例較模型組明顯升高,氣管、支氣管粘膜有大量嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn),而肺泡結(jié)構(gòu)、氣道反應(yīng)性正常,予多梯度辣椒素行咳嗽激發(fā)時(shí)模型豚鼠咳嗽次數(shù)明顯增加,咳嗽敏感性增高,符合EB 的病理基礎(chǔ)。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇豚鼠或Balb/c 小鼠,豚鼠的研究較早,而小鼠被認(rèn)為是過(guò)敏性氣道炎癥研究的標(biāo)準(zhǔn)模型,且Balb/c 小鼠具有基因型穩(wěn)定、大小相似、易重復(fù)等特點(diǎn),相關(guān)生物學(xué)試劑和抗體易獲得,故而近來(lái)相關(guān)研究多選用小鼠造模。李琳等[47]采用多粘菌素B 滴鼻的方法成功復(fù)制了EB 小鼠模型,具體如下:選用雌性Balb/c 小鼠,18~19 g,予12 μL的0.5%多粘菌素B 滴鼻,每天1 次,共21 d,造模結(jié)束。結(jié)果顯示多粘菌素B 滴鼻造模的小鼠BALF中嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)明顯升高,且與對(duì)照組相比,肺順應(yīng)性及氣道阻力無(wú)明顯差異,故而認(rèn)為該造模方法體現(xiàn)了EB 嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn),無(wú)氣道高反應(yīng)性的兩個(gè)病理生理學(xué)特征,造模成功,且該實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了嗜酸性粒細(xì)胞激活在氣道高反應(yīng)性上起重要作用。然而由于多粘菌素B 僅是肥大細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞釋放組胺的刺激劑,并不是公認(rèn)的抗原刺激劑,因此該模型是否能真正模擬人類EB 的病因及其發(fā)生、發(fā)展,仍有待進(jìn)一步的探索[6]。

鐘南山團(tuán)隊(duì)模擬哮喘模型,通過(guò)改變卵蛋白激發(fā)途徑、頻次、劑量及變應(yīng)原顆粒大小建立了無(wú)氣道高反應(yīng)性的嗜酸性粒細(xì)胞氣道炎癥小鼠模型[48-49]。陳莉延通過(guò)與哮喘小鼠模型同等劑量OVA 進(jìn)行滴鼻激發(fā),減少滴鼻次數(shù)可得到該小鼠模型,具體方法如下:于第0、7、14 天腹腔注射200 μL 10 μg OVA 和1.3 mg Al(OH)3生理鹽水混懸液致敏小鼠,第21、22、23 天腹腔注射戊巴比妥鈉50 mg/kg,并給予10 μg OVA 滴鼻激發(fā)。霧化辣椒素(0.1 mmol/L)用于咳嗽刺激,并使用Finepointe 軟件自動(dòng)檢測(cè)、記錄小鼠的咳嗽頻率,進(jìn)而測(cè)定咳嗽敏感性;麻醉小鼠后將其置于體積描記器室內(nèi),使用小動(dòng)物呼吸機(jī)輔助通氣,呼吸機(jī)設(shè)置:頻率120 times/min,潮氣量0.2 mL。在PBS 刺激后,以及在使用濃度分別為6.25 mg/mL、12.5 mg/mL 和25 mg/mL 的乙酰甲膽堿(methacholine, MCh)霧化時(shí),測(cè)量肺阻力的變化,進(jìn)而評(píng)估動(dòng)物的氣道反應(yīng)性。該模型具有慢性咳嗽、氣道嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、對(duì)類固醇治療有反應(yīng)、無(wú)氣道高反應(yīng)性的基本特征,可以較為完善的復(fù)制EB 模型。

3.6 胃食管反流性咳嗽模型(GERC)

GERC 是指胃酸或其他胃內(nèi)容物反流至食管導(dǎo)致的咳嗽,發(fā)病率亦較高,目前其發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚,主要包括反流理論和反射理論,如微量誤吸、食管-支氣管反射、食管運(yùn)動(dòng)功能失調(diào)、自主神經(jīng)功能失調(diào)與氣道神經(jīng)源性炎癥等,其中食管-支氣管反射引起的氣道神經(jīng)源性炎癥及中樞咳嗽高敏感性在GERC 的發(fā)病過(guò)程中起重要作用,食管細(xì)菌定植也可能影響其發(fā)生和發(fā)展[6,50]。

既往文獻(xiàn)曾報(bào)道的大鼠、狗、兔等模型,多通過(guò)全胃切除+食管-空腸吻合術(shù)、賁門成形等手術(shù)建立,手術(shù)復(fù)雜,術(shù)后死亡率高,因此使用手術(shù)構(gòu)建GERC 模型較為困難[6]。賴克方團(tuán)隊(duì)使用反復(fù)食管滴注鹽酸建立了相關(guān)模型,多采用豚鼠、大鼠,制備方法如下:選取豚鼠(350~450 g),灌注前氯氨酮50 mg/kg,腹腔注射輕度麻醉豚鼠,插入5F 胃管于食管中下段,胃管上端則外接輸液泵,以8 drops/min速度滴入0.1 mol/L HCI(包括0.5%胃蛋白酶)至食管下段,20 min/d,灌注時(shí)用繃帶固定好豚鼠,使其呈頭部墊高的仰臥位,連續(xù)14 d[51-52],造模結(jié)束后,光鏡下可見(jiàn)食管下段粘膜基底細(xì)胞層增生,乳頭延長(zhǎng),過(guò)度角化,部分食管鱗狀上皮過(guò)度增生、核形態(tài)發(fā)生改變,與食管炎模型類似,且在光鏡下可以觀察到模型豚鼠的氣管、支氣管組織有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),同時(shí)可引起豚鼠氣道神經(jīng)源性炎癥。該法可成功復(fù)制伴有氣管、支氣管黏膜炎癥的豚鼠GERC模型,而迷走神經(jīng)切斷術(shù)可以減輕該模型豚鼠的神經(jīng)源性呼吸道炎癥和延髓神經(jīng)元的活動(dòng)。利用大鼠制備GERC 模型方法同上[50],藥物劑量、時(shí)間、操作方法相同,在此基礎(chǔ)上,以檸檬酸(0.8 mol/L)處理5 min,每天1 次,連續(xù)14 d 誘發(fā)咳嗽,進(jìn)而發(fā)現(xiàn)了在鹽酸灌流和檸檬酸誘發(fā)咳嗽的大鼠模型中,出現(xiàn)了多個(gè)延髓核團(tuán)的興奮,推斷相關(guān)神經(jīng)元可能參與了GERC。

3.7 其他咳嗽敏感增高模型

由于慢性咳嗽患者普遍存在咳嗽高敏感性,故近年來(lái)提出咳嗽高敏綜合征(cough hypersensitivity syndrome,CHS)這一概念?？人悦舾行允侵竿饨绱碳C(jī)體時(shí),其表現(xiàn)的咳嗽難易程度?？人愿呙舾行允锹钥人灾匾呐R床與病理生理學(xué)特征,其發(fā)生機(jī)制尚未完全明確,目前國(guó)內(nèi)外研究認(rèn)為與TRP 通路及嘌呤受體P2X3(purinergic P2X3)激活、氣道炎癥、神經(jīng)通路及咳嗽中樞的易化等相關(guān)[6]。

在構(gòu)建動(dòng)物模型時(shí)應(yīng)盡量與CHS 病理生理學(xué)改變類似,即在較低水平的溫度、機(jī)械及化學(xué)刺激時(shí)即可表現(xiàn)出較為顯著的咳嗽高敏感性,而以非特異性氣道炎癥為主或無(wú)明顯的肺部炎癥改變。目前構(gòu)建咳嗽高敏感性模型的方法包括空氣污染物暴露、病毒感染等[6]。

空氣污染問(wèn)題日益突出,對(duì)呼吸健康有著較多不利影響,機(jī)動(dòng)車燃燒排放的廢氣是空氣污染的主要來(lái)源,而柴油機(jī)動(dòng)車可以排放更多的細(xì)顆粒物(particulate matter, PM)、NOX。陳法桂[53]既往以柴油尾氣暴露誘導(dǎo)咳嗽敏感增高模型,具體如下:暴露前篩選出咳嗽敏感性正常的豚鼠,構(gòu)建柴油發(fā)動(dòng)機(jī)尾氣與暴露室連通的裝置,待室內(nèi)顆粒物濃度穩(wěn)定到目標(biāo)濃度時(shí),將豚鼠放入暴露室內(nèi)進(jìn)行暴露,以PM2.5 的濃度作為主要指標(biāo),目標(biāo)濃度為200 μg/m3,每日暴露于柴油尾氣環(huán)境3 h,連續(xù)暴露14 d,尾氣暴露結(jié)束之后的第12 h,對(duì)照組豚鼠和所有暴露組豚鼠進(jìn)行咳嗽激發(fā)試驗(yàn)。暴露組豚鼠咳嗽次數(shù)增加,咳嗽潛伏期變短,BALF 細(xì)胞總數(shù)增多,以中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞為主,且隨尾氣濃度增加而上升,肺組織病理顯示不同程度的支氣管周圍炎,SP 增加,肺組織、結(jié)狀神經(jīng)節(jié)和頸靜脈神經(jīng)節(jié)的TRPA1 表達(dá)增加,說(shuō)明柴油尾氣誘導(dǎo)的豚鼠非特異性氣道炎癥與氣道神經(jīng)源性炎癥和TRPA1 的表達(dá)相關(guān)。該實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的柴油尾氣室內(nèi)暴露可成功誘導(dǎo)豚鼠咳嗽敏感性增高,實(shí)驗(yàn)條件穩(wěn)定可控,低濃度尾氣暴露組的PM2.5 濃度為(210±60)μg/m3,與真實(shí)世界PM2.5 濃度更相近,因此該暴露濃度可以作為造模參考。該團(tuán)隊(duì)也提出一個(gè)自然實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蚚54],即將豚鼠暴露于交通隧道的交通尾氣污染物中7~14 d(珠江隧道,平均每小時(shí)車輛數(shù)量超過(guò)2000 輛,交通尾氣濃度遠(yuǎn)高于過(guò)濾空氣環(huán)境,與交通相關(guān)的PM2.5 大約是過(guò)濾空氣中的4 倍),交通尾氣污染物暴露可增加豚鼠自發(fā)性咳嗽,引起B(yǎng)ALF 中嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的顯著增加,并導(dǎo)致氣管和支氣管粘膜下層嗜酸性粒細(xì)胞的顯著浸潤(rùn),可被地塞米松顯著抑制,說(shuō)明該造模方法可誘導(dǎo)豚鼠的咳嗽敏感性增高和非過(guò)敏性嗜酸性炎癥,自然實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ涂梢愿玫臄M合實(shí)際暴露條件,有利于更真實(shí)地研究城市大氣污染致病機(jī)制,但是存在地點(diǎn)和濃度的差異,操作中亦有諸多不便,因此建議將自然條件與室內(nèi)暴露進(jìn)行有機(jī)結(jié)合,以期完善該類模型。

此外亦有香煙煙霧誘導(dǎo)模型:Zhong 等[55]和Xiang 等[56]使用煙熏造模豚鼠咳嗽高敏感性模型:1 d 煙熏兩次,每次10 支香煙,連續(xù)14 d,最后一次煙熏暴露24 h 后使用0.8 mol/L 檸檬酸1 min 霧化攻擊誘咳,分別于霧化1 min 和霧化5 min 后用Buxco系統(tǒng)自動(dòng)檢測(cè)和記錄咳嗽次數(shù)。模型組豚鼠的咳嗽頻率顯著增加,潛伏期變短,BALF 中細(xì)胞總數(shù)增加,中性粒細(xì)胞比例升高,肺組織中炎性細(xì)胞浸潤(rùn)增加,中央氣道上皮和粘膜增厚,小氣道上皮和平滑肌明顯增厚,正常肺泡結(jié)構(gòu)消失,肺組織中的TNF-α 和IL-8 水平顯著升高,該團(tuán)隊(duì)建立的香煙暴露慢性咳嗽豚鼠模型不僅咳嗽敏感度增加,而且明顯激活非特異性呼吸道炎癥,是誘導(dǎo)咳嗽敏感性增高的可行模型。

4 小結(jié)

咳嗽發(fā)病率高,社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)重,逐漸成為研究熱點(diǎn)。隨著近年來(lái)分子生物學(xué)和神經(jīng)生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展和應(yīng)用,多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)相互影響的神經(jīng)生理反射機(jī)制逐漸被認(rèn)識(shí),相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究方法日趨完善。豚鼠是目前研究咳嗽最常用的動(dòng)物,而隨著新技術(shù)的發(fā)展,轉(zhuǎn)基因型小鼠和大鼠的應(yīng)用也日漸增多,根據(jù)研究目的不同可選擇應(yīng)用單純咳嗽模型和疾病相關(guān)動(dòng)物模型。然而目前咳嗽模型還存在以下問(wèn)題:盡管咳嗽模型有著較為完善的造模原理及方法,但少有規(guī)范統(tǒng)一的藥物劑量、時(shí)間、給藥方式等,且每個(gè)疾病成模標(biāo)準(zhǔn)及評(píng)價(jià)方法不一,多根據(jù)各課題組經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行調(diào)整,難以形成標(biāo)準(zhǔn)的造模體系;另外針對(duì)慢性咳嗽不同疾病分類有著特殊的臨床表現(xiàn),譬如CVA 表現(xiàn)為刺激性干咳、夜間及凌晨咳嗽為主,動(dòng)物模型難以模仿這些咳嗽特征;目前咳嗽模型多為誘咳,自發(fā)性咳嗽模型較少;動(dòng)物模型致敏方式多以腹腔注射為主,與人類致敏的方式有一定差距;某些動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示有效的咳嗽抑制藥物在實(shí)際臨床上效果并不滿意,Plevkova 等[57]認(rèn)為無(wú)特定病原體(specific pathogen free, SPF)級(jí)動(dòng)物腸道和呼吸道微生物群的異質(zhì)性可能是動(dòng)物研究顯示有希望的藥物開發(fā)和未能轉(zhuǎn)化為人類有效藥物之間的脫節(jié)原因,往后可就此展開系列研究以評(píng)估SPF 級(jí)動(dòng)物模型的應(yīng)用。這些問(wèn)題說(shuō)明目前咳嗽動(dòng)物模型與臨床疾病表現(xiàn)還有一定距離,而相關(guān)模型的制備也需進(jìn)一步標(biāo)準(zhǔn)化,為研究的深入及藥物開發(fā)提供基礎(chǔ)。