陳子杰,毛禹凱,樊 寧,洪燕芬,劉旭陽

0 引言

Wolfram綜合征(Wolfram syndrome,WS)是一種少見的常染色體隱性遺傳性疾病,主要特征是青少年糖尿病(diabetes mellitus,DM)、視神經(jīng)萎縮(optic atrophy,OA)、耳聾(sensorineural hearing loss, D)、尿崩癥(diabetes insipidus, DI),所以又稱為DIDMOAD綜合征。有研究者分析了412例Wolfram綜合征患者的臨床及遺傳學(xué)研究資料,發(fā)現(xiàn)98.2%的患者患有糖尿病,82.1%的患者患有視神經(jīng)萎縮,而出現(xiàn)耳聾或尿崩癥的僅有40%[1]。該病發(fā)病率在不同的種族群體間為1/770000～1/54478[2],前期研究表明與Wolfram綜合征有關(guān)的兩個(gè)致病基因,即位于4p16.1上的WFS1基因和位于4q22-4q24上的CISD2基因。前者編碼wolframin跨膜蛋白,后者則編碼Miner1蛋白[3]。由于Wolfram綜合征起病隱匿,基因型和臨床表型之間的關(guān)聯(lián)尚不完全明確,故當(dāng)前并無針對(duì)性的療法。該病的診斷目前主要依靠臨床表現(xiàn),且利用基因測(cè)序可早期識(shí)別該綜合征,并及時(shí)干預(yù),改善預(yù)后,對(duì)后代的遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷也有重要意義。本研究通過全外顯子組測(cè)序(whole exome sequencing, WES)的方法,討論1個(gè)常染色體隱性遺傳WS家系WFS1基因的復(fù)合雜合變異,并進(jìn)行臨床表型及分子遺傳學(xué)分析。

1 對(duì)象和方法

1.1對(duì)象于2022-12在廈門大學(xué)附屬廈門眼科中心收集一個(gè)2代3例中國家庭成員的Wolfram綜合征家系信息。本研究遵循《赫爾辛基宣言》且通過倫理與道德委員會(huì)批準(zhǔn),所有檢測(cè)方法均征得患者及家屬知情同意并簽署同意書。

1.2方法對(duì)所有患者進(jìn)行詳細(xì)的病史詢問和眼部檢查,包括視力、眼壓、眼底檢查、視野、視覺誘發(fā)電位(VEP)等檢查明確臨床診斷。告知先證者及家屬基因測(cè)序。采取先證者及其母親5mL全血,采取其兄的口腔黏膜。從樣本中獲得基因組DNA,對(duì)先證者進(jìn)行全外顯子組檢測(cè)。利用探針雜交捕獲目標(biāo)基因外顯子及毗鄰剪接區(qū)域,使用高通量測(cè)序儀檢測(cè)。去除不符合條件的內(nèi)容,比對(duì)UCSC提供的hg38版本人類基因體參考序列。通過HaplotypeCaller尋找其中的突變位點(diǎn)。使用xhmm和clamms算法對(duì)探針覆蓋區(qū)進(jìn)行高拷貝數(shù)突變解析。用Polyphen-2,VarSite在線網(wǎng)站分析基因變異引起的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能變化。根據(jù)常染色體隱性遺傳或復(fù)合雜合遺傳模式,篩選家系的外基因組測(cè)序數(shù)據(jù)。過濾后得到同一基因的純合變異體和兩個(gè)或兩個(gè)以上雜合變異體。依據(jù)美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)和基因組學(xué)學(xué)會(huì)(ACMG)遺傳變異分類標(biāo)準(zhǔn)與指南來解釋序列變異部分,獲得該家系的候選基因和變異體的信息[4]。

2 結(jié)果

2.1先證者及其哥哥的臨床檢查結(jié)果先證者,男性,31歲。因“雙眼視力下降5a”就醫(yī)。經(jīng)檢查發(fā)現(xiàn)右眼裸眼視力0.03,矯正視力-5.25DS/-1.00DC×180=0.1;左眼裸眼視力0.04,矯正視力-5.25DS/-1.50DC×180=0.3。右眼瞳孔對(duì)光反應(yīng)略遲鈍。雙眼視盤色白,右眼杯盤比0.9,左眼杯盤比0.8。余雙眼檢查無明顯異常。VEP檢查提示右眼P100潛伏期重度延遲,P100波幅中度降低;左眼P100潛伏期中度延遲,P100波幅中度降低,見圖1。既往史:7歲時(shí)發(fā)現(xiàn)有色弱。25歲配鏡后視力無法矯正到正常水平。30歲于體檢時(shí)發(fā)現(xiàn)血糖10mmol/L,隨后診斷為糖尿病,服用雙胍類藥物可控制血糖。聽力無異常。

先證者哥哥,39歲。右眼裸眼視力1.0,矯正視力-0.75DC×5=1.0;左眼裸眼視力1.0,矯正視力1.0。右眼杯盤比0.6,左眼杯盤比0.5。VEP檢查提示右眼P100波幅重度降低;左眼P100波幅中度降低。視野檢查發(fā)現(xiàn)右眼平均缺損-4.11dB,左眼平均缺損-4.55dB。余雙眼檢查無明顯異常,見圖1 。既往史:19歲時(shí)感到夜尿多并一直持續(xù)到現(xiàn)在。29歲時(shí)因“多飲、多尿、體質(zhì)量減輕”就醫(yī),診斷為糖尿病,通過服用雙胍類藥物和注射長效胰島素控制血糖。無聽力損傷。

家族史:父親已去世。母親無糖尿病、色弱、視力減退。否認(rèn)近親婚配。

2.2先證者及其哥哥的基因檢測(cè)結(jié)果兄弟二人的WFS1基因8號(hào)外顯子上均發(fā)現(xiàn)兩種雜合變異:c.941G>A(p.W314X)和c.2309T>G(p.F770C)。前者gnomAD東亞人群數(shù)據(jù)庫收錄為0,未有文獻(xiàn)報(bào)道,為新發(fā)現(xiàn)的無義變異;后者已有作者發(fā)現(xiàn)并報(bào)道過WS相關(guān)錯(cuò)義變異[5]。Sanger測(cè)序發(fā)現(xiàn)先證者母親只檢測(cè)到c.2309T>G(p.F770C)變異,另一個(gè)位點(diǎn)為野生型,見圖2。

根據(jù)美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)和基因組學(xué)學(xué)會(huì)(American College of Medical Genetics and Genomics, ACMG)指南,這兩個(gè)變異位點(diǎn)均被認(rèn)為是“意義不明確的”,支持致病性證據(jù)包括:(1)PM2: ESP 數(shù)據(jù)庫、千人數(shù)據(jù)庫、EXAC 數(shù)據(jù)庫中正常對(duì)照人群中未發(fā)現(xiàn)的變異;(2)PP1: 突變與疾病在家系中共分離;(3)PP3: 多種統(tǒng)計(jì)方法預(yù)測(cè)出該變異會(huì)對(duì)基因或基因產(chǎn)物造成有害的影響。

生物信息學(xué)分析:預(yù)測(cè)軟件Mutation Taster預(yù)測(cè)這兩個(gè)變異位點(diǎn)均是致病的。Polyphen-2將p.F770C變異列為“可能具有破壞性”,評(píng)分1.0。第314位的色氨酸殘基保守(不同生物體蛋白序列中保守值=0.8,表明它對(duì)蛋白質(zhì)的功能有重要意義);相比之下第770位的苯丙氨酸殘基相對(duì)保守(不同生物體蛋白序列中保守值=0.7,其改變可能不會(huì)引起蛋白質(zhì)功能明顯改變,圖3)。

3 討論

Wolfram綜合征臨床表現(xiàn)錯(cuò)綜復(fù)雜,主要包括以下幾種:(1)初發(fā)癥狀多為學(xué)齡前期或?qū)W齡期發(fā)生的糖尿病;(2)隨后為學(xué)齡期左右出現(xiàn)的視神經(jīng)萎縮,部分患者可伴色覺障礙;(3)高頻段受累嚴(yán)重的感音性耳聾;(4)中樞性尿崩癥。其他少見的癥狀有:胃腸道不適、部分腺體功能減退如性腺、甲狀腺、智力或發(fā)育遲緩、先天性心臟病等[6]。但并不是所有Wolfram綜合征患者都會(huì)出現(xiàn)這4個(gè)典型表型,或者是表型出現(xiàn)的先后順序不是固定不變的。比如在一項(xiàng)對(duì)8個(gè)純合子的研究報(bào)告中,患者診斷為糖尿病的平均年齡為18歲,而且僅有1例患者出現(xiàn)視神經(jīng)萎縮,或者有報(bào)道部分患者在三十歲左右才被診斷為糖尿病和視神經(jīng)萎縮[7-8]。

本例先證者以色弱、視力下降為首發(fā)癥狀。早期僅診斷為屈光不正,當(dāng)配鏡無法提高視力時(shí)前來就診,經(jīng)檢查診斷為視神經(jīng)病變。其糖尿病由正常體檢時(shí)發(fā)現(xiàn),此前無糖尿病相關(guān)癥狀,服用雙胍類藥物控制穩(wěn)定。其兄以夜尿增多、尿崩癥為首發(fā)癥狀。隨后發(fā)現(xiàn)有糖尿病,使用長效胰島素聯(lián)合雙胍類藥物血糖控制好。多尿表現(xiàn)一直持續(xù)到現(xiàn)在。盡管視力正常,但視覺誘發(fā)電位及視野檢查顯示仍存在視神經(jīng)病變。

兄弟二人無感染性疾病史,無視力急性下降病史,視野無中心暗點(diǎn),眼底視乳頭無充血水腫、無毛細(xì)血管擴(kuò)張,可排除視神經(jīng)炎。眼底檢查記錄未發(fā)現(xiàn)新生血管,未見視網(wǎng)膜微動(dòng)脈瘤及出血滲出,可排除糖尿病導(dǎo)致的眼底及視神經(jīng)的病變?；驒z測(cè)發(fā)現(xiàn)二人的WFS1基因突變,未發(fā)現(xiàn)OPA1基因和線粒體突變,也可排除Leber遺傳性視神經(jīng)病變。因此,根據(jù)二人的基因檢測(cè)結(jié)果,相關(guān)臨床表型,并排除了可能會(huì)出現(xiàn)的其他疾病后,均可以確定為Wolfram綜合征。

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,一些Wolfram綜合征的青少年患者僅表現(xiàn)為糖尿病,并且通常被誤診為1型或2型糖尿病,患者使用一些糖尿病藥物,如胰高血糖素樣肽1受體激動(dòng)劑(GLP-1RAs)和雙胍類藥物,可以緩解胰島細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,延緩糖尿病進(jìn)展[9-10]。這與本文中的2例患者相似。本文2例患者均是在20歲之后被診斷為糖尿病,因此我們認(rèn)為WFS1基因突變導(dǎo)致的糖尿病與傳統(tǒng)的1型糖尿病相比存在一些差異。WS相關(guān)性糖尿病不是由胰島β細(xì)胞功能缺陷引起的,而是由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的β細(xì)胞破壞,突變的wolframin激活胰島β細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)和未折疊蛋白反應(yīng)(UPR),導(dǎo)致細(xì)胞周期進(jìn)展受損和細(xì)胞凋亡[11]。患者通常自身抗體陽性率低,其起病隱匿、臨床表現(xiàn)輕、進(jìn)展慢、不易發(fā)生酮癥酸中毒、急性和慢性并發(fā)癥少,且使用胰島素聯(lián)合口服降糖藥物后控制好,因此WS相關(guān)性糖尿病的表型有時(shí)是非典型的,可能會(huì)被誤診斷為2型糖尿病。所以在出現(xiàn)自身免疫性糖尿病抗體陰性合并其他相關(guān)臨床癥狀時(shí)可以進(jìn)行遺傳學(xué)分析[12]。本文患者的糖尿病表現(xiàn)也和其基因型有關(guān)。在另一項(xiàng)包括82例診斷為1型糖尿病患者的研究中,有4例(4.9%)攜帶WFS1純合或復(fù)合雜合變異,這4例患者除了糖尿病外,沒有出現(xiàn)其他Wolfram綜合征表型;且他們使用雙胍類藥物可以良好的控制血糖,這與本文患者相同[10]。

本文的2例患者目前并沒有出現(xiàn)聽力障礙,這與基因型有關(guān)。一項(xiàng)包含68例Wolfram綜合征患者的研究顯示只有80.89%的患者會(huì)出現(xiàn)聽力障礙,其中有77%的患者出現(xiàn)重度聽力損失,他們是由于WFS1基因第8外顯子或第4外顯子的純合突變導(dǎo)致的;相反,那些聽力正?；蚴艿捷p微影響的人有90%是雜合突變,因此Esteban-Bueno等[13]認(rèn)為純合基因突變的患者更有可能出現(xiàn)聽力損害或聽力缺失更嚴(yán)重。

Wolfram綜合征是由WFS1或CISD2基因變異引起的。前者突變導(dǎo)致Wolfram綜合征1型;后者則導(dǎo)致2型[3],且1型更為多見。WFS1基因位于4p16.1上,由8個(gè)外顯子組成,編碼wolframin蛋白。wolframin蛋白是一種嵌入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白質(zhì),在胰腺β細(xì)胞、心、肺、腦組織中廣泛表達(dá),由于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在蛋白質(zhì)折疊中發(fā)揮重要作用,WFS1中的致病變異導(dǎo)致錯(cuò)誤折疊蛋白的積累,最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[7]。目前已報(bào)道的致病性變異大部分位于WFS1的第8外顯子,因?yàn)樵撏怙@子編碼wolframin蛋白的跨膜和c端結(jié)構(gòu)域,這是該蛋白重要的功能結(jié)構(gòu)[14]。CISD2定位于4q24,由3個(gè)編碼NAF-1蛋白的外顯子組成,編碼Miner1蛋白。

當(dāng)前遺傳學(xué)研究已發(fā)現(xiàn)WFS1中有200多種致病變異,且在WFS1基因中呈不均勻分布。有學(xué)者認(rèn)為疾病出現(xiàn)的時(shí)間、程度、發(fā)展變化可能與基因變異的位置及種類存在關(guān)系。比如錯(cuò)義變異,是由于堿基替換使原氨基酸變?yōu)榱硪环N,導(dǎo)致wolframin蛋白輕微降解,引起的臨床表型較輕;或無義變異,是由于終止密碼子的提前出現(xiàn)而合成不完整的肽鏈以及移碼突變,由于某位點(diǎn)的堿基插入或缺失使下游一串密碼子改變從而合成另一種肽鏈。兩者均可導(dǎo)致wolframin蛋白的完全耗竭,所引起的臨床表現(xiàn)可能較重[15]。日本學(xué)者對(duì) Wolfram 綜合征患者 WFS1 突變的基因型-表型相關(guān)性的研究表明,WFS1 突變可以根據(jù)臨床表型嚴(yán)重程度分為兩組,其中無義突變、移碼突變和/或兩個(gè)等位基因中多個(gè)氨基酸插入/缺失的變異比錯(cuò)義突變和/或兩個(gè)等位基因中單個(gè)氨基酸插入的變異更嚴(yán)重[16]。

本文兄弟二人的WFS1基因上均檢測(cè)到第8號(hào)外顯子存在c.941G>A(p.W314X)和c.2309T>G(p.F770C)雜合變異,通過家系驗(yàn)證符合常染色體隱性遺傳模式。其中c.2309T>G(p.F770C)是已發(fā)表的Wolfram綜合征基因變異,為錯(cuò)義變異。該變異使得原苯丙氨酸突變?yōu)榘腚装彼?導(dǎo)致原蛋白質(zhì)的編碼錯(cuò)誤而使功能缺失。該位點(diǎn)在一個(gè)Wolfram綜合征家系中以復(fù)合雜合的形式被查出,文獻(xiàn)中的患者是存在c.1522_1523delTA(p.Tyr508Cysfs*34)和 c.2309T>G(p.F770C)的復(fù)合雜合突變,且c.2309T>G (p.F770C)也是來自于母親,該患者與本文中的兩位患者在視力、眼底、視覺誘發(fā)電位的表現(xiàn)均相似,比如矯正視力差、VEP波形延遲、輕微視野缺損等,且都沒有聽力損害[5]。本文中的另一個(gè)變異c.941G>A(p.W314X)為新發(fā)現(xiàn)的一個(gè)變異,該變異為一種無義變異,使原色氨酸密碼子變成了終止密碼子,導(dǎo)致多肽鏈的合成到此停止,產(chǎn)生了一條不完整的肽鏈,改變蛋白質(zhì)的功能。查閱有關(guān)文獻(xiàn)并未報(bào)道過這種變異。但有文獻(xiàn)中描述過1例由c.940T>C(p.Trp314Arg)雜合突變導(dǎo)致的Wolfram綜合征。該突變與本文的第二個(gè)突變位點(diǎn)相似,改變的都是第314位的色氨酸。但不同的是,本文患者的突變是由色氨酸密碼子變成了終止密碼子,翻譯終止,而文獻(xiàn)中是由色氨酸突變?yōu)榫彼?下游的密碼子還可以繼續(xù)翻譯。該研究者認(rèn)為p.Trp314Arg這個(gè)改變似乎降低了WFS1抵抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的能力,這可能會(huì)隨著時(shí)間的推移損害β細(xì)胞的功能,導(dǎo)致相對(duì)胰島素不足和糖尿病的發(fā)生[9]。先證者母親只檢測(cè)到c.2309T>G(p.F770C)雜合變異,另一個(gè)位點(diǎn)為野生型。由此可知,兄弟二人的c.2309T>G(p.F770C)雜合變異由其母親傳下來,而c.941G>A(p.W314X)雜合突變可能是由其父親傳下來。該家系中先證者及其哥哥被診斷為Wolfram綜合征,先證者母親為c.2309T>G(p.F770C)雜合攜帶者,臨床表型與基因型共分離。

綜上所述,本研究在一個(gè)常染色體隱性遺傳WS家系中檢測(cè)出WFS1基因的c.941G>A(p.W314X)和c.2309T>G(p.F770C)雜合變異。前者尚未報(bào)道,豐富了WFS1基因變異譜。Wolfram綜合征臨床表現(xiàn)復(fù)雜,診斷較為困難。因此,對(duì)于一些無法查明原因的視神經(jīng)萎縮合并有糖尿病、聽力障礙、尿崩癥等相關(guān)癥狀之一的患者,均應(yīng)該考慮是否為Wolfram綜合征,可做基因檢測(cè)來進(jìn)一步明確診斷。Wolfram綜合征的基因變異對(duì)臨床表現(xiàn)的影響較為復(fù)雜,需要長期的探索研究來找尋它們之間的關(guān)系,為能夠早期的診斷以及治療奠定基礎(chǔ)。