李 瑩,王 瑩,孔明望

(湖北中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,武漢 430065)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是一種進(jìn)行性神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。我國現(xiàn)已成為世界上AD 患者數(shù)量最多的國家[1]。AD 的病理機(jī)制復(fù)發(fā)多樣,目前尚無特異性的治療藥物。自噬和凋亡在AD 的病理進(jìn)展中起重要作用。自噬與AD 基本病理特點(diǎn)的關(guān)系密切,影響Aβ 的產(chǎn)生和代謝以及Tau 蛋白的組裝,自噬功能失調(diào)可能加速AD 的進(jìn)展[2]。失調(diào)的凋亡級聯(lián)反應(yīng)可以導(dǎo)致異常神經(jīng)元丟失,且可能先于AD 病理性特征出現(xiàn),與癡呆程度密切相關(guān)[3]。因此,調(diào)控細(xì)胞自噬及凋亡,已成為研究防治AD 的重要途徑。

補(bǔ)腎健脾開心方是本課題組對《本草綱目》中益智及輕身延年藥物進(jìn)行分析總結(jié),并選取其中組成唐代孫思邈《千金要方》的名方“開心散”及六味地黃丸中“三補(bǔ)”的藥物配伍而成的自擬方。全方取先天后天互滋互用為思路,滋脾腎、開心腦、益神智,從而共同延緩AD 的進(jìn)程。本課題組前期研究表明,補(bǔ)腎健脾開心方可有效改善AD 模型大鼠學(xué)習(xí)、記憶、認(rèn)知能力[4],證實(shí)該方可明顯下調(diào)AD 大鼠海馬磷脂酰肌醇3 激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)、蛋白激酶B(protein kinase B, Akt)的表達(dá)[5-6],影響腦皮質(zhì)區(qū)凋亡[7]。但補(bǔ)腎健脾開心方能否通過調(diào)控自噬緩解AD 進(jìn)展,方中何種治法影響自噬和凋亡尚不明確。D-gal 干預(yù)可造成大鼠腦部Aβ、Tau 蛋白的異常表達(dá)、神經(jīng)元損傷[8]。本實(shí)驗(yàn)旨在通過D-半乳糖(D-galactose, D-gal)誘導(dǎo)AD 模型探討補(bǔ)腎健脾開心方是否影響自噬及凋亡,并探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

70 只SPF級雄性SD 大鼠,3 月齡,體重(220±20)g,購于遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司[SCXK(遼)2020-0001],飼養(yǎng)于湖北中醫(yī)藥大學(xué)SPF 級實(shí)驗(yàn)動物中心實(shí)驗(yàn)室[SYXK(鄂)2022-0067],環(huán)境溫度(23±2)℃,濕度(55%±5%),12 h 循環(huán)照明。用Morris 水迷宮測試其學(xué)習(xí)記憶能力,淘汰反應(yīng)過于遲鈍及特別敏感的大鼠4 只,自由攝食、飲水,適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后開始實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)獲得湖北中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會批準(zhǔn) ( HUCMS(00137435))。本實(shí)驗(yàn)中,動物飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)過程均做到了按照實(shí)驗(yàn)動物使用的3R 原則給予人文關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

補(bǔ)腎健脾開心方由熟地20 g、山藥20 g、山茱萸20 g、人參10 g、茯苓15 g、遠(yuǎn)志6 g、石菖蒲20 g 組成;補(bǔ)腎方由熟地20 g、山茱萸20 g 組成;健脾方由山藥20 g、人參10 g、茯苓15 g 組成;開心方由遠(yuǎn)志6 g、石菖蒲20 g 組成。藥物均采購于湖北中醫(yī)藥大學(xué)附屬國醫(yī)堂,經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學(xué)生藥教研室鑒定為純正藥材。常規(guī)煎煮之后,分裝備用。

D-半乳糖(美國Sigma 公司,批號:G0750);4%多聚甲醛(中國索萊寶公司,批號:P1110);二甲苯(國藥集團(tuán),批號:10023418);檸檬酸(上海滬試公司,批號:10007118);BSA(北京夏末科技有限公司,批號:DX6608);一抗兔抗大鼠LC3(武漢Bioss 公司,批號:bs-2912R);一抗兔抗大鼠Beclin1(武漢Bioswamp 公司,批號:PAB35215);一抗兔抗大鼠BAX(武漢Bioswamp 公司,批號:PAB37588);一抗兔抗大鼠 Bcl-2 (武漢 Bioswamp 公司, 批號:PAB33926);二抗山羊抗兔(武漢三鷹生物技術(shù)開發(fā)公司,批號:SA00013-4); cDNA 合成試劑盒(北京夏末公司,批號:SUM73061)。

Morris 水迷宮數(shù)據(jù)自動采集系統(tǒng)(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所);曠場實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司);DYY-6C 型電泳儀(北京市六一儀器廠);TKD-TSF 自動組織脫水機(jī)(湖北康強(qiáng)醫(yī)療器械有限公司);電轉(zhuǎn)儀(美國Bio-Rad 公司);BRM2235 自動切片機(jī)(德國徠卡顯微系統(tǒng)有限公司);TB-718D 生物組織包埋機(jī)(泰維科技);DM1000 正置顯微鏡(德國徠卡顯微系統(tǒng)有限公司);DMIL LED 倒置顯微鏡(德國徠卡顯微系統(tǒng)有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 造模

動物適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后,參照《藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)》[9]建立D-gal 大鼠AD 模型:將15 g 的D-gal 溶于500 mL 的0.9%生理鹽水,配成30 mg/mL 質(zhì)量濃度的溶液,按300 mg/kg 劑量進(jìn)行腹腔注射。同時隨機(jī)取10 只大鼠為空白組(Ctrl 組),注射等容積生理鹽水,每日1 次,持續(xù)6 周。

1.3.2 分組與給藥

取造模成功的50 只大鼠參照隨機(jī)數(shù)字表分為5 組:模型組(AD 組)、補(bǔ)腎組(BS 組,3.6 g/(kg·d))、健脾組(JP 組,4.05 g/(kg·d))、開心組(KX組,2.34 g/(kg·d))、補(bǔ)腎健脾開心組(BSJPKX組,9.99 g/(kg·d)),每組10 只。BS 組、JP 組、KX組、BSJPKX 組分別以相應(yīng)藥物灌胃,空白組、模型組給予等容積生理鹽水,每日1 次,給藥4 周。

1.3.3 Morris 水迷宮測試

定位航行測試為實(shí)驗(yàn)前1~5 d:記錄大鼠從不同象限入水到爬上平臺并停留超過10 s 所需的時間(即逃避潛伏期),連續(xù)5 d,每次測試120 s。空間搜索實(shí)驗(yàn)為第6 天:第6 天撤除平臺,記錄動物跨越原平臺的次數(shù),測試時長120 s。

1.3.4 曠場實(shí)驗(yàn)

水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后1 d,將單只大鼠放置于曠場實(shí)驗(yàn)生物數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)箱中心區(qū)域,記錄其自由活動情況,記錄時間為6 min,記錄內(nèi)容主要為其運(yùn)動距離和中心區(qū)域的運(yùn)動時間。

1.3.5 蛋白印跡法(Western blot)

行為學(xué)測試結(jié)束,麻醉大鼠,每組取3 只生理鹽水心臟灌注,將腦皮質(zhì)組織于冰上迅速取樣,約20 mg,剪碎后加入裂解液勻漿,12 000 r/min,4℃,離心15 min 取其上清。各組樣品蛋白濃度通過BCA法(bicinchoninic acid)測定后將其調(diào)為一致濃度。經(jīng)10% SDS 聚丙烯酰胺(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)凝膠電泳分離,聚偏二氟乙烯膜轉(zhuǎn)膜,5%脫脂奶粉于室溫封閉1.5 h。分別加入一抗(β-actin:1 ∶500,Beclin1:1 ∶1000,LC3:1 ∶1000)4℃孵育過夜。次日滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1 ∶10 000)37℃孵育1.5 h。加入增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑顯色底物后,按常規(guī)X 線片顯影方法顯影。Image J 圖像分析軟件對樣品條帶的灰度值進(jìn)行數(shù)字化分析。以β-actin 為內(nèi)參蛋白。

1.3.6 免疫組化

行為學(xué)測試結(jié)束,麻醉大鼠,每組取3 只多聚甲醛心臟灌注,取腦皮質(zhì)組織,石蠟包埋切片(厚度4 μm)。免疫組織化學(xué)染色檢測腦皮質(zhì)B 淋巴細(xì)胞瘤-2(B 淋巴細(xì)胞瘤-2,Bcl-2)、BCL2-Associated X的蛋白質(zhì)(Bax)的表達(dá),組織中棕黃色或棕褐色顆粒為目標(biāo)蛋白。石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度酒精水化、檸檬酸抗原修復(fù)、0.5%牛血清白蛋白(bovine albumin, BSA)濕盒孵育30 min 后,Bax 抗體(1 ∶100)、Bcl-2 抗體(1 ∶200)滴加覆蓋組織塊,4℃孵育12 h,二抗孵育30 min,再經(jīng)DAB 染色、蘇木素復(fù)染、脫水、樹脂封片后,顯微鏡采集圖像。每張片子隨機(jī)選取3 個視野(×200),采用Image J 軟件分析光密度,取其平均值。

1.3.7 實(shí)時熒光定量PCR(qRT-PCR)

行為學(xué)測試結(jié)束,每組隨機(jī)取7 只大鼠斷頭處死,冰上迅速取腦皮質(zhì)組織,使用TRIzol 試劑從腦組織中提取總RNA。用cDNA 合成試劑盒從1 μg總RNA 中合成cDNA。采用SYBR qPCR Mix 在Bio-Rad CFX Connect Real-time System 上進(jìn)行實(shí)時定量PCR。qRT-PCR 條件為:95℃,10 min。靶基因的相對表達(dá)以GAPDH 為內(nèi)參進(jìn)行歸一化,以2-ΔΔCT方法計算倍數(shù)變化。使用的引物序列如下:Beclin1正向引物序列(5’ -3’):GAATGGAGGGGTCTAA GGCG 和反向引物序列(5’-3’):CTTCCTCCTGG CTCTCTCCT;P62 正 向 引 物 序 列(5’ - 3’):TCCTGCAGACCAAGAACTATGACATCG 和反向引物序 列( 5’ - 3’): TCTACGCAAGCTTAACACAA CTATGAGACA;Bax正 向 引 物 序 列(5’ - 3’):TTGCTACAGGGTTTCATCC 和反向引物序列(5’-3’):GTCCAGTTCATCGCCAAT;Bcl-2 正向引物序列(5’-3’):CAGAATCAAGTGTTCGTCAT 和反向引物序列(5’-3’):AGTCTTCATCTCCAGTATCC;GAPDH正向引物序列(5’-3’):CAAGTTCAA CGGCACAG和 反 向 引 物 序 列 ( 5 ’ - 3 ’): CCAGTA GACTCCACGACAT。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

本實(shí)驗(yàn)采用SPSS 25.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,用Graphpad Prism 8 繪制統(tǒng)計圖。數(shù)據(jù)計算使用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)。符合正態(tài)分布的多組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力比較

如圖1 所示,在定位航行實(shí)驗(yàn)中,逃避潛伏期隨著各實(shí)驗(yàn)動物累積訓(xùn)練時長的不斷增加,其總體趨勢顯示下降。開始訓(xùn)練前2 d,各組實(shí)驗(yàn)動物間逃避潛伏期未見顯著差異(P＞0.05)。與Ctrl 組比較,從第3 天開始,AD 組大鼠逃避潛伏期明顯延長(P＜0.01)。與AD 組比較,如圖1 所示從第3 天開始至實(shí)驗(yàn)結(jié)束,BS 組、JP 組、KX 組、BSJPKX 組4 組大鼠逃避潛伏期顯著縮短(P＜0.01)。與BSJPKX 組比較,在實(shí)驗(yàn)第3 天與JP 組之間有明顯差異(P＜0.01);在實(shí)驗(yàn)第4、5 天,BS 組、JP 組、KX 組3 組大鼠逃避潛伏期較長,且與之有明顯差異(P＜0.01)。

注:與Ctrl 組比較,**P＜0.01;與AD 組比較, ##P＜0.01;與BSJPKX 組比較, &&P＜0.01。圖1 各組大鼠定位航行實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期(n=10)Note.Compared with Ctrl group, **P＜0.01.Compared with AD group, ##P＜0.01.Compared with BSJPKX group, &&P＜0.01.Figure 1 Incubation period of experimental evasion by positioning navigation for each group of rats

如圖2 所示,在空間探索實(shí)驗(yàn)中,與Ctrl 組比較,AD 組大鼠在水池中隱藏平臺撤除后,找到并穿越原平臺象限的次數(shù)明顯減少(P＜0.01);與AD 組比較,BS 組、JP 組、KX 組、BSJPKX 組跨越原平臺次數(shù)明顯升高(P＜0.01);與BSJPKX 組比較,BS 組找到并穿越原平臺象限的次數(shù)與之有明顯差異(P＜0.01),JP 組、KX 組找到并穿越原平臺象限的次數(shù)與之無明顯差異(P＞0.05)。

注:與Ctrl 組比較,**P＜0.01;與AD 組比較,##P＜0.01;與BSJPKX組比較,&&P＜0.01。圖2 各組大鼠空間探索實(shí)驗(yàn)跨越平臺次數(shù)(n=10)Note.Compared with Ctrl group, **P＜0.01.Compared with AD group,# #P＜0.01.Compared with BSJPKX group,&&P＜0.01.Figure 2 Number of spatial exploration experiments across platforms for each group of rats

2.2 各組大鼠認(rèn)知功能比較

如圖3 所示,與Ctrl 比較,發(fā)現(xiàn)AD 組大鼠其曠場實(shí)驗(yàn)測試數(shù)據(jù)中總運(yùn)動距離以及大鼠于中心區(qū)域運(yùn)動時間的比率明顯下降(P＜0.01)。與AD 組比較,BS 組、JP 組、KX 組、BSJPKX 組各組大鼠曠場實(shí)驗(yàn)測試數(shù)據(jù)中運(yùn)動距離和中心區(qū)域運(yùn)動時間比率上調(diào)(P＜0.05)。與BSJPKX 組比較,BS 組大鼠曠場實(shí)驗(yàn)測試數(shù)據(jù)中運(yùn)動距離和中心區(qū)域運(yùn)動時間比率無明顯差異(P＞0.05);JP 組大鼠運(yùn)動距離和中心區(qū)域運(yùn)動時間比率有明顯差異(P＜0.01);KX 組大鼠運(yùn)動距離有明顯差異(P＜0.05),中心區(qū)域運(yùn)動時間比率無明顯差異(P＞0.05)。

注:與Ctrl 組比較,**P＜0.01;與AD 組比較,#P＜0.05,##P＜0.01;與BSJPKX 組比較,&P＜0.05,&&P＜0.01。圖3 各組大鼠曠場試驗(yàn)比較(n=4)Note.Compared with Ctrl group,**P＜0.01.Compared with AD group,# P＜0.05,##P＜0.01.Compared with BSJPKX group,& P＜0.05,&&P＜0.01.Figure 3 Comparison of open-field tests for each group of rats

2.3 各組大鼠腦皮質(zhì)Beclin1、LC3-I、LC3-II 蛋白表達(dá)比較

如圖4 所示,與Ctrl 組相比,AD 組Beclin1、LC3-I/LC3-II 比值顯著下調(diào)(P＜0.01)。與AD 組比較,BS 組、JP 組Beclin1 上調(diào)(P＜0.01),LC3-I/LC3-II 比值無明顯回升(P＞0.05);KX 組、BSJPKX 組Beclin1、LC3-I/LC3-II 比 值 增 加(P＜0.01)。與BSJPKX 組比較,BS 組、JP 組、KX 組Beclin1、LC3-I/LC3-II 比值表達(dá)量有明顯差異(P＜0.01)。

2.4 各組大鼠腦皮質(zhì)Bax、Bcl-2 蛋白表達(dá)比較

如圖5 所示,與Ctrl 組相比,AD 組Bax 增多(P＜0.01),Bcl-2 及Bcl-2/Bax 比 值 明 顯 降 低(P＜0.01)。與AD 組比較,BS 組、JP 組、KX 組、BSJPKX組Bax 下調(diào)(P＜0.01),Bcl-2 及Bcl-2/Bax 比值上調(diào)(P＜0.01)。與BSJPKX 組比較,BS 組Bax、Bcl-2 及Bcl-2/Bax 比值無明顯差異(P＞0.05);JP 組Bax、Bcl-2 及Bcl-2/Bax 比值有明顯變化(P＜0.01);KX組Bax 無明顯差異(P＞0.05),Bcl-2 及Bcl-2/Bax 比值有顯著差異(P＜0.01)。

2.5 各組大鼠腦皮質(zhì)Beclin1、P62、Bax、Bcl-2 基因表達(dá)比較

如圖6 所示,與Ctrl 組相比,AD 組Beclin1、Bcl-2 明顯降低(P＜0.01),P62、Bax增多(P＜0.01)。與AD 組比較,BS 組、JP 組、KX 組、BSJPKX 組Beclin1、Bcl-2 比值上調(diào)(P＜0.05),P62、Bax下調(diào)(P＜0.05)。與BSJPKX 組比較,BS 組Beclin1、Bax、Bcl-2 無明顯差異(P＞0.05),P62 有明顯差異(P＜0.05);JP 組Beclin1 無明顯差異(P＞0.05),P62、Bax、Bcl-2 有明顯變化(P＜0.05);KX 組Beclin1、P62 無明顯差異(P＞0.05),Bax、Bcl-2 有明顯差異(P＜0.01)。

注:與Ctrl 組比較,**P＜0.01;與AD 組比較,#P＜0.05,##P＜0.01;與BSJPKX 組比較,&P＜0.05,&&P＜0.01。圖6 各組AD 大鼠腦皮質(zhì)Beclin1、P62、Bax、Bcl-2 mRNA 水平(n=7)Note.Compared with Ctrl group,**P＜0.01.Compared with AD group, #P＜0.05,##P＜0.01.Compared with BSJPKX group, &P＜0.05,&&P＜0.01.Figure 6 Cortical relative mRNA levels of Beclin1, P62, Bax and Bcl-2 in AD rats of all groups

3 討論

AD 目前治療方法有限,多數(shù)為緩解其臨床癥狀,延緩病理進(jìn)展。中醫(yī)藥防治AD 有其獨(dú)特的優(yōu)勢,多種單藥提取物或多藥聯(lián)合運(yùn)用可以延緩AD病理進(jìn)展,防治癡呆[10-12]。本課題組從《本草綱目》益智及輕身延年藥物中發(fā)現(xiàn),歸心、脾、腎三經(jīng)的藥物占重要比例。選取其中開心散的組成藥物石菖蒲、遠(yuǎn)志、人參、茯苓及六味地黃丸三補(bǔ)藥物熟地、山藥、山茱萸組成自擬方,依據(jù)其功效取名為補(bǔ)腎健脾開心方。石菖蒲補(bǔ)腎健腦益智開竅,遠(yuǎn)志補(bǔ)腎通心,人參補(bǔ)五臟首入脾,茯苓補(bǔ)心通腎,熟地滋陰補(bǔ)腎,山茱萸以補(bǔ)養(yǎng)肝腎,山藥以補(bǔ)益脾陰固腎。補(bǔ)腎健脾開心方,補(bǔ)腎健脾,取先天后天互滋互用,滋脾腎、開心腦、益神智。本課題組前期研究表明,補(bǔ)腎健脾開心方可有效改善AD 模型大鼠學(xué)習(xí)、記憶、認(rèn)知能力[4],證實(shí)該方可明顯下調(diào)AD 大鼠海馬PI3K、Akt 的表達(dá)[5-6],影響腦皮質(zhì)區(qū)凋亡[7]。但本方中何種治法影響自噬和凋亡尚不明確,因此依據(jù)藥物歸經(jīng)及功效,對補(bǔ)腎健脾開心方進(jìn)行拆分,將同歸于肝、腎兩經(jīng)的熟地、山茱萸組成補(bǔ)腎方;將同歸于脾經(jīng)的山藥、人參、茯苓組成健脾方;將同歸于心經(jīng)的遠(yuǎn)志、石菖蒲組成開心方,以觀察補(bǔ)腎、健脾、益智治法及補(bǔ)腎健脾開心方全方對AD 的治療作用,并探討其可能的作用機(jī)制。

細(xì)胞凋亡和自噬是維持生物體穩(wěn)態(tài)和促進(jìn)生存的重要細(xì)胞內(nèi)過程。細(xì)胞凋亡和自噬的不平衡與神經(jīng)退行性疾病有關(guān)[13]?；謴?fù)自噬和細(xì)胞凋亡之間的平衡是治療AD 的有希望的策略?，F(xiàn)代研究表明,補(bǔ)腎健脾開心方中多味藥物的活性成分可影響細(xì)胞自噬、抑制凋亡[14-17],但是目前尚未有報道研究補(bǔ)腎健脾開心方全方合用及其拆方對腦皮質(zhì)區(qū)自噬及凋亡的影響。本研究利用D-gal 誘導(dǎo)的AD 大鼠模型,研究補(bǔ)腎健脾開心方對AD 的作用及其機(jī)制。結(jié)果表明,AD 組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力明顯下降,微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3II(LC3-II)、Beclin1、Bcl-2 表達(dá)減少,Bax 表達(dá)增加,提示AD 大鼠模型建立成功。

自噬是由溶酶體介導(dǎo),可以清除細(xì)胞內(nèi)異常折疊的蛋白質(zhì)和衰老或受損的細(xì)胞器,從而維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的一個高度保守的分解過程,[18]。AD 動物模型研究發(fā)現(xiàn),自噬可以清除神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)Aβ 沉積和可溶性Tau 蛋白以及NFTs 聚合物[19]。LC3 被廣泛用于監(jiān)測自噬。在自噬開始時,LC3-I 轉(zhuǎn)化為LC3-II,并且LC3-II 隨著自噬的進(jìn)展而消失,LC3-II的數(shù)量與自噬囊體的數(shù)量明顯相關(guān)[20]。此外,自噬誘導(dǎo)的一個關(guān)鍵因素是Beclin1 蛋白,亦在自噬的啟動中起著核心作用[21]。本研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎健脾開心方可明顯提高AD 大鼠腦皮質(zhì)區(qū)LC3-II、Beclin1 表達(dá),提示補(bǔ)腎健脾開心方可能通過激活腦神經(jīng)元細(xì)胞自噬,緩解D-gal 誘導(dǎo)的AD 大鼠減輕學(xué)習(xí)記憶能力障礙和認(rèn)知行為缺陷。拆方實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,開心組較補(bǔ)腎組及健脾組更明顯地激活自噬,提示補(bǔ)腎健脾開心方中對影響細(xì)胞自噬起重要作用的藥物可能為遠(yuǎn)志和石菖蒲。

細(xì)胞凋亡涉及到多種分子和細(xì)胞機(jī)制,是細(xì)胞死亡的機(jī)制之一[22]。在AD 早期階段發(fā)現(xiàn)了神經(jīng)元凋亡,并且在AD 患者的尸檢中也顯示出大量腦凋亡神經(jīng)元[23-25]。Bcl-2、Bax 是一對經(jīng)典的凋亡靶蛋白,二者在被激活或抑制的不同情況下發(fā)揮其相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)。具體來說,Bax 增強(qiáng)線粒體的通透性,激活細(xì)胞凋亡;Bcl-2 通過結(jié)合Bax 形成復(fù)合物,降低Bax 誘導(dǎo)的線粒體通透性,抑制細(xì)胞凋亡[23]。因此,Bcl-2/Bax 值的動態(tài)改變反映細(xì)胞凋亡狀態(tài)變化,若Bcl-2/Bax 值增大,則表明細(xì)胞凋亡的抑制作用明顯;反之,則促進(jìn)凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎健脾開心方可明顯逆轉(zhuǎn)Bcl-2、Bax 水平的失調(diào),引發(fā)Bcl-2/Bax 值變化,提示補(bǔ)腎健脾開心方可以抑制AD 大鼠腦皮質(zhì)區(qū)細(xì)胞凋亡。此外,拆方實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,補(bǔ)腎組較健脾組及開心組更明顯地抑制凋亡,提示補(bǔ)腎健脾開心方中對影響細(xì)胞凋亡起重要作用的藥物可能為熟地和山茱萸。

自噬和凋亡在發(fā)育和細(xì)胞穩(wěn)態(tài)中起重要作用[25]。異常的自噬和凋亡是神經(jīng)元細(xì)胞損傷的先決條件因素[26]。因此,保持自噬和細(xì)胞凋亡之間的平衡對于細(xì)胞至關(guān)重要,特別是對于神經(jīng)元等細(xì)胞。研究表明自噬和細(xì)胞凋亡之間存在相互作用的分子機(jī)制,如Bcl-2[13]。Bcl-2 是一種公認(rèn)的抗凋亡因子,通過與Beclin1 結(jié)合來抑制自噬[27]。此外,Bcl-2 可以與Bax 相互作用以抑制細(xì)胞凋亡[28]。Bcl-2 在Ser70 上的磷酸化可破壞Bcl-2-Beclin-1 復(fù)合物以促進(jìn)自噬,并穩(wěn)定Bcl-2-Bax 相互作用以抑制細(xì)胞凋亡[29]。本研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎健脾開心方可明顯促進(jìn)Beclin1 和Bcl-2 的表達(dá),抑制Bax,提示補(bǔ)腎健脾開心方可以維持自噬和細(xì)胞凋亡之間的平衡。此外,拆方實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,開心組較補(bǔ)腎組及健脾組更明顯地激活自噬,而補(bǔ)腎組較健脾組及開心組更明顯地抑制凋亡,提示補(bǔ)腎健脾開心方合方使用才是維持細(xì)胞自噬和凋亡平衡的關(guān)鍵。

綜上所述,補(bǔ)腎健脾開心方配伍使用可以明顯改善D-gal 誘導(dǎo)的AD 大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力,其機(jī)制可能與激活神經(jīng)自噬、抑制細(xì)胞凋亡有關(guān)。